20 novembro 2023

Relatório Trabalhos
Experimentais 5 e 6 -
Extração de Lípidos da
Gema do Ovo por Dissolução
Fraccionada e Precipitação
no Ponto Isoelétrico
Licenciatura em Engenharia Biomédica
Prof.ª Maria Galante Maia

Alexandra Moura, 1220656

Ana Rita Silva, 1221193
Catarina Teixeira, 1220721
Mariana Silva, 1221248

Turma 2A
 Índice
Sumário..................................................1
Palavras Chave........................................1
Introdução...............................................2
Parte Experimental..................................5
Material e equipamentos utilizados..........5
Reagentes
utilizados.................................6
Procedimento...........................................7
Resultados e Discussão...........................14
Conclusão..............................................16
Bibliografia...........................................17
 Parte A -
Extração de Lípidos da Gema do
Ovo por Dissolução Fraccionada
SUMÁRIO
Esta atividade prática visa explorar o processo de extração
seletiva de lipídios presentes na gema do ovo, com foco especial
no colesterol, um componente lipídico menos polar em relação à
maioria das estruturas celulares. A extração é conduzida
utilizando solventes orgânicos apolares, permitindo a separação
dos lipídios da gema do ovo. Posteriormente, os lipídios extraídos
são submetidos à análise e quantificação por meio de métodos
cromatográficos, como o método de Liebermann-Burchard, que
identifica o colesterol total, incluindo ésteres de colesterol. Este
método específico se baseia na reação dos esteroides insaturados
com anidrido acético e ácido sulfúrico concentrado, formando um
complexo corado de azul-esverdeado. Tal reação corada é
frequentemente utilizada na determinação colorimétrica de
colesterol em amostras biológicas. Além disso, são discutidas
técnicas de extração exaustiva de sólidos pouco solúveis com a
utilização de solventes quentes, destacando a montagem de um
cartucho que mantém a amostra em contato contínuo com o
solvente renovado. Esta atividade laboratorial oferece uma
compreensão prática dos fundamentos da extração de lipídios,
bem como da aplicação de métodos analíticos específicos,
contribuindo para o conhecimento na área da bioquímica e dos
compostos lipídicos.

PALAVRAS-CHAVE
Colesterol, métodos cromatográficos, método de Liebermann-
Burchard, ésteres, esteróides insaturados.

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 Parte A -
Extração de Lípidos da Gema do
Ovo por Dissolução Fraccionada
INTRODUÇÃO
A extração de lipídios da gema do ovo por dissolução fracionada é
um procedimento laboratorial que explora a seletividade dos
solventes apolares na obtenção do colesterol e outros lipídios.
Baseando-se na menor polaridade desses compostos em
comparação com os componentes celulares, essa extração
possibilita a separação dos lipídios presentes na gema. Métodos
cromatográficos, como o Liebermann-Burchard, permitem a
identificação e quantificação do colesterol total. Essa reação
corada de azul-esverdeado é aplicada em análises colorimétricas
de colesterol em tecidos e plasma. Este método prático demonstra
a importância da extração seletiva de lipídios, fornecendo
insights cruciais sobre compostos lipídicos e seus processos de
análise.

Nota: O nosso grupo realizou esta atividade experimental com a

clara do ovo, enquanto que o outro grupo utilizou a gema.

2
 Parte B -
Precipitação no Ponto Isoelétrico

SUMÁRIO
A atividade laboratorial "Precipitação no Ponto Isoelétrico" é um
estudo que explora um fenómeno crucial na bioquímica das
proteínas. O ponto isoelétrico, também conhecido por pl, é um
valor de pH específico onde uma molécula proteica, seja um
aminoácido isolado ou uma proteína complexa, apresenta uma
carga elétrica líquida igual a zero. Este ponto é atingido quando
as cargas positivas e negativas dos grupos iónicos presentes na
molécula se equilibram.
Durante esta atividade, ajusta-se o pH de uma solução que
continha proteínas, possibilitando a identificação do pI dessa
substância. Este processo resulta na observação da menor
solubilidade da proteína, levando à sua precipitação máxima.
Este fenómeno ocorre devido à neutralização das cargas da
molécula, o que leva à formação de agregados proteicos que se
separam da solução.
A habilidade de identificar e controlar o pI é crucial em técnicas
de biologia molecular, bioquímica e biotecnologia, permitindo a
separação e purificação seletivas de proteínas com base nas suas
propriedades elétricas. Esta atividade laboratorial oferece assim
um “insight” prático sobre como o pH afeta as propriedades de
solubilidade das proteínas, fornecendo uma base sólida para a
compreensão de vários elementos fundamentais da área de
bioquímica e, consequentemente, da área de Engenharia
Biomédica.

PALAVRAS-CHAVE
pH, solubilidade, ponto isoelétrico, carga elétrica.

