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HIDRÓLISE ÁCIDA E ENZIMÁTICA DO AMIDO

OBJETIVOS

Demonstrar a hidrólise ácida e enzimática do amido.


Evidenciar a hidrólise do polissacarídeo por meio de reações específicas.

RELAÇÃO TEÓRICO-PRÁTICA

Estrutura de carboidratos
Enzimas
FUNDAMENTO

O amido é uma mistura de glucanas que as plantas sintetizam como seu principal alimento
de reserva. É depositado nos cloroplastos das células vegetais como grânulos insolúveis compostos
por α-amilose e amilopectina. A α-amilose é um polímero linear de milhares de unidades de glucose
unidas por ligações glicosídicas α-(14). Já a amilopectina consiste de unidades de glucose unidas
por ligações α-(14), sendo, entretanto, uma molécula ramificada, por possuir ligações α-(16) a
cada 24 a 30 unidades de glucose (Figura 1).
Hidrólise enzimática – As amilases são enzimas que catalisam a hidrólise do amido e estão
amplamente distribuídas na natureza: a α-amilase da saliva e do suco pancreático, a β-amilase do
malte, a -amilase dos fungos, etc. A classificação das amilases é feita de acordo com o seu modo
de ação sobre homoglucanas. As α-amilases são endo-enzimas, isto é, atuam ao acaso e no interior
da molécula, as β- e - amilases são exoenzimas, atuam a partir das extremidades não redutoras do
polímero. A α-amilase, salivar e pancreática, catalisa a hidrolise das ligações glicosídicas α-(14)
da amilose, amilopectina e do glicogênio, produzindo, na clivagem inicial, oligossacarídeos de 6 ou
7 unidades de glucose, que são posteriormente degradados a maltotriose e maltose. A maltose não é
substrato para a enzima. A glucose pode aparecer entre os produtos finais da reação, desde que o
tempo de ação da enzima sobre as glucanas seja prolongado.
Hidrólise ácida – Em presença de ácidos fortes e sob aquecimento a 100ºC, as ligações
glicosídicas podem ser hidrolisadas. O ácido a quente hidrolisa tanto as ligações α-(14) como α-
(16). Em função do tempo de hidrólise são encontrados como produtos intermediários dextrinas e
oligossacarídeos, sendo a glucose o produto final da hidrólise final.

Figura 1 – Representação de um segmento da cadeia da amilose (A) e de amilopectina (B).

Acompanhamento da hidrólise do polissacarídeo por meio de reações específicas

Reação com iodo – a reação com iodo é utilizada para a pesquisa do amido, que forma com
ele um complexo colorido. A amilose dá origem a uma coloração negro-azulada, enquanto a
amilopectina dá origem a uma coloração vermelho-violácea. Em função do tempo de hidrólise são
encontrados como produtos intermediários dextrinas e oligossacarídeos, sendo a glucose o produto
final da hidrólise ácida. As dextrinas, dependendo do seu tamanho e complexidade molecular,
desenvolvem diferentes colorações com o iodo: as dextrinas maiores podem desenvolver cor azul
ou púrpura, as de tamanho intermediário dão coloração avermelhada e as menores não desenvolvem
cor em presença de iodo.

Dosagem de açúcares redutores pelo método do 3,5 dinitrosalicilato (DNS) – durante a


hidrólise do amido são liberadas unidades de glucose que, em meio fortemente alcalino e a quente,
formam enedióis. Estes, por sua vez, podem ceder elétrons para reduzir o reagente 3,5-
dinitrosalicilato (de cor amarelo forte) a 3-amino-5-nitrosalicilato (de cor laranja-marrom forte).
Cada mol de açúcar redutor presente na solução formará 1 mol de 3-amino-5-nitrosalicilato. Pela
determinação da luz absorvida a 540 nm pelo 3-amino-5-nitrosalicilato, é possível determinar a
concentração de açúcar redutor presente na solução. A sensibilidade da técnica de determinação de
açúcar redutor pelo DNS é de 0,2 mg a 2,0 mg de glucose.

Figura 2 – Reação do 3,5-dinitrosalicilato (DNS) para evidenciar a presença de açúcares redutores

TÉCNICA

I – HIDRÓLISE ÁCIDA DO AMIDO


Acompanhe os procedimentos representados na Figura 3
1– Colocar 5 ml da solução de amido em um tubo de ensaio e levá-lo a um banho-maria
fervente. Deixar 5 minutos para homogeneizar a temperatura.
2 – Adicionar ao tubo 0,2 ml de ácido clorídrico concentrado, misturar e imediatamente
retirar 0,4 ml, que deverão ser transferidos para outros dois tubos (0,2 ml em cada) para a realização
do teste do iodo e de açúcares redutores (este é o TEMPO ZERO da reação).
3 – Nos tempos de 5, 10, 15 e 20 minutos, retirar alíquotas de 0,4 ml, que deverão ser
transferidos para outros dois tubos (0,2 ml em cada). Após cada coleta, realize imediatamente os
TESTES DO IODO e de AÇÚCARES REDUTORES, como descrito abaixo.

