Enzimas

Estrutura, Função e Cinética Enzimática

 Enzimas: Introdução
As enzimas são unidades fundamentais do metabolismo
celular, e participam de reações onde as moléculas de
nutrientes (proteínas, açúcares, lipídeos) são degradadas e
a energia química é conservada e transformada em ATP
(processos catabólicos).

Também devido à ação das enzimas, as macromoléculas

biológicas (proteínas, açúcares, lipídeos) são sintetizadas
a partir de precursores simples (processos anabólicos).
 Enzimas: Catalisadores
As enzimas agem como catalisadores biológicos.
Catalisador é uma substância que em geral aumenta a
velocidade de uma reação química e que não se altera
neste processo.
As enzimas, portanto, são proteínas especializadas, com
extraordinária força catalítica, e alto grau de
especificidade por seus substratos.

Mas as enzimas não são as únicas biomoléculas com

atividade catalítica. Também alguns tipos de RNA tem
capacidade catalítica e participam da biossíntese de
proteínas nos ribossomas (processo de tradução).
Principais Enzimas na Digestão do Homem
 Histórico resumido:

Em 1850, Pasteur verificou que a fermentação do

açúcar em álcool pelas leveduras era catalisada
por “fermentos” e concluiu que eles eram
inseparáveis da estrutura das células vivas.

Em 1897, Eduard Buchner extraiu das leveduras

as enzimas que transformam açúcar em álcool,
demonstrando que as enzimas podem
continuar funcionando depois de removidas
das células vivas.

Em 1930, nos EUA, John Northrop cristalizou a tripsina e

a pepsina e determinou que elas eram proteínas.
 Propriedades Gerais das Enzimas
As velocidades de reações catalisadas por enzimas são
106 a 1012 vezes maiores do que as reações
correspondentes não-catalisadas.

As reações catalisadas enzimaticamente ocorrem em

condições reacionais mais brandas: temperaturas
inferiores a 100° C, pressão atmosférica e pH quase
neutro (ocorrem dentro dos organismos vivos).

Em geral, uma catálise química eficiente requer

temperaturas e pressão elevadas, assim como valores de
pH extremos (muito ácidos ou muito básicos), pois
ocorrem fora dos seres vivos (ex: em indústrias).
 Propriedades Gerais das Enzimas
Maior especificidade da reação: as enzimas apresentam
um grau de especificidade imensamente maior do
que os catalisadores químicos (ou sintéticos) em
relação à identidade de seus substratos (reagentes) e
dos seus produtos. As reações enzimáticas, ao
contrário das reações com catalisadores químicos,
poucas vezes produzem subprodutos.

Capacidade de regulação: as atividades catalíticas de

muitas enzimas variam em resposta às
concentrações de outras substâncias que não os
seus substratos. Os mecanismos desses processos
regulatórios incluem o controle alostérico, a
modificação covalente de enzimas e a variação na
quantidade de enzimas sintetizadas. As reações com
catalisadores químicos não podem ser controladas.
Reações Enzimáticas: Energia de Ativação

As enzimas catalisam
reações por meio da redução
da energia livre de ativação
(G*), a energia livre
necessária para atingir o
estado de transição, isto é, o
ponto de energia livre mais
elevada da reação.

Quanto maior for o valor de (G*), menor será a

velocidade da reação, porque menor será o número de
moléculas de reagentes com energia térmica necessária
o suficiente para alcançar a energia livre do estado de
transição (o pico do gráfico).
 Reação Catalisada x Reação
Não-Catalisada
Uma reação catalisada
(enzimática ou
quimicamente) é bem mais
rápida que uma reação não-
catalisada, pois a variação
de energia livre (G) é
menor. Ela é mais eficiente e
ocorre em menos tempo,
com menor gasto de energia.

