UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

INSTITUTO DE QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA

LABORATÓRIO DE BIOQUIMICA
PROF. DRA. SÔNIA SALGUEIRO MACHADO

JOSÉ RONALDO DE ARAUJO

PRATICA 02: SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DO LEITE PELO PONTO

ISOELÉTRICO

Maceió/AL
2021
 JOSÉ RONALDO DE ARAUJO

PRATICA 02: SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DO LEITE PELO PONTO

ISOELÉTRICO

Relatório de aula prática apresentando ao

Curso de graduação em Química
Tecnológica e Industrial, da Universidade
Federal de Alagoas, como requisito para
obtenção de nota da disciplina de
Laboratório de Bioquímica.

Maceió/AL
2021
1. Introdução

O leite é definido como um alimento completo de alto valor nutricional, por ser
fonte considerável de proteínas de alto valor biológico, além de vitaminas e minerais. O
consumo habitual destes alimentos é recomendado, principalmente, para atingir a
adequação diária de cálcio, um nutriente fundamental para a formação e a manutenção da
estrutura óssea, entre outras funções no organismo (MUNIZ; MADRUGA; ARAÚJO,
2013).
O leite de vaca é composto de água (87,3%) e sólidos totais (12,7%), assim
distribuídos: proteínas totais (3,3 a 3,5%), gordura (3,5 a 3,8%), lactose (4,9%), além de
0,7% de minerais e vitaminas (SGARBIERI, 2005; YÜKSEL & ERDEM, 2009)
As proteínas do soro do leite são uma mistura de proteínas isoladas ou
concentradas a partir de soro de leite. O soro de leite é o resíduo que resulta da coagulação
do leite durante a fabricação do queijo. As proteínas do leite apresentam em sua
composição 80% caseína e 20% proteínas do soro. Sendo que as proteínas do soro são
subdivididas, em sua maioria, em: β-lactoglobulinas, α-lactoalbuminas, albuminas
séricas, protease-peptona e imunoglobulinas, como cita Tabela 11.

Os aminoácidos, constituintes das proteínas, apresentam dois grupos que podem

aceitar hidrogênio ou perder o hidrogênio, caracterizando processos de protonação e
desprotonação, respectivamente. A molécula pode estar carregada positivamente,
negativamente ou ser eletricamente neutra, onde as cargas se encontram equilibradas, o
que chamamos de ponto isoelétrico. A figura abaixo representa as formas: positiva (1),
neutra ou isoelétrica (2) e negativa (3).
 As três formas são encontradas em maior ou menor quantidade dependendo do pH
em que a solução do aminoácido se encontra. Isso porque quanto menor o valor de pH,
maior a concentração de íons H+ em solução e, consequentemente, maior a prevalência
da forma positivamente carregada (1). Em contrapartida, quanto maior o valor de pH,
menor a quantidade de íons H+ em solução, havendo prevalência da forma negativamente
carregada (3). A forma eletricamente neutra (2) só poderá existir, numa condição de pH
intermediária à existência predominante da forma positiva e negativa do aminoácido. O
ponto onde a carga líquida total da molécula de aminoácido ou proteína é nula é tão
importante, que recebeu uma denominação especial, ponto isoelétrico (pI).
2. Objetivo do Experimento

Reconhecer as proteínas como moléculas eletricamente carregadas, analisar a

influência do pH sobre essas cargas, reconhecer os grupamentos responsáveis pela
solubilidade das proteínas em água e identificar os agentes que podem alterar essa
solubilidade.

3. Reagentes, vidrarias e material usado

3.1. Leite de caprino 22 mL;

3.2. Becker de 50 e 100 mL;
3.3. Micropipetas de 100, 1000 e 5000 µL;
3.4. Ponteiras;
3.5. pH-metro;
3.6. Ácido Clorídrico (HCl) 1 N;
3.7. Hidróxido de Sódio (NaOH) 1 N;
3.8. Centrifuga.

4. Procedimento (Metodologia)

4.1. Prate 1 – Precipitação Isoelétrica da caseína do leite

4.1.1. Retirar a gordura do leite: Tomar 22 mL de leite caprino e centrifugar em

centrifuga refrigerada para retirar a gordura (15000 rpm, 30 min e 4°C).
Usando tubos de centrifuga previamente tarados;
4.1.2. Retirar o sobrenadante (o leite sem a gordura), medir o volume do
sobrenadante e pesar os tubos para ter a massa úmida de lipídeos do leite;
4.1.3. Ler o pH do leite;
4.1.4. Transferir o leite desnatado para um becker e levar ao pH-metro, iniciar a
adição de ácido clorídrico (HCl) 1N até o pH de 4,6 a temperatura ambiente
(ponto isoelétrico (pI) da caseína). Neste pH começar a formar o precipitado
(branco) da caseína;
4.1.5. Centrifugar esta suspensão a 15000 rpm, por 30min, em 4°C para
sedimentar a caseína que precipitou. Nesse pH ocorre a remoção da caseína
e da proteose peptona;
4.1.6. Transferir o sobrenadante (soro do leite) para um becker e o sedimento
(caseína) para um vidro de relógio previamente tarado. Em seguida pesar
para obter a massa úmida;
4.1.7. As proteínas presentes no sobrenadante (soro) serão precipitadas nas
etapas seguintes.

4.2. Parte 2 – Precipitação das proteínas do soro do leite

4.2.1. Levar o becker contendo o sobrenadante para o pH-metro e iniciar a adição
lenta NaOH 1N no soro ácido até o pH de 5,2 a temperatura ambiente. Este
pH corresponde ao pI da α-lactoalbumina, sérum albumina e β-
lactoglobulina;
4.2.2. Centrifugar a suspensão proteica a 10000 rpm, por 30 min, e 4°C.
Transferir o sobrenadante (soro de leite) para um becker e o sedimento (α-
lactoalbumina, sérum albumina e β-lactoglobulina) transferido para um
vidro de relógio previamente tarado. Em seguida pesar para obter a massa
úmida;
4.2.3. Pegar o sobrenadante (soro remanescente) medir o volume coletado e
iniciar a adição lenta de NaOH 1N no soro ácido até o pH de 8,3;
4.2.4. Centrifugar a suspensão proteica a 10000 rpm, por 30min, e 4°C.
Transferir o sobrenadante (soro de leite) para um Becker e o sedimento
(lactoferrina) transferido para um vidro de relógio previamente tarado. Em
seguida pesar para obter a massa úmida;
4.2.5. As amostras dos sobrenadantes e precipitados ressuspendidos foram
submetidos a quantificação do teor de proteínas pelo método de Bradford
(estudado na pratica 01) e aos estudos fluorimétricos.
5. Resultados e Discussões

Foram obtidos os seguintes resultados após o procedimento:

Concentração
Concentração ABS de proteínas
Volume ppt
Amostras de proteínas (coloca total (g)
(mL) (g)
(mg/mL) as três) Media +
desvio
Soro ácido à
22 5,89 0,129 ±
pH 4.6
P1:Precipitado
ressuspendido 0,071 g 7,48 0,00053 ±
à pH 5.2*
S1:
Sobrenadante à 18 4,70 0,084±
pH 5.2
P2-Precipitado
ressuspendido 0,389 g 5,51 0,0021±
à pH 8.3*
S2-
Sobrenadante à 15 7,34 0,110±
pH 8.3

Com base nos resultados para a separação das proteínas do soro do leite, foi
identificado que no pI = 5,2 precipitou-se as proteínas α-lactoalbumina, sérum albumina
e β-lactoglobulina equivalente a 0,071g e no pI = 8,3 precipitou-se a proteína lactoferrina
equivalente a 0,389 g.
Considerando que a literatura informa que o leite contém entre 3,3 a 3,5% de
proteínas e desse total 80% é de caseína e os demais 20% corresponde as proteínas α-
lactoalbumina, sérum albumina, β-lactoglobulina e lactoferrina.
Além disso, pode-se afirmar que a técnica usado para separação de proteínas é
eficiente e o objetivo do experimento foi alcançado
6. Conclusão
Diante dos resultados obtidos na pratica e descrito neste relatório, conclui-se que o
método de separação para proteínas do soro do leite caprino é eficaz, com baixo custo e
com ótima sensibilidade para quantificação de proteínas, sendo uma excelente opção para
uso em laboratório por ter uma curta duração, ser bem perceptível e possui poucos
interferentes.
7. Referências Bibliográficas

Roteiro da aula prática, fornecido pela professora;

1
https://revista-fi.com.br/upload_arquivos/201708/2017080079890001502911168.pdf;
file:///C:/Users/Ronaldo/AppData/Local/Temp/admin,+Gerente+da+revista,+1355-
5233-1-CE.pdf;