FRACIONAMENTO DAS PROTEÍNAS DO LEITE E SUA DOSAGEM PELO MÉTODO

DO BIURETO

OBJETIVO

Apresentar um exemplo da aplicação prática da espectrofotometria.

RELAÇÃO TEÓRICO-PRÁTICA

Proteínas: estrutura e função

FUNDAMENTO

O leite contém três proteínas importantes: caseína, lactoalbumina e lactoglobulina, todas

com alto teor de aminoácidos essenciais, e em proporções relativas que variam nas espécies
animais. A caseína constitui cerca de 85% das proteínas totais no leite bovino e cerca de 40% das
proteínas totais no leite humano. O termo caseína se aplica a um grupo heterogêneo de proteínas
que contém grupos de fosfoserina, cuja função é ligar cálcio. Estas proteínas estão presentes no leite
na forma de micelas, ou seja, partículas carregadas formadas por agregados de proteína, cálcio e
outros íons presentes, mas também como proteína globular em solução. Quatro classes de moléculas
diferentes podem ser diferenciadas por sua mobilidade eletroforética: alfa (α); beta (β); gama ( ) e
capa ( ). Lactoglobulina e lactoalbumina também podem ser separadas, por eletroforese, em frações
alfa (α) e beta (β).
Quando ocorre um decréscimo no pH do leite, normalmente 6,6-6,9 para 4,6, ocorre a
precipitação das micelas provavelmente pela perda de cargas negativas importantes para sua
estabilidade em solução. Este processo é conhecido como precipitação isoelétrica da caseína. O
ponto isoelétrico de uma proteína é o pH no qual sua carga líquida é zero; nessa condição, a
interação proteína-proteína é maior, ocasionando a precipitação pela diminuição da solubilidade.
Em condições naturais isto acontece, por exemplo, quando se dá a colonização do leite por
microorganismos e a fermentação da lactose a ácido láctico acidifica o meio, causando a
precipitação da caseína. Em condições controladas, este processo permite a fabricação de coalhadas,
queijos e iogurtes.

TÉCNICA

I – Precipitação isoelétrica da caseína – Proteínas do Filtrado (PF)

1- Transferir 10 ml de leite bovino para um copo de béquer de 50 ml.
2 – Adicionar 10 ml de água destilada morna.
 3 – Com uma pipeta de 2 ml, acrescentar solução de ácido clorídrico 2%, gota a gota e com
agitação constante, até que se observe a coagulação do leite.
4 – Anotar o volume de ácido adicionado.
5 – Aguardar a sedimentação do precipitado e filtrar o sobrenadante.

A concentração de proteínas do filtrado deverá ser determinada

pelo método do Biureto, como descrito no item III

II – Proteínas totais (PT)

1 – Diluir 0,5 ml de leite bovino em 9,5 ml de água destilada.
A concentração de proteínas totais deverá ser determinada pelo
método do Biureto, como descrito no item III

III- Determinação da concentração das proteínas do filtrado (PF) e das proteínas totais (PT) pelo
método do biureto

Determinar a concentração de proteínas, como especificado na tabela abaixo:

REAGENTES (ml) Tubo 1 Tubo 2 Tubo PF Tubo PT

Água destilada 1,0 0,4 - -
Solução-padrão de proteína (5 mg/ml) - 0,6 - -
Filtrado - - 1,0 -
Leite total diluído - - - 1,0
Reativo do biureto 5,0 5,0 5,0 5,0

1 – Agitar e deixar em repouso por 10 minutos.

2 – Determinar a absorbância em espectrofotômetro (540 nm).
3 – Determinar a concentração de proteína (mg/ml) utilizando a curva de calibração
previamente traçada.
4 – Fazer as correções necessárias tendo em vista as diluições da amostra.
5 – Expressar o resultado em gramas de proteína por 100 ml de leite (g%).
6 – Calcular a porcentagem de caseína do leite total.

EXERCÍCIO
1 – Para a dosagem de proteínas do leite utilizou-se 1 ml do mesmo diluído 1:20. A
absorbância desta alíquota (devidamente tratada com o reativo de biureto), determinada em
espectrofotômetro a 540 nm, foi de 0,04. Utilizando a curva de calibração obtida no laboratório
durante a aula prática, calcule a concentração de proteínas totais em gramas por 100 ml de leite
puro.