Já a reação não-catalisada é menos eficiente e mais

demorada, com um maior gasto de energia devido a uma
variação de energia livre (G) maior.
 Nomenclatura das Enzimas
Os nomes das enzimas são dados, segundo Duclaux
(1833), adicionando-se o sufixo ASE à substância
sobre a qual a enzima é ativada.

Apesar desse sistema prático ser ainda usado no

presente, essa regra nem sempre foi obedecida,
principalmente na classificação de algumas proteases
(pepsina, tripsina, quimiotripsina, trombina).

Essa terminologia não especifica o tipo de

transformações sofridas pelo substrato. Por isso, em
certos casos, preferiu-se indicar os tipos de reações
catalisadas e daí os nomes DESIDROGENASE,
DESCARBOXILASE, OXIDASE.
 Nomenclatura das Enzimas
No entanto, com a descoberta de grande número de
enzimas, houve necessidade de estabelecer um critério
uniforme que simultaneamente descreve com precisão as
reações catalisadas. No seio da União Internacional de
Química surgiu uma Comissão Internacional de Enzimas
(E.C.) que propôs um código, em 1961, que divide as
enzimas em 6 grandes grupos:
 Nomenclatura das Enzimas
A cada enzima é atribuído um código numérico:
Enzima ATPase (Adenosinatrifosfatase): 3.6.1.3
- é uma hidrolase....................................3
- atua num anidrido................................3.6
- o anidrido contém fosfato....................3.6.1
- esse anidrido é ATP............................3.6.1.3

E.C. 3.6.1.3: ATPase

O primeiro dígito (3) denota o nome da classe (hidrolase);
O segundo dígito (6) designa a subclasse da enzima, ou
seja, onde ela atua (em um anidrido);
O terceiro dígito (1) indica a presença do fosfato;
O quarto dígito (3) determina que o anidrido presente é a
adenosina trifosfato (ATP).
 Atividade Catalítica: o Sítio Ativo
O sítio ativo da enzima é o local na molécula da enzima
onde ocorre a transformação química, ou seja, a catálise
enzimática de um substrato. Ele ocupa uma parte
pequena do volume total de uma enzima. Devido a este
fato, a maioria dos grupamentos da cadeia lateral dos
aminoácidos em uma enzima não está em contato com o
substrato.
O sítio ativo é uma entidade
tridimensional formada por
grupamentos que vêm de
diferentes partes da
seqüência linear de
aminoácidos (a estrutura
primária original).
 Atividade Catalítica: o Sítio Ativo
Sítios ativos são fendas ou frestas nas enzimas. A água é
geralmente excluída, uma vez que sua capacidade de
enfraquecer ligações fracas atrapalharia a ligação da E
com o S. O caráter apolar da maior parte da fenda melhora
a ligação do substrato.
Os substratos (S) são ligados as enzimas por atrações
fracas múltiplas. Estas interações fracas (portanto
reversíveis) são do tipo hidrofóbicas, ligação de H, forças
iônicas e forças de Van der Waals.
Se o substrato se ligasse a enzima por interações fortes
(tipo covalente), após a transformação em produto este
permaneceria ligado a enzima, e ela não estaria disponível
para continuar agindo em outras moléculas do substrato.
Modelos de Interação Enzima-Substrato

Para caber dentro do sítio ativo, um substrato deve ter um

formato correspondente a ele. Emil Fischer (1890) criou a
metáfora do modelo chave-fechadura, onde o centro ativo
da enzima não ligada tem formato complementar ao do S.
 Modelos de Interação Enzima-Substrato
No entanto, está evidente agora que os formatos dos sítios
ativos de muitas enzimas são modificados pela ligação
do substrato, quando então a enzima sofre uma mudança
conformacional para se adaptar a forma do S.

O sítio ativo destas

enzimas só assume
um formato
complementar ao do S
depois que o S estiver
ligado, num processo
de reconhecimento
dinâmico chamado de
modelo do encaixe
induzido.
 Efeito da Temperatura na Atividade
Enzimática
Em relação à temperatura, a intensidade da ação das
enzimas duplica ou triplica a cada 10° C que se eleva e
vice-versa.

