PRÁTICA 2

EFEITO DAS PROTEASES DE DIFERENTES FONTES NA COAGULAÇÃO

DO LEITE;

1. INTRODUÇÃO

A coagulação do leite é a etapa fundamental para a elaboração de queijos. Para isso,

normalmente, faz-se uso de enzimas coagulantes, que dependendo de sua origem,
apresentam composições enzimáticas diferenciadas, tanto em quantidade (proporção das
enzimas), quanto em qualidade (tipo de enzima). As enzimas utilizadas podem ser
oriundas de animais, vegetais e/ou de microrganismos, que podem ser usadas
isoladamente ou misturadas entre si. Esta mistura de enzimas pode proporcionar, entre
outros efeitos, um ajuste de taxa de proteólise durante a maturação, a um nível desejável.
O agente coagulante convencional utilizado na produção de queijos é o coalho de
bezerro, que é extraído do quarto estômago de bezerros em lactação (YOUSIF et al.,
1996). Este coalho é composto pelas enzimas quimosina e pepsina, em proporção de cerca
de 85-95% de quimosina para 5-15% de pepsina. A demanda de estômagos de bezerro
para a extração de coalho é muito elevada, o que se torna um fator que dificulta a
produção, devido não só ao alto custo, mas também à escassez da matéria-prima
(USTUNOL & HICKS, 1990). Um importante fator a ser considerado com relação ao
coagulante utilizado diz respeito ao seu efeito sobre o rendimento e sobre as
características sensoriais do queijo, como sabor e textura, sendo a atividade proteolítica
das enzimas quem exerce grande influência nesses fatores. Além da ligação Phe105-
Met106 na κ-caseína, cuja hidrólise determina a coagulação enzimática do leite, outras
ligações peptídicas são hidrolisadas a taxas que variam de acordo com a enzima utilizada
(atividade proteolítica não específica). As enzimas coagulantes variam amplamente com
respeito à atividade proteolítica, e algumas são tão ativas a ponto de não ser possível o
seu aproveitamento para a produção de queijos duros. Geralmente, os coalhos
microbianos apresentam maiores atividades proteolíticas que os coalhos de bezerro e
genético (LIMA et al., 1996).
Alguns autores citam que, em decorrência da proteólise não específica em níveis
elevados, pode ocorrer diminuição do rendimento do queijo, bem como alteração em suas
propriedades reológicas e sensoriais. A diminuição do rendimento seria reflexo da perda
de substâncias nitrogenadas e gordura para o soro. A maior taxa de proteólise seria
responsável também pelo desenvolvimento de amargor durante a maturação, além de
modificações indesejáveis na textura do queijo (USTUNOL & HICKS, 1990; EMMONS,
1990; LÓPÉZ et al., 1997). LIMA et al. (1996), estudando o comportamento de diferentes
preparações enzimáticas durante a coagulação do leite, encontraram um aumento na
atividade proteolítica em função do declínio do pH para o coalho microbiano de R. miehei
e coalho de bezerro, não sendo observado o mesmo para o coalho genético, cuja atividade
proteolítica manteve-se praticamente inalterada na faixa de pH estudada (5,6 a 6,8). Ficou
bastante evidente que, na faixa de pH de 5,7 a 6,2, a atividade proteolítica foi bem maior
para o coalho microbiano, o que indicou que este coalho deve causar maior perda no
rendimento em massa coagulada, em decorrência da proteólise não específica, nestes
valores de pH. Em função desta maior taxa de proteólise para o coagulante microbiano
em relação aos coalhos de bezerro e genético, é possível que os queijos maturados, cujos
valores de pH diminuem durante a maturação, apresentem também características
sensoriais distintas, determinadas pelo tipo de enzima utilizada para a coagulação. De
acordo com os dados apresentados anteriormente, o pH parece ter influência no
rendimento da coagulação do leite com diferentes tipos de enzimas.

2. OBJETIVO
Verificar as diferenças no grau de hidrólise alcançado por enzimas de origem vegetal e
animal.

3. MATERIAL
• Algodão
• Pipeta de 10 ml
• Erlenmeyer de 250 ml
• Tubos de ensaio
• Proveta de 200 ml

4. REAGENTES
• CaCl2
• Coalho (renina)
• Água destilada
• Alimento
• Cubos de gelo

5. EQUIPAMENTOS
• Liquidificador
• Banho-maria
• Balança

6.0. PROCEDIMENTO
6.1. OBTENÇÃO DA PAPAÍNA
1) Pese 50g de mamão verde e transfira para o liquidificador;
2) Adicione no liquidificador, 200 ml de água destilada e 3 cubos de gelo. O gelo
diminui a possibilidade da inativação enzimática por desnaturação térmica;
3) Homogenize a amostra a 2500 rotação por minutos.
4) Com auxílio de algodão hidrofóbico filtre o homogeneizado para obtenção de um
extrato homogêneo.

6.2. EFEITO DAS PROTEASES SOBRE AMOSTRA DE LEITE LÍQUIDO

1) Transfira com auxílio de uma pipeta de 9 ml de leite líquido para um erlenmeyer;
2) Adicione 0,45 ml de CaCl2 na amostra de leite para obtenção de uma solução de
leite de 5% de CaCl2.
3) Transfira 3 ml da solução de leite a 0,5% de CaCl2 para três tubos de ensaio;
4) Identifique os tubos com os seguintes códigos: P (Papaína), R (Renina) e Br
(Branco);
5) No tubo identificado como P (Papaína), adicione 1 ml de extrato de mamão verde,
no tubo R (renina) adicione 1 ml de renina e no tubo Br 1 ml de água destilada;
6) Inverta delicadamente os tubos favorecendo uma maior interação entre os
componentes da reação;
7) Submeta os três tubos, ao banho-maria a 35ºC e observe no tempo de 10 e 40
minutos a formação ou não coágulo ou hidrolisado protéico.
7.0. RESULTADO
Observe a formação de coagulo ou não e compare os resultados dos tubos P, R com o
tubo Br (branco). Registre os resultados no quadro abaixo:

Coagulo
Tubos Tempo

SIM NÃO
Leite + renina (R) 10 min
40 min
Leite + papaína (P) 10 min
40 min
Leite + água destilada (Br) 10 min
40 min