3
 Parte B -
Precipitação no Ponto Isoelétrico

INTRODUÇÃO
A "Precipitação no Ponto Isoelétrico" é uma atividade
laboratorial que explora o conceito fundamental do ponto
isoelétrico (pI) em proteínas. Este pI corresponde ao pH no qual
uma molécula proteica apresenta carga elétrica líquida igual a
zero, existindo um equilíbrio entre as cargas negativas e
positivas dos grupos iónicos de um aminoácido ou de uma
proteína. Neste ponto, a molécula torna-se imóvel na presença de
um campo elétrico e a menor solubilidade é observada,
resultando na máxima precipitação da proteína.

4
 Parte Experimental
Parte A – Extração de lípidos da gema
do ovo por dissolução fracionada

Material e equipamentos utilizados

Figura 1 - Equipamento de extração

sólido-líquido (Soxhlet)

Figura 2 - Tubos de ensaio e suporte Figura 3 - Papel de filtro

5
Parte Experimental
Parte A – Extração de lípidos da gema
do ovo por dissolução fracionada

Reagentes

Diclorometano
Anidrido acético
Ácido sulfúrico concentrado

6
 Parte Experimental
Parte A – Extração de lípidos da gema
do ovo por dissolução fracionada

Procedimento
1. Começámos por partilhar um ovo cozido com o grupo que realizou o
mesmo trabalho experimental na aula.
2. Retirámos a gema e colocámos a clara cozida num vidro relógio,
cortando-a de seguida em pedaços muito pequenos (Figura 4), os quais
foram colocados num cartucho feito a partir de papel de filtro (Figura 5).

Figura 4 Figura 5

3. Adaptámos o tubo extrator ao balão e deitámos no balão (por cima do

tubo extrator) a quantidade adequada, aproximadamente 80mL de
diclorometano, tendo de seguida sido colocado o refrigerante no sistema
(Figura 6).
4. Estabelecemos a circulação de água no refrigerante e aquecemos o
balão (Figura 7).
Figura 6

Figura 7

7
 Parte Experimental
Parte A – Extração de lípidos da gema
do ovo por dissolução fracionada

Procedimento

5. Parámos o aquecimento após 3 extrações, levantando o balão e

deixando-o arrefecer ligeiramente.
6. Retirámos a manta e separámos o balão do tubo extrator, colocando-o
numa sogra. Observámos que no balão tem uma solução amarelada, pelo
facto de conter colesterol. Esta é a parte não extraída que é constituída por
proteínas. Por este motivo, certificámo-nos que todo o material utilizado
durante o procedimento desta reação, reação Liebermann-Burchard, deve
estar seco.
7. Por fim, transferimos 2 mL da solução do balão do ensaio anterior
(Figura 8) e adicionámos 1 mL de anidrido acético e 2 gotas de ácido
sulfúrico concentrado (Figuras 9 e 10). Agitámos e de seguida aguardámos
algum tempo, registando os resultados observados.

Figura 8 Figura 9 Figura 10

8
 Parte Experimental
Parte B – Precipitação no Ponto
Isoelétrico

Material e equipamentos utilizados

Figura 11 – Centrifugador

Figura 12 - Tubos de ensaio e

suporte

Figura 13 – Micropipeta Monocanal

9
Parte Experimental
Parte B – Precipitação no Ponto
Isoelétrico

Reagentes

Leite em pó desnatado NaOH 0,1 mol/L

Ácido acético 0,1 mM
Ácido acético 1,0 mM
Ácido acético 50 mM
Ácido acético 1 M
Ácido acético 2 M

Figura 14 - Leite em pó desnatado

NaOH 0,1 mol/L

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 Parte Experimental
Parte B – Precipitação no Ponto
Isoelétrico

Procedimento
1. Preparámos 5 tubos de ensaio de acordo com a tabela abaixo
representada. Utilizámos uma micropipeta monocanal para transferir o
ácido acético para cada tubo de ensaio (Figuras 15 e 16).

Figura 15 Figura 16

11
 Parte Experimental
Parte B – Precipitação no Ponto
Isoelétrico

Procedimento
2. Adicionámos a cada um dos tubos, 5 mL de solução de leite em pó
desnatado (5 %, previamente centrifugado), também com o auxílio de uma
micropipeta monocanal (Figura 17).

Figura 17

3. Agitámos os tubos e aguardámos 5 minutos (Figura 18).

Figura 18
12
 Parte Experimental
Parte B – Precipitação no Ponto
Isoelétrico

Procedimento
4. Por fim, recolhemos alíquotas de 1,0 mL e colocámos em tubos
pequenos de plástico (Figura 19), os quais centrifugámos de seguida com
uma rotação de 5000 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente e, no
final, registámos os resultados obtidos (Figuras 20 e 21).

Figura 19 Figura 20

Figura 21 13
Resultados e Discussão
Parte A – Extração de lípidos da gema do
ovo por dissolução fracionada

Este procedimento experimental teve como principal objetivo o isolamento

e identificação do colesterol a partir da gema de um ovo cozido, usando
uma abordagem química e cromatográfica[1]. É de notar que na aula
laboratorial, ao invés da gema do ovo, utilizamos a clara, visto que
dividimos o ovo com outro grupo.
Numa vista cromatográfica, o colesterol é menos polar do que a maioria dos
componentes celulares, o que permite uma extração seletiva facilitada. Ao
longo do procedimento foi utilizado o diclorometano para esse mesmo feito.
Numa vista química, e sendo o objetivo final a identificação do colesterol, o
método utilizado para este fim foi a reação de Liebermann-Burchard, que
consiste na reação dos ésteres do colesterol com algumas gotas de anidrido
acético e uma gota de ácido sulfúrico concentrado – resultando numa
solução azul-esverdeada (Figura 22). A cor resultante deve-se ao grupo
hidroxila (-OH) presente no colestrol.

Figura 22 - Identificação do colestrol

[1] Cromatografia é uma técnica utilizada para analisar, identificar ou separar os

componentes de uma mistura

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Resultados e Discussão
Parte B – Precipitação no Ponto Isoelétrico

Este procedimento está relacionado com a determinação do ponto isoelétrico de

proteínas presentes no leite em pó desnatado. O ponto isoelétrico é o pH no
qual uma molécula tem uma carga líquida zero, ou seja, está em equilíbrio
entre as cargas positivas e negativas dos outros grupos iónicos. No ponto
isoelétrico as proteínas tornam-se imóveis na presença de um campo elétrico e
têm baixa solubilidade.
O objetivo deste procedimento é observar como é que as proteínas interagem
com o meio, em diferentes valores de pH. As expectativas para este trabalho
baseiam-se na maior precipitação e menor solubilidade das proteínas em torno
do ponto isoelétrico.
O pH das soluções das Figuras 23 a 27 é decrescente no sentido básico-ácido
(explorado melhor na Parte Experimental B). Deste modo, conseguimos
perceber que a solução 5 teve maior precipitado e também tem um pH mais
ácido. Isto significa que, neste caso, o ponto isoelétrico está situado numa zona
de pH ácido.
Na realidade, o ponto isoelétrico deve estar situado numa zona de pH básico, o
que significa que os resultados obtidos neste trabalho não foram corretos.
Alguns motivos para este erro podem ser o facto de termos centrifugado as
soluções durante 7 minutos, ao invés de 5, ou de não termos medido o pH das
soluções obtidas no ponto 2 do Procedimento Experimental B.

Figura 23 - Figura 25 - Figura 27 -

Precipitado 1 Precipitado 3 Precipitado 5

Figura 24 - Figura 26 - 15
Precipitado 2 Precipitado 4
 Conclusão

O procedimento realizado na aula prática da UC, ajudou-nos a

demonstrar a utilidade e fidelidade do método de Liebermann-
Burchard na deteção do colesterol numa determinada solução. Este
método tem como resultado positivo na identificação colométrica
do colesterol total, a formação de um complexo corado azul-
esverdeado – gema do ovo, e como resultado negativo, a cor da
solução mantém-se inalterada (resultado obtido, como é possível
ver na figura 22) – clara do ovo.
Durante o tempo de espera que foi necessário na realização do
procedimento experimental 5 (método de Liebermann-Burchard),
realizámos também o procedimento experimental 6 (precipitação no
ponto isoelétrico – pH no qual há equilíbrio entre as cargas dos
grupos iónicos de um aminoácido ou proteína; solução onde ocorre
precipitação, devido à solubilização da solução ser mínima).
Ao contrário do procedimento experimental 5, que o resultado
obtido foi o esperado, no trabalho 6, não aconteceu o mesmo, visto
que o ponto isoelétrico normalmente ocorre em soluções neutras,
com valores de pH entre os 6 e os 7 e no nosso caso aconteceu na
solução 5 (1,0 mL de ácido acético 2M; pH= 2,7). Podemos
especular, que o resultado obtido se deveu ao facto das soluções
terem estado mais do que 5 minutos na centrífuga e, por isso,
devido à força da gravidade, ter havido mais precipitação do que
era esperado.
Em geral, podemos concluir que ambos os procedimentos
oferecem contribuições significativas para a compreensão e análise
de compostos bioquímicos e orgânicos, destacando-se pela sua
utilidade na caracterização e identificação de substâncias em
diferentes contextos laboratoriais e de pesquisa.

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 Bibliografia

Domingues, V. ; Maia, M. L. ; Rocha, J. M. (2023)

“Trabalhos práticos - série II” disponível via moodle
Domingues, V. (2023) “Manual de laboratório” disponível
via moodle

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