TESTE DO IODO: Em um dos tubos contendo 0,2 ml da amostra coletada adicione 1 gota
de lugol e 5 ml de água destilada
DOSAGEM DE AÇÚCARES REDUTORES: No outro tubo contendo 0,2 ml coletados
adicione 1,3 ml de água destilada e 1,0 ml do reativo DNS.
Após a coleta da última alíquota (tempo de 20 minutos), executar os procedimentos
abaixo para todas as alíquotas coletadas para dosagem de açúcares redutores.
4 – Levar os tubos correspondentes aos tempos zero, cinco, dez, quinze e vinte minutos ao
banho-maria fervente por 5 minutos.
5 – Resfriar os tubos por 5 minutos e adicionar, a cada tubo, 5 ml de água destilada.

II – HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO


Acompanhe os procedimentos representados na Figura 3
1- Colocar 5 ml da solução de amido a 1% (p/v) em um tubo de ensaio e levá-lo a um
banho-maria a 37ºC. Deixar durante 5 minutos para homogeneizar a temperatura.

Durante este tempo, proceda a diluição da saliva com água


destilada: 1:2, 1:20 ou 1:50.
A saliva deverá ser coletada de vários indivíduos.

2 – Adicionar à solução de amido (37ºC) 0,2 ml da solução de saliva diluída, agitar e retirar
imediatamente 0,4 ml, que deverão ser transferidos para outros dois tubos (0,2 ml em cada) para a
realização dos testes do iodo e de açúcares redutores (este é o TEMPO ZERO da reação).
Imediatamente após a retirada das alíquotas, recolocar o tubo de hidrólise no banho 37ºC. Este
procedimento de coleta deverá ser repetido nos tempos de 5, 10, 15 e 20 minutos de hidrólise. Após
cada coleta, realize imediatamente os testes do iodo e de açúcares redutores como descrito
abaixo:
TESTE DO IODO: Em um dos tubos contendo 0,2 ml da amostra coletada adicione 1 gota
de lugol e 5 ml de água destilada

DOSAGEM DE AÇÚCARES REDUTORES: No outro tubo contendo 0,2 ml coletados


adicione 1,3 ml de água destilada e 1,0 ml do reativo DNS.
Após a coleta da última alíquota (tempo de 20 minutos), executar os procedimentos
abaixo para todas as alíquotas coletadas para dosagem de açúcares redutores.
3 – Levar os tubos correspondentes aos tempos zero, cinco, dez e vinte minutos ao banho-
maria fervente por 5 minutos.
4 – Resfriar os tubos por 5 minutos e adicionar, a cada tubo, 5 ml de água destilada.

1 gota de lugol
5 ml de água destilada

Figura 3 – Representação esquemática dos procedimentos técnicos de hidrólise ácida e enzimática do amido.
EXERCÍCIOS

1 – Com relação à natureza dos produtos de hidrólise, diferenciar a ação de um ácido mineral e da
α-amilase salivar sobre o amido.

2 - Em que se fundamenta o método do 3,5-dinitrosalicilato para a dosagem de açúcares redutores?

3 – Explicar os resultados obtidos nas hidrólises ácida e enzimática do amido, em função da


evolução das cores obtidas (zero, 5, 10, 15 e 20 minutos) com o iodo.

4 – Supondo que a hidrólise ácida mineral do amido fosse parcial a ponto de permitir o isolamento
preferencial de dissacarídeos, qual seria a estrutura destes dissacarídeos (tipos de ligações
glicosídicas)? Obs: recordar que o amido é constituído de dois tipos de polissacarídeos.

INFORMAÇÕES COMPLEMENTARES

LISTA DE REATIVOS:
1 – Solução de amido 1% (p/v)
2 – HCl concentrado
3 – Solução de saliva
4 – Solução de lugol
5 – Reativo do 3,5-dinitrosalicilato (DNS)

PREPARO DOS REATIVOS:


1- Solução de amido 1% (p/v)
Suspender 1 g de amido em 20 ml de água destilada fria, adicionar, com agitação, 70 ml de água
destilada fervente. Deixar esfriar e completar o volume para 100 ml.

2- Solução de lugol
Pesar 1 g de iodo, 5 g de iodeto de potássio e dissolver em 100 ml de água destilada.

3 – Reativo de 3,5-dinitrosalicilato (DNS)


Dissolver, com aquecimento, 5 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico em 100 ml de NaOH 2 mol/L.
Separadamente, dissolver, também com aquecimento, 150 g de tartarato duplo de sódio e potássio
em 250 ml de água destilada. Misturar as duas soluções e completar o volume para 500 ml com
água destilada.

INFORMAÇÕES SOBRE OS REAGENTES:

1) 3,5-dinitrosalicilato (DNS)
MM: 228,116 g/mol
Fórmula molecular:C7H4N2O7
Estrutura: