Roteiro de Práticas

Bioquímica

Técnico em Agroindústria

Esta apostila é direcionada aos

alunos do terceiro ano de Agroindústria do
IFPR como uma contribuição ao
aprendizado de técnicas químicas
laboratoriais e tem por objetivo facilitar o
acompanhamento das aulas práticas de
laboratório da disciplina acima citada.

Apostila elaborada pela professora Vanessa A. Marcolino

1
 ROTEIRO PARA AULA PRÁTICA
TÍTULO DA AULA PRÁTICA

AÇÃO DA ENZIMA AMILASE SALIVAR (PTIALINA) SOBRE O AMIDO

Curso:
Disciplina:
Professor Responsável: Vanessa
Quantidade Total de Alunos: 20
Quantidade de Grupos: 10
Turno:
Horário de Início da Aula: Horário de Término da Aula:

OBJETIVO

 Observar a hidrólise do carboidrato amido por ação catalítica da enzima

amilase salivar.

MATERIAL E REAGENTES (POR GRUPO)

 Tintura de iodo comercial;

 Água filtrada ou soro fisiológico (cloreto de sódio 0,9%);
 Amido;
 Saliva colhido de aluno voluntario (evitar pessoas que se alimentaram
recentemente).

MATERIAL E REAGENTE GERAL

 Frasco de vidro transparente pequenos ou tubos de ensaio ou copos

descartáveis de café;
 Pipeta Pasteur ou conta-gotas;

ROTEIRO DA AULA

Prepare três tubos de ensaio (frascos de vidro ou copos descartáveis de

café) contendo solução de amido como substrato (dissolva aproximadamente
0,5 g de maisena em 100 mL de água) em seguida, adicione a cada um dos

2
três tubos (conforme apresentado na Tabela 1) 0,5 mL da enzima (solução de
saliva diluída em água na proporção 1:10), misture e incube o frasco na mão
fechada durante 15 a 20 minutos com suaves casuais.

Tabela 1: Substrato e respectivos reagentes a serem adicionados em cada

experimento.
Experimento Substrato Enzima (reagente)
1 2 mL de solução de 0,5 mL de água (Branco)
amido
2 2 mL de solução de 0,5 mL de solução de amilase
amido salivar (1:10)
3 2 mL de solução de 0,5 mL de solução de amilase
amido salivar (1:10) fervida

Decorrido o tempo de incubação, adicionar uma ou duas gotas de tintura

de iodo comercial e agitar.

ATIVIDADE

 Observar e comparar os resultados.

OBSERVAÇÃO
(Quando o Professor for dividir turma, informar neste espaço)

3
 ROTEIRO PARA AULA PRÁTICA
TÍTULO DA AULA PRÁTICA

FORMAÇÃO DE GEL COM DIFERENTES TIPOS DE AMIDOS E EFEITO DA

TEMPERATURA
Curso: Integrado em Agroindústria
Disciplina: Bioquímica de alimentos
Professor Responsável: Vanessa Marcolino
Quantidade Total de Alunos: 20
Quantidade de Grupos: 10
Data da Aula: 02/05
Turno: Matutino
Horário de Início da Aula: 8:20 Horário de Término da Aula: 10:00

OBJETIVO

Verificar os grânulos de amido microscopicamente e fazer a geleificação

dos diferente tipos de amido

MATERIAL E REAGENTES (POR GRUPO)

 3 béqueres de 500mL;

 1 proveta de 250mL;

 Bastão de vidro;

 1 termômetro até 150°C;

 12 copos tipo café

 Placa de aquecimento;

 Balança;

MATERIAL E REAGENTE GERAL

 16 g de amido de: batata, batata doce, mandioca;

ROTEIRO DA AULA

4
 POLISSACARÍDEOS
Os polissacarídeos são largamente usados na tecnologia de alimentos
principalmente pelas propriedades reológicas de suas soluções, sendo
compostos de alto peso molecular formam soluções coloidais em que cada
molécula do polissacarídeo liga grande número de moléculas de água graças
ao alto número de grupos hidroxilas presentes na sua molécula.
Os polissacarídeos também chamados comumente de gomas são
produtos naturais provenientes de vegetais ou são produzidos por
microrganismos por fermentação e mais raramente por modificações
químicas dos produtos naturais.
Basicamente as propriedades importantes dos polissacarídeos para
indústria de alimentos estão ligadas ao seu peso molecular, estruturas e aos
grupos hidroxilas.
Dois polissacarídeos são usados em quantidades apreciáveis na
indústria de alimentos: amido e pectina. Também: Agar, alginato e -
carragenana, são usados como espessantes porém em escala menor.
Outros polissacarídeos entre eles carboximetilcelulose e xantana são
especialmente usados como espessantes não formando géis.
AMIDO
Amido é formado por duas frações: amilose, uma cadeia linear formada
por d-glucopiranoses unidas em -1,4 e amilopectina, cadeia ramificada
formada por cadeias curtas de d-glucopiranose ligadas em -1,4 e unidas
entre si por ligações -1,6. A amilose pode ser obtida na forma cristalina e é
responsável pela cor azul intensa formada quando gotas de uma solução de
iodo são adicionadas à uma solução de amido. A formação de cor se deve à
estrutura helicoidal das cadeias longas de amilose, que envolveriam a
molécula de iodo. Na medida em que o amido é hidrolisado, as cadeias vão
se tornando mais curtas, e a cor azul, em presença de iodo passa a púrpura,
e finalmente não haverá mais formação da cor. O produto final da hidrolise
será apenas d-glucose.

ATIVIDADE

5
 Procedimento

Pese 16 g de amidos de: batata, batata doce e mandioca em béqueres de

500mL. A cada tipo de amido junte 300 mL de água e agitando aqueça em
chapa elétrica retirando e transferindo para copos de geléia 50 mL
aproximadamente de amostra de cada sistema quando as temperaturas
atingirem os seguintes valores:
Amidos Temperatura em °C
Batata 50 70 80 95
Mandioca 50 70 80 95
Batata-doce 50 70 80 95

Durante o aquecimento e agitação observe as mudanças de transparência

e viscosidade de cada amostra. Deixe as amostras resfriar à temperatura
ambiente, cobertas, por 12 horas e examine a rigidez e a transparência de
cada uma.

Análise Microscópica de Amidos

Colocou-se sobre a lâmina microscópica uma gota de lugol diluído. Com

a ponta de um estilete umedecida com lugol diluído, encostou-se no amido a
ser analisado, de maneira a coletar uma pequena quantidade de grãos.
Misturou-se os grãos de amido com o lugol iodado. Cobriu-se a lâmina com a
lamínula e observou-se ao microscópio.
Modelos comparativos

Fig.1. A) Fig. 1. B)

Figura 1: A) Foto do grão de amido de batata. Aumento de 400x (Fonte: das autoras); B) figura
esquemática do grão de batata

6
 Fig. 2.A) Fig.2.B)
Figura 2: A) foto do grão de amido de batata doce. Aumento de 400x; B) figura esquemática
do grão de batata doce;

Fig. 3.A) Fig. 3.B)

Figura 3: A) foto do grão de amido de mandioca. Aumento de 1000 x ; B) figura esquemática
do grão de mandioca

OBSERVAÇÃO
(Quando o Professor for dividir turma, informar neste espaço)

7
 ROTEIRO PARA AULA PRÁTICA
TÍTULO DA AULA PRÁTICA

DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DA CASEÍNA

Curso:
Disciplina:
Professor Responsável: Vanessa
Quantidade Total de Alunos: 20
Quantidade de Grupos: 10
Turno:
Horário de Início da Aula: Horário de Término da Aula:

OBJETIVO

 Reconhecer as proteínas como moléculas eletricamente carregadas

 Analisar a influência do pH sobre a distribuição dessas cargas

MATERIAL E REAGENTES (POR GRUPO)

 Béquer de 250 mL
 Proveta de 100 mL
 Conta-gotas
 Funil e papel de filtro

MATERIAL E REAGENTE GERAL

 Leite
 Solução de ácido acético (CH3COOH) 2M
 Etanol (CH3CH2OH) 95% (v/v)
 Éter etílico (CH3CH2OCH3CH2)

ROTEIRO DA AULA
Os aminoácidos apresentam dois grupos que são passíveis de sofrer
protonação (adição de H) e desprotonação (retirada de H). Observe:

8
 A figura demonstra as etapas de ionização em que podem ser encontrados os
aminoácidos:

1. Forma positivamente carregada.

2. Forma eletricamente neutra. Note que existe uma densidade de carga
negativa e uma densidade de carga positiva sobre a molécula, conferindo
carga total nula. Essa forma também é denominada isoelétrica ou
zwitteriônica.
3. Forma negativamente carregada

Essas formas são encontradas em maior ou menor quantidade dependendo do

pH em que a solução do aminoácido se encontra. Isso porque quanto menor o valor
de pH, maior a concentração de íons H+ em solução e, consequentemente, maior a
prevalência da forma positivamente carregada (1). Em contrapartida, quanto maior o
valor de pH, menor a quantidade de íons H+ em solução, havendo prevalência da
forma negativamente carregada (3). A forma eletricamente neutra (2) só poderá
existir, então, numa condição de pH intermediária à existência predominante da
forma positiva e negativa do aminoácido. Esses valores de pH podem ser facilmente
determinados experimentalmente e também podem ser estendidos às proteínas, ou
seja: as proteínas também apresentam uma distribuição de cargas, que pode ser
alterada em função do pH.
O ponto onde a carga líquida total da molécula de aminoácido ou proteína é nula é
tão importante, que recebeu uma denominação especial. Assim, o valor de pH onde
existe equivalência entre as cargas positivas e negativas da molécula é denominado
PONTO ISOELÉTRICO.
Mas por que o ponto isoelétrico é tão importante??

A solubilidade das proteínas, como veremos mais adiante, depende de vários

fatores. Dentre eles, destaca-se a presença das cargas elétricas ao longo da
molécula. A existência de uma carga positiva ou negativa determina a interação com
o meio aquoso, além de estabelecer um estado de repulsão entre as próprias
moléculas de proteína, aumentando a interação com o solvente e,
consequentemente, favorecendo a solubilidade.
Com vimos, no ponto isoelétrico existe um equilíbrio entre o número de cargas
positivas e negativas, o que gera uma situação em que as forças de repulsão entre
as moléculas de proteína e as forças de interação com o solvente são mínimas.
Assim, as proteínas vão formando aglomerados que, cada vez maiores, tendem a
precipitar.
É importante destacar que essa diminuição de solubilidade varia de proteína para
proteína.
9
 Procedimento experimental: Extração da caseína do leite

1. Aquecer 150ml de água destilada a 38 ºC;

2. Adicionar 50 ml de leite e misturar bem;

3. À solução acima, gotejar a solução de ácido acético, até o aparecimento de

um precipitado abundante (aproximadamente 0,7ml do ácido);

4. Deixar descansando durante, aproximadamente, 20 minutos para

sedimentação da proteína;

5. Separar o sobrenadante por decantação;

6. Ao precipitado, adicionar 20ml de etanol e misturar bem;

7. Filtrar (ou, se possível, centrifugar) e desprezar o filtrado (só interessa o

precipitado);

8. Adicionar, ao precipitado, 5ml de éter etílico e misturar;

9. Decantar o sobrenadante e secar o precipitado (caseína) em papel de filtro.

ATIVIDADE

OBSERVAÇÃO
(Quando o Professor for dividir turma, informar neste espaço)

10
 ROTEIRO PARA AULA PRÁTICA
TÍTULO DA AULA PRÁTICA

PROPRIEDADES GERAIS DAS PROTEÍNAS

Curso:
Disciplina:
Professor Responsável: Vanessa
Quantidade Total de Alunos: 20
Quantidade de Grupos: 10
Turno:
Horário de Início da Aula: Horário de Término da Aula:

OBJETIVO

 Reconhecer as proteínas como moléculas eletricamente carregadas

 Analisar a influência do pH sobre essas cargas
 Reconhecer os grupamentos responsáveis pela solubilidade das proteínas em
água
 Identificar os agentes que podem alterar essa solubilidade

MATERIAL E REAGENTES (POR GRUPO)

 07 Tubos de ensaio
 Pipetas (vidro ou plástica)

MATERIAL E REAGENTE GERAL

a) Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito da força iônica)

 Solução de clara de ovo (pode ser utilizada outra solução de proteína)*
 Solução saturada de sulfato de amônio [(NH4)2SO4]**
 Solução de NaCl
 Água destilada
* Preparo da solução de clara de ovo: 1 volume de clara + 4 volumes de NaCl 1%
** Preparo da solução saturada de (NH4)2SO4:7,7g do sal em 10 ml de água destilada
b) Precipitação por sais de metais pesados e por ácidos fortes
 Solução de proteínas preparada acima
 Solução de (CH3COO)2Pb.3H2O (acetato de chumbo) a 20%
11
  Solução de ácido tricloroacético (CCl3COOH) 10%
 Água destilada
c) Precipitação por ação do calor (desnaturação)
 Solução de proteínas
d) Precipitação das proteínas por solventes orgânicos
 Solução de proteínas
 Etanol (CH3CH2OH) 95% gelado
 Acetona (CH3COCH3) gelada
 Cloreto de sódio (NaCl) sólido
 Água destilada

ROTEIRO DA AULA
Introdução

Vimos no experimento anterior que a solubilidade das proteínas em meio aquoso

deve-se, em grande parte, à distribuição das cargas elétricas ao longo da molécula.
Nesse sentido, se a interação proteína-proteína é grande e a interação proteína -
água é pequena, a proteína tenderá a ser insolúvel.
Uma das maneiras de promover a precipitação de uma proteína é atingir seu ponto
isoelétrico. Porém, existem outros fatores que influem de maneira importante nessa
propriedade física das proteínas, como a ação de ácidos, bases, sais e solventes
orgânicos. Além disso, podemos incluir a temperatura como um agente que pode ser
utilizado para diminuir a solubilidade de uma proteína.
Vamos lá:

Princípios teóricos e procedimento experimental

a) Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito da força iônica)

Quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento da força

iônica do sistema. Assim, quando adicionamos pequenas quantidades de sal a uma
solução contendo proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam a
interagir com as moléculas protéicas, diminuindo a interação entre elas.
Consequentemente, temos um aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso.
as interações proteína - proteína, favorecendo a solubilidade das mesmas. A esse
fenômeno dá-se o nome de "salting-in". Esse efeito, porém, não se estende
indefinidamente. Em condições de elevada força iônica, decorrente da adição de
grandes quantidades de sal, temos o efeito contrário.
O que acontece?
Imagine uma solução aquosa de proteína à qual foi adicionada uma certa
quantidade de sal neutro. A água, que apresenta um grande poder de solvatação,
passa a interagir com as duas espécies: as proteínas e os íons provenientes da

12
dissociação do sal. Porém, as moléculas de água apresentam maior tendência de
solvatação de partículas menores (nesse caso, os íons). As moléculas de água,
ocupadas em sua interação com os íons, "abandonam" a estrutura protéica. Como
consequência, temos: maior interação proteína-proteína, diminuição da solubilidade
em meio aquoso e, consequentemente, precipitação da proteína. A esse fenômeno
de insolubilização da proteína em decorrência de um considerável aumento da força
iônica do meio dá-se o nome de "salting-out".
A precipitação de proteínas pela alta concentração de sais é um processo muito
importante para a separação de misturas complexas de proteínas, uma vez que a
concentração de sal necessária para precipitação é diferente para cada proteína.

a.1 Procedimento

1. Em um tubo de ensaio, colocar 2 ml da solução de proteínas;

2. Adicionar, deixando escorrer pelas paredes do tubo, 2 ml da solução de sulfato
de amônio;
3. Observe.
4. Misture o conteúdo do tubo (por inversão) e anote os resultados.
5. Repita as etapas anteriores usando NaCl ao invés de (NH4)2SO4. O que você
observou?

b) Precipitação por sais de metais pesados e por ácidos fortes

Os cátions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam
precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o elemento
formador (exemplo: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo, etc.). Essa
precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Isso
porque, acima do pI, a carga líquida sobre a proteína é negativa (ver determinação
do ponto isoelétrico da caseína), favorecendo a interação com os cátions
provenientes do sal.
Então não é possível promover a precipitação de uma proteína abaixo do ponto
isoelétrico?
A resposta correta seria: não com sais... A precipitação abaixo do ponto
isoelétrico pode ser feita, sim, mas através da adição de ácidos fortes.
Comparando com o mecanismo anterior: quando a proteína está abaixo do seu
pI, a carga líquida total da molécula é positiva. Isso facilita a interação da molécula
com os ânions provenientes de ácidos como o tunguístico, o fosfotunguístico e pírico.

Nas duas situações o precipitado pode ser ressolubilizado através de alterações

do pH.

b.1. Procedimento

a) Precipitação por sais de metais pesados

13
 1. Em um tubo de ensaio, colocar 1ml da solução de proteínas;
2. Adicionar 0,5 ml da solução de acetato de chumbo;
3. Adicionar 5 ml de água destilada;
4. Observe e interprete os resultados.

b) Precipitação por ácidos

Repita o procedimento anterior, substituindo a solução de acetato de chumbo

pela solução de ácido tricloroacético a 10%.

c) Precipitação por ação do calor (desnaturação)

As proteínas possuem uma estrutura tridimensional (conformação) bem definida,

da qual dependem fundamentalmente suas propriedades físicas, químicas e
biológicas. Essa estrutura é relativamente sensível à ação do calor, que causa
desorganização das cadeias peptídicas, com consequente alteração conformacional.
Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação, e altera as estruturas quaternária,
terciária e secundária da proteína sem afetar sua estrutura primária.
A desnaturação promove alterações que diminuem a solubilidade da proteína,
levando à sua precipitação. Essa precipitação é máxima no ponto isoelétrico da
proteína e pode sofrer alterações pela adição de sais.

c.1. Procedimento

1. Colocar 5 ml da solução de proteínas em um tubo de ensaio;

2. Deixar o tubo em banho-maria fervente por 5 minutos (o tubo também pode
ser aquecido direto na chama de um bico de Bunsen);
3. Retire o tubo do banho, observe e anote os resultados.

d) Precipitação das proteínas por solventes orgânicos

A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água.

Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de soluto é
diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interação do
solvente com o soluto é denominada constante dielétrica. A água apresenta
constante dielétrica bastante elevada (aproximadamente 80). Mas o que isso quer
dizer?
Vamos utilizar novamente a imaginação. Numa solução contendo,
exclusivamente, água e moléculas protéicas temos: interação água - proteína e
interação proteína-proteína. Nesse caso, podemos afirmar com certeza que o
primeiro tipo de interação prevalecerá sobre o segundo porque a água possui grande
capacidade de separação das partículas do soluto (constante dielétrica elevada).
Para os solventes orgânicos a situação é um pouco diferente... Como esse tipo de

14
solvente apresenta valor de constante dielétrica bem inferior à da água, a interação
proteína-proteína "vence" o poder de solvatação da água (interação água-proteína). A
proteína precipita.
A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura. Os
solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis na
separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas esses solventes
podem levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e
estabelecimento de interações apolares, importantes na manutenção da conformação
protéica.

d.1. Procedimento

OBS: Trabalhar a baixa temperatura

1. Tome dois tubos de ensaio e coloque, em cada um, 2 ml da solução de

proteínas;
2. Adicionar 4 ml de etanol gelado a cada tubo;
3. Agite;
4. Em um dos tubos, coloque uma pequena quantidade de NaCl sólido, sob
agitação;
5. Observe e responda: qual o efeito do álcool sobre a proteína na presença e
na ausência do eletrólito?
6. Adicione 6 ml de água destilada e observe.
7. Repita as etapas anteriores substituindo o etanol pela acetona;
8. Compare os resultados.

ATIVIDADE

OBSERVAÇÃO
(Quando o Professor for dividir turma, informar neste espaço)

15
 ROTEIRO PARA AULA PRÁTICA
TÍTULO DA AULA PRÁTICA

AÇÃO PROTEOLÍTICA
Curso: Integrado em Agroindústria
Disciplina: Química de Alimentos
Professor Responsável: Vanessa Marcolino
Quantidade Total de 20
Alunos:
Quantidade de Grupos: 10
Data da Aula:
Turno: Matutino
Horário de Início da Aula: 8:20 Horário de Término da 10:00
Aula:

OBJETIVO

SEPARAÇÃO DE GLUTEN EM FARINHA DE TRIGO

MATERIAL E REAGENTES (POR GRUPO)

 12 Tubos de ensaio

MATERIAL E REAGENTE GERAL

 Solução de amaciante de carne (filtrado resultante da suspensão de 7,5

g de amaciante em 10 mL de água);
 Medicamento digestivo1 (medicamento líquido ou sobrenadante obtido
após trituração, solubilização e filtração de um comprimido);
 Extrato de suco de abacaxi concentrado (bata no liquidificador 6 fatias
de abacaxi e filtre em papel de filtro o extrato resultante, o qual
apresentará atividade enzimática estável por cerca de uma semana, se
mantido congelado);
 Solução saturada de sal de cozinha (dissolva aproximadamente 2 g em
50 mL de H2O)
 Álcool (etanol comercial 92%)

16
  Folha de gelatina em pó
 Clara de ovo

ROTEIRO DA AULA

Prepare nove tubos de ensaio contendo folha de gelatina como substrato

(dissolva aproximadamente 0,5 g de gelatina em 2,5 mL de água) e outros três
contendo clara de ovo como substrato (2,5 mL). Coloque os tubos contendo
gelatina em banho-maria para facilitar a solubilização. Adicione aos tubos 2,5
mL dos reagentes, conforme apresentado na Tabela 1. Após a adição dos
reagentes, resfrie os tubos contendo gelatina em banho de gelo. Observe e
compare os resultados.
Tabela 1: Substratos e respectivos reagentes a serem adicionados em cada
experimento.
Experimento Substrato Reagente
1 Gelatina Água (branco)
2 Gelatina Extrato de abacaxi
3 Gelatina Extrato de abacaxi fervido
4 Gelatina Medicamento digestivo
5 Gelatina Medicamento digestivo fervido
6 Gelatina Solução de amaciante de carne
7 Gelatina Solução de amaciante de carne
fervida
8 Gelatina Solução de sal de cozinha
9 Gelatina Etanol
10 Clara de ovo Água (branco)
11 Clara de ovo Etanol
12 Clara de ovo Solução de sal de cozinha

ATIVIDADE
Estrutura e funções das proteínas

As proteínas podem ser classificadas quanto ao nível conformacional

17
adquirido. A sequência de aminoácidos de uma proteína é denominada de
estrutura primária. O termo estrutura secundária refere-se à conformação local
de alguma porção de um polipeptídeo, ou seja, é o arranjo tridimensional de
aminoácidos localizados mais próximos dentro da estrutura primária.
As estruturas secundárias mais comuns são a -hélice e a folha beta
que geralmente aparecem concomitantemente numa mesma proteína,
constituindo partes da estrutura terciária de um polipeptídeo enovelado. Já a
estrutura terciária, por sua vez, é o arranjo espacial ou enovelamento de toda
uma cadeia polipeptídica.
A estrutura terciária inclui interações de aminoácidos bem mais
distantes na cadeia primária. A disposição de mais de uma cadeia
polipeptídica – denominadas subunidades – na composição de uma mesma
molécula de proteína é chamada de estrutura quaternária.
As proteínas podem também ser divididas em dois grupos principais:
as proteínas globulares e as proteínas fibrosas. As proteínas fibrosas
apresentam propriedades que conferem resistência mecânica, flexibilidade e
suporte às estruturas nas quais são encontradas. Essas proteínas possuem
cadeias polipeptídicas arranjadas em feixes, consistindo tipicamente um único
tipo de estrutura secundária, além de serem insolúveis em água, devido à
elevada ocorrência de aminoácidos hidrofóbicos tanto na parte externa como
interna da proteína.
Por sua vez, as proteínas globulares, que incluem enzimas, proteínas
transportadoras, motoras e regulatórias, se apresentam em formas esféricas
ou globulares. A ocorrência de aminoácidos hidrofóbicos nas proteínas
globulares é maior na parte interna das proteínas, enquanto na parte externa
predomina a presença de aminoácidos hidrofílicos. Geralmente, possuem
mais de um tipo de estrutura secundária.

OBSERVAÇÃO
(Quando o Professor for dividir turma, informar neste espaço)

18
 ROTEIRO PARA AULA PRÁTICA
TÍTULO DA AULA PRÁTICA

CINÉTICA ENZIMÁTICA DA CATALASE

Curso: Técnico Integrado em Agroindústria

Disciplina: Bioquímica
Professor Responsável: Vanessa Aparecida Marcolino
Quantidade Total de 20
Alunos:
Quantidade de Grupos: 10
Turno:
Horário de Início da Aula: Horário de Término da
Aula:

OBJETIVO

 Determinar os valores de KM e Vmáx a partir de um experimento de cinética

enzimática.

MATERIAL E REAGENTES (POR GRUPO)

 Suporte universal com garras, provetas 10 e 50 mL, béquer 50 mL, tubo

de Nessler 50 mL, rolhas, bacia com água;
 Tubo de plástico flexível; válvula de plástico, seringa com agulha fina para
injeções de insulina, cola quente de silicone;

MATERIAL E REAGENTE GERAL

 Agitador magnético, barra magnética, cronômetro digital;

 Tampão fosfato 0,05 M pH 7,0; solução de H2O2 à 2%; em tampão fosfato
0,05 M pH 7,0; tampão acetato 0,05 M pH 4,5; solução de H 2O2 à 2% em
tampão acetato 0,05 M pH 4,5; solução de catalase de fígado bovino
(5,8x10-6 M ou 20 mg/mL) em água.

19
 ROTEIRO DA AULA

FUNDAMENTAÇÃO
A catalase é uma enzima que catalisa a decomposição da água oxigenada
conforme a reação abaixo:

𝐻2 𝑂2 𝑐𝑎𝑡𝑎𝑙𝑎𝑠𝑒 𝐻2 𝑂 + 1⁄2 𝑂2

Os produtos desta reação são água e oxigênio na forma gasosa, portanto o

oxigênio pode ser coletado e seu volume determinado em função do tempo de
reação.

PROCEDIMENTO
a) Montagem do sistema
Em uma vidraçaria, fazer um orifício de ± 6 mm na lateral da parte inferior
do tubo de Nessler. Vedar este orifício com uma rolha de silicone ou de borracha.
Por esta rolha, será injetada a enzima no interior do sistema, com o auxílio de
uma seringa com agulha fina.
Montar o equipamento conforme mostrado na figura que segue, usando a
cola quente para prender o tubo plástico na proveta e na rolha.
Montar dois sistemas, um com uma proveta de 10 mL e outro com uma
proveta de 50 mL. Usar o sistema com a proveta menor nos experimentos com
baixas concentrações de substrato.

20
 Para encher a proveta de líquido, basta vertê-la na bacia com água.
Ao arrolhar o tubo de Nessler, observar que a pressão faz com que o ar
contido no tubo plástico empurre o líquido na direção da proveta. Portanto,
pressionar a rolha para que o ar cubra toda a extensão do tubo plástico sem que
este saia e se acumule na proveta.

b) Cinética
Numerar dez provetas de 50 mL e em cada uma delas, misturar as
soluções de acordo com a tabela abaixo:

Provetas [substrato] H2O2 (2%) Tampão Vo (mL/min)

q.s.p. 35 mL
Molar (mL)

1 0,010 0,52 34,48

2 0,032 1,75 33,25

3 0,065 3,50 31,50

4 0,129 7,00 28,00

5 0,194 10,50 24,50

7 0,259 14,00 21,00

21
 8 0,323 17,50 17,50

9 0,485 26,25 8,75

10 0,647 35,00 0,00

Um grupo fará o experimento utilizando tampão fosfato pH 7,0 e o outro

grupo utilizará tampão acetato, pH 4,5.
Com o auxílio da seringa para insulina, adicionar 100 µL de solução de
enzima, ao mesmo tempo em que outra pessoa aciona um cronômetro. Ao final
de 3 minutos girar a válvula para cessar o acúmulo de O 2 na proveta. Verificar o
volume de O2 formado e dividir este volume por 3 para se obter a razão
(mL/min.). Anotar os resultados na tabela.
OBS.: caso o volume de O2 formado não seja suficiente para quantifica-lo,
aguardar mais um pouco e depois dividir o volume de O 2 formado pelo tempo
despedido em minutos.

ATIVIDADE

1) Faça o gráfico de Michaelis-Mentem ( v0 versus [S] ) e determine o valor

de KM.
2) Faça o gráfico de Lineweaver-Burk e determine o valor de KM e Vmáx.
3) Qual o efeito do pH sobre KM e Vmáx? Explique.
4) A reação é cooperativa? Justifique.

OBSERVAÇÃO
(Quando o Professor for dividir turma, informar neste espaço)

22
 ROTEIRO PARA AULA PRÁTICA
TÍTULO DA AULA PRÁTICA

ESCURECIMENTO ENZIMÁTICO: TESTE PARA PEROXIDASES

Curso: Técnico Integrado em Agroindústria

Disciplina: Bioquímica
Professor Responsável: Vanessa Aparecida Marcolino
Quantidade Total de 20
Alunos:
Quantidade de Grupos: 10
Turno:
Horário de Início da Aula: Horário de Término da
Aula:

OBJETIVO

 Demonstrar o processo de escurecimento de alimentos provocado

por enzimas oxidorredutases.