O ponto ótimo da ação de

diversas enzimas (ponto de
máxima velocidade) pode ser
afetado pelo aumento
excessivo da temperatura
como também, devido à
modificação do pH
necessário do meio.
 Efeito da Temperatura na Atividade
Enzimática
A queda brusca no gráfico após certo ponto ocorre devido à
desnaturação da enzima. Isso faz com que a molécula
protéica desenrole devido a quebra das ligações S-S e
outras ligações que tornavam a estrutura polipeptídica
enrolada como um novelo.

Esse fato ocorre devido ao

excesso de calor ou pela
ação de ácidos e bases
fortes. Desta forma, as
enzimas perdem sua ação
de forma irreversível.
Efeito do Excesso de Temperatura na
Estrutura de uma Enzima
 Efeito do pH na Atividade Enzimática
As enzimas têm um pH ótimo (ou um intervalo de pH) no
qual a sua atividade é máxima. Em um pH maior ou
menor, a atividade diminui.
As cadeias laterais dos aminoácidos do sítio ativo
podem atuar como ácidos e bases fracas com funções
críticas que dependem da manutenção das suas cargas.
Também em algum lugar da proteína, as cadeias laterais
ionizadas podem desempenhar um papel essencial nas
interações que mantêm a estrutura da enzima.
Portanto, alterações do pH podem afetar e modificar a
carga de aminoácidos críticos no sítio ativo e outros
essenciais para a conformação estrutural da enzima.
 Efeito do pH na Atividade Enzimática
O pH ótimo para a atividade de uma enzima geralmente
reflete o ambiente onde a enzima é normalmente encontrada.

A pepsina hidrolisa certas ligações

peptídicas das proteínas durante a
digestão no estômago. Seu pH ótimo é
cerca de 1,6 e o pH do suco gástrico é
da ordem de 1 a 2.
A glicose-6-fosfatase dos hepatócitos
(células do fígado) tem um pH ótimo
de cerca de 7,8 e é responsável pela
liberação da glicose no sangue. O pH
normal do citossol dos hepatócitos é
cerca de 7,2.
Cinética Enzimática
 Modelo de Michaelis-Menten
Um dos principais fatores que afetam a velocidade de uma
reação in vitro, catalisada por uma enzima purificada, é a
concentração do substrato [S].

Uma abordagem simplificada em experimentos cinéticos é

medir a velocidade inicial da reação, designada por Vo,
quando [S] é geralmente muito maior que a concentração
da enzima [E].

O modelo de Michaelis-Menten explica as propriedades

cinéticas da maioria das enzimas.
Gráfico e a Equação de Michaelis-Menten
Examinando o efeito da [S] na velocidade inicial de uma
reação enzimática, quando a [E] é mantida constante,
obtemos um gráfico hiperbólico.

VMax --------------------
KM

O platô é chamado de velocidade máxima (VMax), onde a E

está saturada de S e não pode funcionar mais rápido.
 O KM: Constante de Michaelis-Menten

Michaelis e Menten definiram uma constante (KM) que

estabelece a relação precisa entre [S] e a velocidade da
reação enzimática. Conhecendo os valores de KM e VMax,
podemos calcular a velocidade da reação em qualquer [S].

O KM ou constante de Michaelis é a concentração de S na

qual uma E produz metade de sua velocidade máxima. É
uma constante de afinidade da E pelo seu S.

Observe que não se pode obter o valor preciso da VMax no

gráfico hiperbólico de Vo x [S], pois a curva aproxima-se
da VMax sem nunca atingi-la. Como então obter o valor
exato da VMax?
Gráfico e a Equação de Lineaweaver-Burk
Obtém-se o valor preciso da VMax no gráfico “duplo-
recíproco”, obtido através de uma transformação
algébrica da equação de Michaelis-Menten.

As enzimas que obedecem exatamente a equação de

Michaelis-Menten dão uma linha reta quando lançamos o
gráfico de 1/ Vo contra 1/[S].

-1/VMax
Gráfico e a Equação de Lineaweaver-Burk
O gráfico do “duplo-recíproco” ou de Lineaweaver-Burk
permite a determinação precisa da VMax, o que só
poderia ser feito aproximadamente num gráfico
hiperbólico de Vo x [S].

-----------------
 Inibições Enzimáticas

Os inibidores das enzimas são moléculas que interferem

com a catálise, diminuindo ou interrompendo as reações
enzimáticas. São representados por [ I ].

Por exemplo, a aspirina (acetilsalicilato ou ácido acetil

salicílico- AAS) inibe reversivelmente a enzima que
catalisa o primeiro passo na síntese das
prostaglandinas, compostos envolvidos em muitos
processos, incluindo alguns que produzem a sensação
de dor e febre.

Existem duas grandes classes de inibidores enzimáticos:

os irreversíveis e os reversíveis.
 Inibições Enzimáticas
Vários medicamentos importantes são inibidores de
enzimas. Por exemplo, a sinvastatina (droga da classe
das estatinas) inibe a ação de uma das enzimas de
biossíntese do colesterol (HMG-CoA redutase), e é
usada para diminuir os níveis deste lipídeo no sangue.

O captopril é um inibidor da enzima (metaloprotease)

conversora de angiotensina (ACE) e é uma droga
usada para regular a pressão arterial.

O crixivan, uma droga inibidora da enzima protease do

vírus HIV, é usada no tratamento da AIDS. A enzima
cliva proteínas virais e seu bloqueio impede
completamente o vírus de ser infeccioso.
 Inibidores Irreversíveis
Inibidores irreversíveis são aqueles que se combinam com
um grupo funcional na molécula da E ou o destroem ou
ainda formam uma associação covalente bastante estável.

A Penicilina, o primeiro antibiótico descoberto, inibe o

crescimento bacteriano, pois interfere com a síntese da
parede celular. Ela atua bloqueando a última etapa
enzimática da síntese da parede celular bacteriana, onde
ocorre a interligação de diferentes cadeias de
peptideoglican (o principal componente da parede celular).

Estes inibidores são uma ferramenta importante na pesquisa

das enzimas e na farmacologia.
O Peptideoglican da Parede Celular
Bacteriana
 Inibidores Reversíveis: Inibidor
Competitivo
Os inibidores reversíveis podem ser de três tipos:
competitivos, incompetitivos ou mistos.

O inibidor competitivo compete com o substrato pelo sítio

ativo da enzima, e uma vez ligado não pode ser
transformado pela enzima. Este inibidor geralmente tem
estrutura tridimensional parecida com o substrato.

A inibição competitiva é
revertida ou diminuída pelo
simples aumento na
concentração de substrato.
 Inibidores Competitivo e Misto

O inibidor competitivo compete com o substrato pelo sítio

ativo da enzima.

Um inibidor misto (ou não-competitivo) liga-se a outro

sítio na enzima, não ao ativo ativo.
Inibidores Misto (Não-Competitivo)
e Incompetitivo

Um inibidor misto se liga a um sítio

diferente do sítio ativo da enzima, mas
ele pode se ligar tanto a enzima livre
(E) como ao complexo enzima-
substrato (ES).

O inibidor incompetitivo liga-se à E

em um local diferente do sítio ativo,
mas liga-se apenas ao complexo ES.
Ele causa uma mudança da
conformação da E, produzindo uma
inativação reversível do sítio
catalítico (ou ativo).
 Enzimas Alostéricas
As enzimas alostéricas são as que não obedecem à cinética
de Michaelis-Menten. Elas exibem gráficos sigmóides, em
vez dos gráficos hiperbólicos previstos pela equação de
Michaelis-Menten (gráfico de Vo x S).

A atividade da enzima alostérica pode ser alterada por

moléculas reguladoras que se ligam a locais que não os
sítios catalíticos, denominados sítios reguladores.
 Enzimas Alostéricas
A atividade catalítica das enzimas alostéricas é
modificada por pequenas moléculas, os moduladores
positivos (efetores) que aumentam a atividade da
enzima, ou ainda por moduladores negativos, que
inibem e diminuem a atividade da enzima.

As enzimas alostéricas são as enzimas regulatórias

encontradas nas vias metabólicas.

Elas controlam a velocidade das vias catabólicas e

anabólicas, controlando indiretamente a velocidade das
enzimas Michaelianas, as quais são encontradas em
maior número nas vias metabólicas e não possuem por
si só nenhum mecanismo de controle catalítico.
 Inibição por Retroalimentação ou
Feedback
Em muitos sistemas metabólicos (isto é, sistemas
multienzimáticos), a enzima reguladora é inibida
especificamente pelo produto final da via. Isto acontece
sempre que a concentração deste produto exceder as
necessidades celulares.

No exemplo abaixo, o produto final da via (X), quando em

excesso, inibe a enzima reguladora da velocidade da via.

*
A→B→C→D→X *enzima alostérica
O aumento na concentração do produto final da via
basicamente desacelera toda a via. Geralmente, a enzima
reguladora em uma via metabólica é a que catalisa a
primeira reação da via.
 Estratégias Regulatórias
Um organismo deve poder regular as atividades das suas
enzimas para que ele possa coordenar seus processos
metabólicos, responder às mudanças no meio, crescer e
diferenciar-se, tudo de maneira ordenada. Há duas
maneiras pelas quais isto pode ocorrer:

Controle da disponibilidade da enzima: a quantidade de

uma dada enzima em uma célula depende das suas
velocidades de síntese e degradação. Estas velocidades
são controladas pela célula.

Controle da atividade da enzima: a atividade catalítica de

uma enzima pode ser diretamente regulada por meio de
alterações estruturais que influenciem a afinidade da
ligação do S à E. Há 3 modos deste controle: controle
alostérico, modificação covalente e ativação proteolítica.
 Modificação Covalente
A modificação covalente envolve a fosforilação ou
defosforilação de resíduos específicos de aminoácidos
(Ex: Ser, Thr, Tyr) na enzima.
A enzima glicogênio fosforilase, que controla a quebra do
glicogênio muscular e hepático, ocorre de duas formas:
fosforilase a (forma mais ativa) e fosforilase b (forma
pouco ativa).
O controle da sua atividade catalítica é dado seja pela
fosforilação seja pela defosforilação reversível de dois
resíduos de aminoácidos na cadeia lateral: quando os
resíduos de Ser são fosforilados (recebem fosfato), a
enzima passa para a forma mais ativa, fosforilase a;
quando os resíduos de Ser são defosforilados (perdem
fosfato), a enzima passa para sua forma menos ativa.
Modificação Covalente
 Ativação Proteolítica
A ativação proteolítica envolve a ação de uma outra
enzima: assim, uma proteína precursora inativa é
transformada em uma proteína ativa, por clivagem
(quebra) de ligação peptídica.

O hormônio insulina é secretado na forma de um precursor

inativo, a pró-insulina, que é ativado por remoção
proteolítica de um peptídeo
 Ativação Proteolítica: Coagulação
Sanguínea
Outro exemplo importante de ativação proteolítica é a
coagulação sanguínea, que envolve uma cascata de
reações controladas em seqüência, onde precursores
inativos (zimogênios ou pró-enzimas) são ativados e
catalisaram a ativação dos próximos zimogênios.

O resultado será a transformação

do fibrinogênio solúvel no plasma
em um coágulo de fibrina, por ação
da trombina (enzima proteolítica).
Coagulação Sanguínea

A ativação proteolítica,
em contraste com o
controle alostérico e
as modificações
covalentes reversíveis,
pode ocorrer somente
uma vez na vida de
uma enzima.
Fim