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UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA BIOQUMICO-FARMACUTICA

DISCIPLINA: BIOTECNOLOGIA FARMACUTICA (FBT 0535) Prof. Dr. Michele Vitolo FUNDAMENTOS DE CINTICA ENZIMTICA 1. Introduo A evoluo da enzimologia pode ser dividida em quatro fases, a saber, totalmente emprica, descritiva, quantitativa e aplicativa com planejamento. A fase emprica transcorrida entre 4000-3000AC e incio do sculo XIX - compreende o uso de enzimas em processos feitos em grande escala curtume, coagulao do leite para fazer queijo, por exemplo sem a mnima noo do tipo de agente responsvel pela converso. A fase descritiva ocorrida ao longo do sculo XIX correspondeu ao perodo em que a atividade enzimtica comeou a ser observada com mais ateno e mtodo. Assim por exemplo, observou-se que extratos aquosos de estmagos de aves tinham a capacidade de digerir a carne animal; extratos aquosos de cereais digeriam materiais amilceos, como a ptialina da saliva agia sobre um pedao de po; extrato aquoso de levedura de panificao era capaz de hidrolisar a sacarose, dando o acar invertido como produto final. A fase quantitativa, que se refere ao estabelecimento de modelos matemticos para quantificar a atividade enzimtica, iniciou-se no final do sculo XIX, sendo o primeiro modelo quantitativo conhecido como modelo de Michaelis-Menten estabelecido em 1913 e aperfeioado por Briggs e Haldane em 1926. Neste mesmo ano, Sumner cristalizou a urease e identificou-a como uma protena. A caracterstica protica das enzimas foi ficando cada vez mais clara, medida que novas enzimas eram descobertas, caracterizadas quimicamente e descritas ao longo de todo o sculo XX. A fase de aplicao planejada, apesar de ter comeado na primeira dcada do sculo passado uso da amilase e da invertase na hidrlise do amido e da sacarose, respectivamente acelerou-se a partir dos anos quarenta, quando novas enzimas apareceram no mercado e os conhecimentos bsicos sobre elas foram se ampliando e aperfeioando. Lembra-se que todas as enzimas conhecidas at agora so de natureza protica, mas que nem toda a protena tem a capacidade de atuar como catalisador. Recentemente, descobriu-se que algumas molculas de cido ribonuclico tm propriedades catalticas, sendo chamadas de ribozimas. Suas funes restringem-se na modificao de algumas molculas de RNAm antes de sua traduo em protena no ribossomo. As ribozimas podero ser empregadas na terapia gnica (SAID e PIETRO, 2004). As enzimas, por serem protenas, so polmeros de aminocidos concatenados atravs da ligao pptica. Devido s interaes entre os grupos qumicos presentes nas cadeias laterais de seus aminocidos constituintes, a molcula adquire conformaes tridimensionais de tal sorte que lhe permite interagir com determinadas substncias, as quais acabam tendo sua estrutura molecular modificada de alguma forma.

2. Especificidade As enzimas catalisam especificamente uma reao, aceitando, em geral, somente uma substncia como substrato. Mesmo quando a enzima catalisa a converso de mais de um substrato ela o faz com velocidades diferentes (Tabela 1). A especificidade decorre das caractersticas particulares de uma regio da macromolcula enzimtica, denominada stio ativo. Ento, o substrato reagente a ser modificado pela enzima se encaixa no stio ativo, onde transformado em outro composto (produto). Existem duas teorias que procuram explicar o modo como se d a interao enzima-substrato. Uma delas a teoria da chave-fechadura, proposta por Fisher no incio do sculo XX preconiza que o substrato se encaixa no stio ativo da enzima de modo anlogo ao encaixe de uma chave (seria o substrato) na correspondente fechadura (seria a enzima). Para tal devem ser satisfeitas duas condies, a saber, complementaridade estrutural entre o stio ativo e o substrato; o substrato e o stio ativo terem polaridade e tamanho compatveis. A outra teoria proposta por Koshland nos anos sessenta do sculo XX, chamada de teoria do encaixe induzido prope que o stio ativo seria uma regio da molcula enzimtica susceptvel de sofrer ligeiras modificaes conformacionais, quando o substrato se aproxima dela, de tal sorte a facilitar a interao enzima-substrato. Na essncia, as duas teorias diferem na caracterstica estrutural atribuda ao stio ativo, ou seja, rgida (segundo Fischer) ou flexvel (segundo Koshland). Em todo o caso, ambas fornecem uma idia bem clara sobre o mecanismo da interao substrato/enzima. Atualmente, considera-se que o stio ativo seja constitudo por duas sub-regies. Em uma delas se d o encaixe do substrato (denominada stio de ligao) e na outra se d a transformao qumica do substrato (denominada stio cataltico). TABELA 1. Ao da glicoamilase sobre dissacardeos. DISSACARDEO LIGAO OSDICA ATIVIDADE RELATIVA Maltose 100 -1,4 Nigerose 7 -1,3 Isomaltose 4 -1,6 Da Tabela 1 observa-se que a glicoamilase (tambm conhecida pelo nome de amiloglicosidase) pode atuar sobre os dissacardeos ismeros indicados, porm o substrato de preferncia a maltose. Ou seja, este dissacardeo tem afinidade maior pelo stio de ligao da glicoamilase do que os demais ismeros. 3. Atividade Enzimtica 3.1. Introduo O conhecimento e a quantificao da atividade enzimtica importante, quando se deseja utilizar as enzimas quer em processos industriais quer em quaisquer mtodos analticos.

Centrando a ateno nos processos industriais, algumas consideraes devem ser feitas com o intuito de avaliar a propriedade ou no de se empregar enzimas como catalisadores de reaes especficas. Os questionamentos bsicos seriam: a) Quanto da enzima ser necessria?; b) Qual a durao da reao?; c) Qual a concentrao de substrato a ser transformada?; d) Quais as condies de reao?; e) Quais os custos envolvidos? Uma vez tomada a deciso em favor do processo enzimtico, e sabendo que a enzima per si tem um custo ela deve ser adquirida no mercado -, deve-se avaliar o impacto que este custo exerce sobre o processo como um todo. Em linhas gerais, o custo efetivo de um processo catalisado por enzima deriva da razo entre o custo adicional da enzima e o aumento do rendimento e/ou do valor agregado do produto final, ou, ainda, economia global conseguida no processo. Do exposto, decorre que o sucesso no uso da enzima implica na otimizao do trinmio quantidade de enzima necessria/condies operacionais/rendimento da reao. Teoricamente, sendo as enzimas catalisadores portanto regenerveis ao fim de cada ciclo de reao uma pequena quantidade de enzima pode transformar qualquer quantidade de substrato. Contudo, deve existir uma correlao tima e finita entre a quantidade de catalisador, sua atividade inicial e a quantidade de substrato a ser transformada. Alm disso, lembra-se que os processos enzimticos industriais duram desde minutos (por exemplo, ao de proteases sobre as protenas da cevada maltada visando o aumento do teor de nitrognio no mosto a ser usado na fabricao de cerveja dura menos de 60 min) at algumas horas (por exemplo, a sacarificao do amido liquefeito pela glicoamilase dura cerca de 3h, enquanto que a hidrlise da lactose do soro de leite pela -galactosidase tambm chamada de lactase dura cerca de 20h) (GODFREY e WEST, 1996). Obviamente a tecnologia enzimtica visa ocorrncia de reaes rpidas, sem no entanto perder de vista as restries impostas pelas condies de processamento e de escala, que devem ser justificadas do ponto de vista econmico. 3.2. Quantificao da atividade enzimtica Seja a reao catalisada por uma enzima: k1 E + S ES E k2 k3

+ P

onde: E = concentrao de enzima; S = concentrao de substrato; ES = concentrao do complexo enzima substrato; P = concentrao de produto; k1 = constante de velocidade de primeira ordem (t -1); k2 = constante de velocidade de segunda ordem (M-1.t-1) e k3 = constante de velocidade de primeira ordem (t-1). Da equao proposta observa-se que antes do substrato ser convertido em produto a enzima e o substrato se ligam, formando o chamado complexo enzima-substrato (ES). A formao do ES uma etapa obrigatria em qualquer reao catalisada por uma enzima. Nota-se, tambm, que ES dependendo das condies operacionais pode se decompor quer formando o produto final (P) etapa controlada pela constante k3 na qual

a reao ocorre efetivamente quer liberando o substrato (S), etapa controlada pela constante k2 e situao em que a reao no ocorre efetivamente. Em linhas gerais, pode-se considerar que uma reao enzimtica ocorre em trs etapas distintas (Figura 1). Na 1 etapa verificada to logo a enzima (E) e o substrato (S) entram em contato no meio reacional ocorre a formao e o acmulo do complexo enzima substrato (ES). Nesta fase no h formao de produto. A existncia de ES foi prevista por Brown em 1892 e reforada em 1902 por Henry. A idia foi usada por Michaelis-Menten para em 1913 estabelecerem o primeiro modelo matemtico til para quantificar a atividade enzimtica, o qual seria modificado e complementado por Briggs e Haldane em 1926. A identificao experimental de ES ocorreu em 1936. Na 2 etapa perodo durante o qual a concentrao de ES no meio reacional permanece constante a concentrao de substrato diminui e a de produto aumenta rapidamente. Na 3 etapa quando a concentrao de ES no meio reacional no mais constante o consumo de substrato e a formao de produto ocorrem mais lentamente.

(P) (g/L) (S) (g/L) (E) (g/L) (S) (P)

(E)

(ES)

Tempo Figura 1. Variao das concentraes de enzima (E), substrato (S) e produto (P) em funo do tempo. 1 fase; 2 fase e 3 fase.

A abordagem quantitativa da atividade enzimtica feita considerando-se os eventos da 2 e 3 fases. Primeiramente, vamos considerar a 2 fase. O ponto de partida ser a avaliao da maneira de como as concentraes iniciais de substrato (S) variam com o tempo na presena de uma quantidade fixa de enzima (E 0). Isto feito no laboratrio, medindo-se a quantidade de substrato consumida durante um perodo total de reao e lanando-se em um grfico do tipo (S) = f(t) (Figura 2). A partir dos trechos lineares das curvas do grfico (S) = f(t), calculam-se as inclinaes correspondentes, as quais representam as velocidades da reao catalisada

pela enzima (v1, v2, v3,.....vn) frente s correspondentes concentraes iniciais de substrato (S1, S2, S3,.....Sn) (Tabela 2). A seguir, os dados constantes da Tabela 2 so lanados em um grfico v = f(S), cujo perfil representa geralmente uma hiprbole retangular (Figura 3).

t
Quantidade de S Consumida (g/L) (S2)

(Sn) (S3)

(S1)

10

15

20

25

Tempo (min) Figura 2. Variao do consumo de substrato em funo do tempo de reao. A quantidade de enzima presente no meio reacional foi suposta constante (E0). No intervalo de tempo 0t tem-se que o consumo de substrato varia linearmente com o tempo, ou seja, a velocidade de consumo de substrato (v = - dS/dt) permanece constante, indicando que a concentrao inicial de substrato (S1, S2, S3,.....Sn) suficiente para saturar toda a quantidade de enzima presente (E0). Acima do tempo t a correlao de consumo frente ao tempo de reao para S1 deixa de ser linear, neste caso, ento, a quantidade de substrato presente no meio reacional j no mais suficiente para saturar toda a enzima presente. Por conseguinte, no trecho linear de cada curva tem-se representada a condio em que a concentrao de (ES) permanece constante, ou seja, o intervalo 0t corresponde 2 fase referida na Figura 1. Lembra-se que as curvas indicadas correspondem s concentraes iniciais crescentes de substrato (S1 < S2 <S3...< Sn), tendo-se em decorrncia v1 < v2 < v3 .... < vn.

TABELA 2. Correlao entre as concentraes iniciais de substrato e as velocidades de reao no intervalo de tempo 0 t. Concentrao inicial de substrato (g/L) Velocidade da reao (g/L.min) S1 v1 S2 v2 S3 v3 Sn vn

Conforme j referido, lanando-se os pares de valores (v, S) em um sistema de coordenadas cartesianas resulta um grfico do tipo apresentado na Figura 3, ou seja, v e S correlacionam-se por uma funo hiperblica, cuja assntota tende a um valor mximo de v (a chamada Vmax, uma das constantes cinticas fundamentais, que ajuda a descrever quantitativamente a catlise enzimtica). O trecho assinttico da curva representado pela invarincia de v com o aumento de S o qual se estabelece a partir de um dado valor de S seria a representao grfica da condio em que a quantidade de substrato presente no meio reacional suficiente para saturar completamente as molculas de enzima. Em outras palavras, todas as molculas de enzimas presentes no meio de reao acham-se ligadas ao substrato, ou seja, no sistema predomina a espcie ES (complexo enzimasubstrato, outro ente fundamental da catlise enzimtica).

v = (-dS/dt) Vmax v3 v2 (Vmax)/2 v1

0 0 S1 Km S2 S3 S4 . Sn

(S)

Figura 3. Grfico da velocidade (v = - dS/dt) da reao enzimtica em funo da concentrao inicial de substrato. A curva identificada matematicamente como hiprbole retangular mostra que a partir da concentrao inicial de substrato S2 a velocidade da reao passa a no aumentar na mesma proporo que a concentrao inicial de substrato, at que a partir de S4 torna-se invariante em relao ao aumento da concentrao inicial de substrato. A reao, portanto, passa a ocorrer com a velocidade mxima (Vmax), lembrando que nesta condio a enzima encontra-se saturada com substrato, ou seja, o complexo ES a forma dominante da enzima nesta fase da catlise (2 fase). Indica-se, tambm, nesta figura a constante cintica Km que corresponde concentrao inicial de substrato na qual a velocidade da reao a metade da velocidade mxima a qual junto com a Vmax e sob condies definidas de reao caracterizam a atividade cataltica da enzima.

Considerando a decomposio (ES E + P) como a etapa determinante da reao, pode-se escrever que: (- dS/dt) = v = k3.(ES) Em qualquer instante da reao, tem-se que: (Eq. 1)

E0 = (E) + (ES)

(Eq.2)

Em presena de excesso de S (substrato), a reao estar deslocada totalmente para a direita (ou seja, no sentido da formao de produto) e, por conseguinte, toda a enzima estar ligada ao substrato (ou seja, a cada instante da reao no existe molcula de enzima no meio reacional que no esteja ligada a uma molcula de substrato). Logo, (E) = 0. Desta forma, a equao 2 pode ser escrita: E0 = (ES) Substituindo a Eq. 3 na Eq. 1, temos: v = k3.E0 (Eq. 4) (Eq. 3)

Pela equao 4, pode-se concluir que na condio de saturao da enzima a reao procede segundo uma cintica de pseudo-ordem zero, ou seja, aparentemente a cintica no afetada pela concentrao de substrato. Realmente, observando a Eq. 4, v-se que a velocidade da reao diretamente proporcional concentrao total de enzima presente no meio reacional. Nesta condio de saturao da enzima, a constante de velocidade (k3) chamada de turnover number e simbolizada por kcat. O turnover number significa o nmero de vezes que uma molcula de enzima participa do ciclo cataltico em um dado intervalo de tempo, ou seja:

E P ES

Na condio de saturao, o produto kcat.E0 corresponde velocidade mxima da reao catalisada pela enzima (Vmax). Ento, v = Vmax Lembrando que a Eq. 5 pode, tambm, ser escrita como: - dS/dt = Vmax Rearranjando a Eq.6, e integrando em seguida tem-se: (S) = (S0) Vmax.t (Eq. 7) (Eq. 6) (Eq. 5)

Portanto, quando a enzima est saturada de substrato, a concentrao de substrato presente no meio reacional diminui linearmente com o tempo. Este fato o reflexo da reao transcorrer a uma velocidade constante e, ao mesmo tempo, mxima. nesta condio em que a enzima tem sua atividade cataltica padronizada. Na presena de baixa concentrao de substrato, nota-se da figura 3 (trecho 0S1) que v varia linearmente com S , podendo-se, ento, escrever que: v = (- dS/dt) = k.S Onde k uma constante de velocidade de primeira ordem. Rearranjando a Eq.8 e, a seguir, integrando, tem-se: Ln S = Ln S0 k.t (Eq.9) (Eq.8)

Pela Eq.9 tem-se que a concentrao de substrato presente no meio reacional na condio de no saturao e baixa concentrao de substrato diminui exponencialmente com o tempo. Retornando Figura 3, observa-se que a reao vai gradualmente passando de uma cintica de 1 ordem (concentrao de substrato < S1) para uma de pseudo-ordem zero ( concentrao de substrato > S4). Para poder quantificar o trecho S1S4 , temos que considerar que na 2 fase (ver Figura 1) a (ES) permanece constante. Isto significa que d(ES)/dt =0 (Eq.10) A Eq. 10 pode ser interpretada como segue: Velocidade de formao do complexo = velocidade de decomposio do complexo Ou em linguagem literal: k1.(E).(S) = k2.(ES) + k3.(ES) rearranjando a Eq. 11, temos (E) = [(k2 + k3)/k1] x (ES)/(S) (Eq. 12) (Eq. 11)

Chamando a relao de constantes de velocidade [(k2 + k3)/k1] = KM, ento a Eq. 12 pode ser escrita como: (E) = [ KM . (ES)] (S) (Eq. 13)

Substituindo a Eq. 13 na Eq. 2 (isto possvel desde que as condies de reao preservem a plena capacidade cataltica da enzima) temos E0 = {[KM . (ES)/(S)] + (ES)} ou seja,

(ES) = {[S.E0 ] [S + KM]} Substituindo a Eq. 14 na Eq. 1, tem-se v = [k3.E0.(S)] [(S) + KM] ou finalmente, v = Vmax.(S)/[(S) + KM]

(Eq. 14)

(Eq. 15)

A equao 15 descreve completamente a curva hiperblica mostrada na Figura 3. Ou seja, durante a 2 fase da reao catalisada pela enzima (figura 1) pode-se dispor a cada instante da velocidade da reao frente a uma determinada concentrao de substrato. Na equao 15 aparecem Vmax e KM as chamadas constantes cinticas que caracterizam uma enzima, quando a catlise conduzida sob condies definidas de reao (pH, temperatura, agitao, concentraes dos reagentes, etc.). Estas constantes devem ser calculadas a partir de um quadro (Tabela 2) aonde se dispe a velocidade da reao medida experimentalmente frente s correspondentes concentraes iniciais de substrato. A Eq.15 pode ser escrita da seguinte forma: 1/v = (1/Vmax) + (1/S).(KM/Vmax) (Eq. 16)

A partir de um grfico (1/v) versus (1/S) calculam-se as constantes cinticas referidas. A respeito do KM deve-se lembrar de trs aspectos importantes: a) Quando KM = (S), ou seja, numericamente igual concentrao de substrato, a Eq. 15 se transforma em v = Vmax/2; b) KM serve de referencial para fixar a concentrao inicial de substrato Quando (S) for pelo menos 100 vezes maior que o KM a reao transcorre em condio de saturao; quando (S) for pelo menos 100 vezes menor que o KM a reao se d em condio no saturante -; c) KM uma caracterstica da enzima sob condies definidas de reao. Vamos analisar a 3 fase da reao catalisada por uma enzima. Esta a fase em que a concentrao de (ES) deixa de ser constante (Figura 1). Para equacionar esta fase, vamos reescrever a Eq. 15 da seguinte maneira: v = -(dS/dt) = Vmax/[1 + (KM/S)] rearranjando, - dS .[1 + (KM/S)] = Vmax.dt Integrando, t = [(S0 S) KM.Ln (S/S0)] Vmax (Eq. 19) (Eq. 18) (Eq. 17)

A Eq. 19 correlaciona o consumo de substrato com o tempo durante todo o perodo de durao da reao. A Eq. 19 pode ser modificada como segue: Definindo a converso (Y) como : Y = (S0 S)/S0 Rearranjando a Eq. 20, temos S = S0.(1 Y) Substituindo a Eq. 21 na Eq. 19, tem-se finalmente t = [Y.S0 KM . Ln (1 Y)] Vmax (Eq. 22) (Eq. 21) (Eq. 20)

A importncia prtica da Eq. 22 reside no fato de que uma dada converso pode ser estimada a partir de um tempo previamente estabelecido. 3.3. Expresso da atividade enzimtica A atividade enzimtica pode ser expressa de diferentes formas. No entanto, devese dar preferncia ao estabelecido pela Comisso Internacional de Bioqumica, que recomendou as seguintes definies: a) Uma unidade (U) de qualquer enzima aquela quantidade que catalisa a transformao de 1 mol de substrato por minuto sob condies definidas de reao; b) Um katal (kat) a quantidade de enzima que promove a converso de 1 mmol de substrato por segundo sob condies definidas de reao; c) A razo U/mg de protena chamada de atividade especfica; d) A razo U/mol de enzima chamada de atividade molecular. 4. Fatores que Afetam a Atividade Enzimtica Grosso modo, uma macromolcula de enzima pode ser dividida em duas partes, a saber, o microambiente do stio ativo e o resto da molcula. No preciso dizer que a atividade enzimtica tima ocorre quando as condies reacionais no afetam significativamente a estrutura da molcula. As condies reacionais a serem consideradas seriam aquelas relacionadas a fatores fsico-qumicos (pH, temperatura, fora inica, atividade de gua, etc.), qumicos (substncias ativadoras, desativadoras, estabilizantes e inibidores) e fsicos (fora de cisalhamento, presso).

4.1. Fatores fsico-qumicos 4.1.1. pH

Este fator tem uma ao generalizada sobre as reaes em geral, influindo na velocidade de reao, posio do equilbrio, no grau de ionizao, dissociao e/ou solubilidade dos reagentes. No caso das enzimas acrescentam-se os efeitos sobre a estabilidade e os valores das constantes cinticas (Vmax e KM). A atividade enzimtica afetada pelo pH, porque ele interfere no grau de ionizao dos aminocidos constituintes da protena. A forma em sino da curva pH versus atividade indica o efeito gradual do pH sobre a estrutura da macromolcula. Ao se sobrepor as curvas pH versus atividade e pH versus estabilidade possvel determinar o valor do pH acima do qual ocorre a desnaturao da protena. 4.1.2. Temperatura A temperatura exerce efeito generalizado no andamento de uma reao, influindo na solubilidade dos reagentes, na velocidade global da reao e, no caso das enzimas, afeta as constantes cinticas e a estabilidade. Segundo a lei de Vant Hoff, frente a um aumento de 10 C na temperatura a velocidade da reao dobra, porm no caso das enzimas pode ser at mais que o dobro. muito difcil estabelecer uma temperatura tima para a ao de uma enzima, porque a macromolcula est submetida aos eventos simultneos da ativao e da desnaturao. Devido coexistncia ativao/desnaturao, o tempo durante o qual a enzima submetida a uma dada temperatura torna-se um fator importante na sua estabilidade. O efeito da temperatura na vida de prateleira da enzima, tambm, um aspecto importante a ser considerado, pois um mesmo preparado enzimtico mantido a diferentes temperaturas apresenta perda de atividade diferenciada. Modificaes introduzidas na estrutura molecular da enzima, quer por via qumica (engenharia de protenas) quer por modificao gentica da fonte (biologia molecular), com a finalidade de torn-la mais ou menos termoestvel um objetivo dos fabricantes de enzimas industriais. 4.1.3. Outros Apenas a ttulo de lembrana, citam-se os efeitos: a) fora inica relacionada concentrao de ons presentes no meio reacional e que pode afetar a solubilidade e a ionizao dos grupos ionizveis presentes nas cadeias laterais dos aminocidos constituintes da enzima; b) Atividade de gua, ou seja, o teor de gua existente no meio reacional, que poder interferir na intensidade e no mecanismo cataltico da enzima. A atividade de uma enzima pode ser severamente diminuda em ambiente de baixo teor de gua ou, caso a enzima catalise uma hidrlise, o seu mecanismo de ao poder deixar de ser hidroltico e passar a ser transfersico (ao invs de romper uma ligao passa a formla).

4.2. Fatores qumicos Os fatores qumicos, ao contrrio dos fatores fsicos e/ou fsico-qumicos, atuam sobre uma regio especfica da macromolcula, por exemplo, no stio ativo.

4.2.1. Ativadores/Desativadores O ativador uma substncia, muitas vezes um on, que aumenta a atividade da enzima e que pode ser um elemento integrante da macromolcula (se for de natureza orgnica chamado de grupo prosttico) ou estar solubilizado no meio reacional e se unir enzima somente no momento da catlise (ou seja, na presena do substrato. Neste caso, tem-se a coenzima, se o composto for orgnico). 4.2.2. Estabizadores A presena do substrato, em geral, estabiliza a enzima, sobretudo frente temperatura. Por exemplo, em preparados enzimticos lquidos s vezes so acrescentados substratos modificados. Assim, amilases podem ser estabilizadas com amido hidrolisado, as proteases com peptdeos. Nos casos em que a enzima pode catalisar a reao P S, o produto, tambm, pode estabilizar a enzima. S que neste caso se torna um problema a eliminao da atividade da enzima no final do processo. H casos em que o on metlico, alm de ativador, atua como agente estabilizador (por ex., o Ca+2 estabiliza a -amilase). 4.2.3. Inibidores Os inibidores so substncias especficas que, em baixas concentraes, diminuem a velocidade da reao enzimtica. Atuam no nvel do stio ativo ou de stios auxiliares, sem prejudicar a estrutura terciria e/ou quaternria da protena, ao contrrio do que fazem os reagentes qumicos inespecficos (lcali, cido, sais, uria, detergentes). Do ponto de vista industrial importante ter conscincia de que o inibidor reduz a eficincia cataltica da enzima. Evit-lo a maneira correta. Os principais tipos de inibidores so: a) irreversvel: liga-se molcula da enzima atravs de ligao covalente, inutilizando-a por completo; b) reversvel: liga-se molcula da enzima atravs de ligaes no covalentes, de tal sorte que seu efeito pode ser revertido ao usar-se uma concentrao adequada de substrato. Existem trs tipos bsicos de inibidores reversveis, a saber, competitivo o substrato e o inibidor disputam o stio ativo da enzima e dependendo da concentrao relativa entre eles o efeito inibitrio pode ser reduzido ou at eliminado; em outras palavras, eles se excluem mutuamente -, no competitivo inibidor e substrato no se excluem mutuamente, porque se ligam em pontos diferentes da molcula da enzima e incompetitivo, o inibidor s se liga enzima aps o substrato ter se introduzido no stio ativo, ou seja, o inibidor se liga diretamente no complexo enzima-substrato.

4.3. Fatores fsicos Merecem lembrana os fatores que podem prejudicar de maneira inespecfica a estrutura da molcula enzimtica atravs de efeitos puramente mecnicos, como as foras

de cisalhamento resultantes da agitao mecnica do meio de reao e a presso interna do compartimento (reator) dentro do qual a catlise se processa. 5. Termodinmica da Catlise Enzimtica A enzima - como qualquer outro catalisador - facilita a ocorrncia da reao, diminuindo a energia necessria para as molculas reagentes atingirem o estado de transio. No entanto, o mecanismo cataltico de uma enzima envolve sempre a formao do complexo intermedirio enzima-substrato, que uma forma estvel da enzima. Assim sendo, do ponto de vista da diminuio da barreira energtica para alcanar o estado intermedirio, a reao catalisada pela enzima deveria parar no ponto em que o complexo intermedirio se formou. Porm, hodiernamente se verifica que a reao enzimtica continua adiante para liberar a enzima e gerar o produto. Explica-se este resultado, levando em conta o somatrio das instabilidades no seio do complexo intermedirio, que surgem em decorrncia do ntimo contato entre as molculas do substrato e as de enzima. Em conseqncia, incompatibilidades eletrostticas, hidrofbicas, dentre outras, entre grupos qumicos do substrato e da enzima levam desestabilizao do complexo, que ao se desfazer, acaba liberando a enzima e o produto formado. Acrescenta-se, tambm, que a entropia do sistema diminui medida que o complexo ES vai se acumulando no sistema reacional (lembra-se que o complexo uma forma mais estruturada e, por isso, mais organizada do que quando o substrato e a enzima esto separados). Esta diminuio de entropia, associada s alegadas instabilidades internas do complexo ES, fazem com que a reao enzimtica chegue ao trmino. 6. Referncias GODFREY, T., WEST, S. Industrial Enzymology. 2nd Edition, New York: Stockton Press, 1996. 609p. AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A. Biotecnologia Industrial. So Paulo, Edgard blucher Ltda, vols. 1,2,3 e 4. 2001. SAID, S., PIETRO, R.C.L.R. enzimas como agentes biotecnolgicos. Leggis Summa, Ribeiro Preto, SP, 2004.