MATERIAL E REAGENTES (POR GRUPO)

 Tubos de ensaio;

MATERIAL E REAGENTE GERAL

23
  Liquidificador;
 Solução de H2O2 1%;
 Solução de Guaiacol 2%;
 Maçãs e bananas frescas.

ROTEIRO DA AULA

FUNDAMENTAÇÃO
As peroxidases (EC 1.11.1) são um grupo de enzimas oxidorredutases que
oxidam substratos orgânicos, tendo o peróxido de hidrogênio como molécula
aceitadora de elétrons. A reação denominada de peroxidação é descrita pela
equação:

Doador reduzido + H2O2 Doador oxidado + 2 H2O

PROCEDIMENTO
Tomar metade de uma maçã descascada e homogeneizar em
liquidificador com 250 mL de água destilada. Filtrar em gaze ou peneira. Faça o
mesmo com uma banana.
Preparar os tubos de ensaio conforme tabela abaixo:

Tubo Maçã Controle M Tubo Banana Controle B

Água destilada 20,0 20,0 20,0 20,0

(mL)

Filtrado de maçã 2,0 2,0 - -

(mL)

Filtrado de - - 2,0 2,0

banana (mL)

Guaiacol 2% (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0

H2O2 (1%) 5 gotas - 5 gotas -

Observar a mudança de coloração nas soluções no período de 5 minutos.

Anote e discuta os resultados com os colegas de bancada.

24
 ATIVIDADE

1) Qual o papel da água oxigenada (H2O2) no processo de escurecimento?

OBSERVAÇÃO
(Quando o Professor for dividir turma, informar neste espaço)

ROTEIRO PARA AULA PRÁTICA

TÍTULO DA AULA PRÁTICA

USO DE ENZIMAS OXIDORREDUTASES NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS:

EFICIÊNCIA DO PROCESSO DE BRANQUEAMENTO

Curso: Técnico Integrado em Agroindústria

Disciplina: Bioquímica
Professor Responsável: Vanessa Aparecida Marcolino
Quantidade Total de 20
Alunos:
Quantidade de Grupos: 10
Turno:
Horário de Início da Aula: Horário de Término da
Aula:

OBJETIVO

 Demonstrar um teste para controle de qualidade do branqueamento

em alimentos minimamente processados, por meio da atividade de
enzimas oxidorredutases.

MATERIAL E REAGENTES (POR GRUPO)

 Béqueres 100 e 500 mL, proveta 50 mL, pipetas 1 mL, peneira;

25
 MATERIAL E REAGENTE GERAL

 Espectrofotômetro, balança, cronômetro, banho de gelo;

 H2O2 (P.A.), solução de guaiacol 0,5%;
 100 g de vagem fresca.

ROTEIRO DA AULA

FUNDAMENTAÇÃO
Enzimas oxidorredutases como a catalase e a peroxidase, têm alta
estabilidade térmica. Por essa razão, sua atividade catalítica é utilizada como
teste de eficiência de branqueamento em alimentos minimamente processados.
Uma vez que estas enzimas foram inativadas pelo calor, é certo que as outras
enzimas, que têm menor estabilidade térmica, também foram inativadas.

PROCEDIMENTO
Pesar cinco amostras de vagem (5,0 g cada amostra) e aquecer em água
fervente, durante 0 (controle), 1,2,3,4,6 e 8 minutos.
Resfriar rapidamente em água gelada por dois minutos.
Amassar bem cada amostra juntamente com 30 mL de água destilada fria.
Transferir para um béquer devidamente identificado e adicionar 1,0 mL de
guaiacol 0,5% + 0,5 mL de H2O2.
Agitar e deixar em repouso durante 3,0 minutos. Após este tempo, filtrar
com peneira.
Fazer a leitura do filtrado em espectrofotômetro a 420 nm.
Anotar a absorbância encontrada para cada amostra.

ATIVIDADE

1) Reproduzir graficamente (Abs versus Tempo de aquecimento) os

resultados obtidos e determinar o tempo de aquecimento para inativação
da enzima (tempo mínimo de branqueamento).

OBSERVAÇÃO
(Quando o Professor for dividir turma, informar neste espaço)

26
27