3 dezembro 2023

Relatório Trabalho
Experimental 8 -
Efeito da Concentração da
Enzima
Licenciatura em Engenharia Biomédica
Prof.ª Maria Galante Maia

Alexandra Moura, 1220656

Ana Rita Silva, 1221193
Catarina Teixeira, 1220721
Mariana Silva, 1221248

Turma 2A
 Índice
Sumário..................................................1
Palavras Chave........................................1
Introdução...............................................2
Parte Experimental..................................3
Material e equipamentos utilizados..........3
Reagentes
utilizados.................................5
Procedimento...........................................6
Resultados e Discussão.............................8
Conclusão..............................................14
Bibliografia...........................................15
 SUMÁRIO
O trabalho experimental explorado neste relatório teve como principal
objetivo o estudo da atividade catalítica da invertase de levedura. De modo a
realizarmos este estudo, seguimos um procedimento experimental rigoroso
que se dividiu em duas partes: construção da curva de calibração da sacarose
hidrolisada e construção de um gráfico que relaciona a concentração da
enzima com a velocidade de hidrólise. Através deste procedimento,
conseguimos obter dois gráficos concisos que nos permitiram analisar os
resultados obtidos.

PALAVRAS-CHAVE
Enzima, hidrólise, concentração, curva de calibração, velocidade da
hidrólise, absorvância, sacarose hidrolisada

1
 INTRODUÇÃO
As enzimas são proteínas que auxiliam processos celulares, acelerando a
multiplicação celular e impedindo a formação de subprodutos – algo que
caracteriza a elevada especificidade das enzimas. Esta atividade catalítica
depende diretamente da estrutura das enzimas. Nestas estruturas, existe uma
região denominada de sítio ativo que desempenha um papel fundamental na ação
catalítica, visto que é nesta região que se situam os resíduos de aminoácidos que
permitem que a reação ocorra.
A presença de resíduos de aminoácidos é essencial visto que os aminoácidos
desempenham funções de orientação do substrato e interações específicas com o
mesmo. O substrato é uma molécula específica sobre a qual uma enzima atua; por
outras palavras, é a substância que se liga ao sítio ativo da enzima.
As funções de orientação favorecem a aproximação e interação entre as
moléculas envolvidas na reação, sendo, deste modo, requerida uma energia mais
baixa para a ocorrência da reação. As interações específicas com o substrato
traduzem-se em ligações de hidrogénio, ligações de Van der Waals e ligações
iónicas. Estas interações são altamente seletivas e específicas ao substrato em
causa, o que contribui para uma elevada especificidade característica das
enzimas.
A enzima selecionada para este estudo foi a invertase de levedura que catalisa a
hidrólise da sacarose em glicose e frutose. A quantificação da sacarose hidrolisada
tem por base a reação entre os açúcares redutores (glicose e frutose) e o ácido 3,5-
dinitro-salicílico (DNS) obtendo-se um produto de cor característica, cuja
formação pode ser seguida a 540 nanometros. A quantidade de sacarose
hidrolisada pode ser determinada através de cálculos estequiométricos, sabendo a
quantidade de açúcares redutores formada.

2
 Parte
Experimental
Material e equipamentos utilizados

Banho Maria Cuvete

Figura 1 - Banho Maria Figura 2 - Cuvete

Espectrofotómetro de Vortex
Uv’s/Vis

Figura 3 - Espectrofotómetro de Uv’s/Vis Figura 4 - Vortex 3

 Parte
Experimental
Material e equipamentos utilizados

Micropipetas

Figura 6 - micropipeta
monocanal de 5000 μL

monocanal de 1000 μL
Figura 5 - micropipeta

Tubos de ensaio e suporte

Figura 7 - Tubos de ensaio e suporte 4

 Parte
Experimental
Reagentes
Solução de glicose 6,017 mM e de frutose 6,017 mM
(fig.8)
Solução tampão acetato pH 4,7 (fig.9)
Solução de sacarose a 5% em tampão
Ácido 3,5-dinitro-salicílico (DNS) (fig.10)
Solução de enzima (8mg/mL) em tampão
Água desionizada (fig.11)

Figura 8 - Solução de glicose Figura 9 - Solução tampão Figura 10 - DNS Figura 11 - Água
e de frutos acetato desionizada

5
 Parte
Experimental
Procedimento

1. Curva de Calibração
Começámos por adicionar a 6 tubos de ensaio, os volumes de solução padrão
de glicose e frutose que se encontram na tabela 1. De seguida, completámos o
volume em cada tubo para 2,0 mL com a solução tampão e adicionámos 1 mL
de reagente DNS a cada tubo, conforme a tabela 1. Após a adição do
reagente, colocámos os tubos em banho maria fervente por 10 minutos.
Arrefecemos os tubos em água fria, adicionámos 8 mL de água desionizada e
homogeneizámos as soluções. De seguida, lemos as absorbâncias a 540 nm
contra o branco, no espectrofotómetro e construímos o gráfico absorbância vs
concentração de sacarose hidrolisada.

Tabela 1

6
 Parte
Experimental
Procedimento
2. Efeito da concentração de enzima
Na segunda parte desta experiência, numerámos os 7 tubos de ensaio e,
mantendo-os em gelo, adicionámos os reagentes conforme a tabela 2. Após a
adição da enzima, agitámos suavemente os tubos de ensaio e retirámos os
tubos do gelo, colocando-os de imediato em banho a 37ºC durante 5 minutos.
Depois desse tempo, os tubos voltam ao gelo (neste momento, assume-se que a
reação para) e, ainda no gelo, adicionámos 1 mL de reagente DNS.
Transferimos os tubos para banho maria fervente durante 5 minutos e depois
deixámo-los arrefecer em água fria corrente. De seguida, adicionámos 8 mL
de água desionizada em cada tubo e agitámos no vortex.
Por fim, lemos as absorbâncias a 540 nm e fizemos um gráfico colocando a
concentração da enzima (μM) nas abcissas e nas ordenadas, a velocidade de
hidrólise expressa em μmols de sacarose hidrolisada por minuto.

Tabela 2
Nota: pode dar erro porque no 1.1. usámos a pipeta de 5 mL para medir 1 mL de
tampão (no tubo 5); 2.1. acrescentamos a solução de enzima no tubo 1 antes do
tempo (vai ficar a reagir mais tempo); adicionamos o reagente de DNS com a
mesma ponta da pipeta; 7
 Resultados e
Discussão
1. Curva de Calibração
Na primeira parte da experiência, obtivemos os seguintes resultados,
após colocar os tubos em banho-maria fervente por 10 minutos
(Figura 12) e, de seguida, após arrefecê-los em água fria e ter-lhes
adicionado 8 mL de água desionizada (Figura 13). Podemos observar
que a principal alteração visível após a fervura dos tubos consiste
num aumento da intensificação da cor, de amarelo para vermelho, de
acordo com o aumento da concentração da solução padrão (glicose +
frutose).

Figura 12 - Tubos com o preparado de Figura 13 - Tubos com o preparado de

solução padrão, solução Tampão e solução padrão, solução Tampão e
reagente DNS após o aquecimento reagente DNS após a adição de água
desionizada 8
 Resultados e
Discussão
Após a medição das absorvâncias a 540 nm dos preparados contra o
branco, organizámos a seguinte tabela a fim de obtermos uma melhor
análise dos dados da experiência (Tabela 3).
Para calcularmos a concentração de sacarose hidrolisada, recorremos
à seguinte expressão:

Tabela 3 - Resultados obtidos sobre os preparados com solução

padrão, solução tampão e reagente DNS

9
 Resultados e
Discussão
De seguida, elaborámos a respetiva curva de calibração a partir dos
valores de absorbâncias obtidos em função dos valores calculados da
concentração final de sacarose hidrolisada (Gráfico 1).

Gráfico 1 – Curva de calibração da absorvância em função da

concentração de sacarose hidrolisada

10
 Resultados e
Discussão
2. Efeito da Concentração da Enzima
Na segunda parte da experiência, aplicámos o mesmo procedimento
sendo o preparado substituído por um que envolvia sacarose e
invertase. A fim de compreender qual o efeito da concentração de
enzima em relação à velocidade de hidrólise. Assim, começámos por
calcular os valores das concentrações mássicas da enzima para cada
tubo preparado, através da seguinte expressão:
[Invertase]mássica inicial x V Invertase inicial = [Invertase]final x V
Total final
[Invertase]final = [Invertase]mássica inicial x V Invertase inicial / V
Total final
De seguida, a partir da concentração mássica da enzima foi possível
obter a respetiva concentração molar, pela seguinte equação:

Nota: neste passo, multiplicámos os resultados por 1x106 pois

pretendíamos o valor da concentração em micromoles (μmol)

11
 Resultados e
Discussão
Após a execução dos cálculos anteriores, organizámos os dados na
seguinte tabela (Tabela 4), a fim de facilitar os posteriores cálculos
que seriam necessários.

Tabela 4 – Resultados obtidos sobre os preparados com solução

de sacarose, solução tampão, solução de invertase e reagente
DNS

Por último, após medirmos o valor das absorbâncias dos preparados

no espectrofotómetro, foi possível calcular a concentração de sacarose
hidrolisada presente em cada tubo. Para isso, recorremos à seguinte
expressão:

12
 Resultados e
Discussão
A partir da concentração anteriormente obtida, retirámos o número
de moles presentes nos preparados para depois calcular a velocidade
de hidrólise:

Nota: multiplicámos os valores obtidos por 1x103 a fim de obtermos

micromoles (μmol).

De seguida, calculámos o valor da velocidade da hidrólise enzimática

em μmol/min, ou seja:

Por fim, construímos o gráfico correspondente ao efeito da

concentração da enzima ao relacionar a concentração final de
invertase com a sua velocidade de hidrólise.

Gráfico 2 – Efeito da concentração da enzima

13
 Conclusão
O estudo aprofundado do "Efeito da Concentração da Enzima"
mediante a investigação da invertase revelou informações fundamentais
para a compreensão da cinética enzimática e a sua relação com a
atividade catalítica. As enzimas, como catalisadores biológicos,
desempenham um papel fundamental na aceleração das reações
químicas necessárias à vida, atuando com notável especificidade para os
seus substratos. A estrutura enzimática, especialmente o sítio ativo,
destaca-se como a região de interação vital entre a enzima e o
substrato, onde os resíduos de aminoácidos coordenam a orientação do
substrato e facilitam a reação.
A aplicação do ácido 3,5-dinitro-salicílico (DNS) para quantificar a
sacarose hidrolisada é um exemplo emblemático de método analítico.
Esse procedimento permite não apenas a avaliação qualitativa, mas
também a quantificação precisa dos produtos formados, abrindo portas
para estudos quantitativos em termos de μmols de sacarose hidrolisada
por minuto, permitindo uma análise detalhada da cinética da reação.
A correlação entre a concentração da enzima e a velocidade da reação
reforça a natureza catalítica das enzimas, demonstrando a sua
sensibilidade à concentração para promover ou limitar a velocidade da
reação. Este estudo contribuiu significativamente para a compreensão
das complexidades da cinética enzimática e conferiu bases sólidas para
futuras investigações, reforçando a importância contínua da bioquímica
na Engenharia Biomédica.

14
 Bibliografia

Domingues, V. ; Maia, M. L. ; Rocha, J. M. (2023)

“Introdução aos trabalhos laboratoriais” disponível via
moodle
Domingues, V. (2023) “Manual de laboratório” disponível
via moodle

15