Introdução

Praticamente todas as reações no corpo são mediados por enzimas – proteínas

catalisadoras que aumentam a velocidade das reações sem serem, elas próprias, alteradas
neste processo. Entre as muitas reações biológicas que são energeticamente possíveis, as
enzimas canalizam seletivamente os reatantes (denominados substratos) para rotas úteis.
Assim, as enzimas dirigem todos os eventos metabólicos.
Este trabalho de pesquisa pretende mostrar, em um abordagem sucinta e didática, a
natureza destas moléculas catalíticas e seu mecanismo de ação.

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 Enzimas
I – Histórico
Era já sabido, entre o final do século XVII e início do século XVIII, que secreções
estomacais eram capazes de digerir a carne; era também conhecida a conversão de amido a
açúcares pela saliva e extratos vegetais. O mecanismo subjacente a estas transformações
não era, no entanto, conhecido.
As enzimas foram descobertas no século XIX, aparentemente por Pasteur, que
concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura é catalisada por fermentos.
Ele postulou que esses fermentos (as enzimas) eram inseparáveis da estrutura das células
vivas do levedo. Pasteur declarou que "a fermentação alcoólica é um ato correlacionado
com a vida e organização das células do fermento, e não com a sua morte ou putrefação".
Em 1878, Wilhelm Kühne empregou pela primeira vez o termo "enzima" para
descrever este fermento, usando a palavra grega ενζυμον, que significa "levedar". O termo
passou a ser mais tarde usado apenas para as proteínas com capacidade catalítica, enquanto
que o termo "fermento" se refere à atividade exercida por organismos vivos.
Em 1897, Eduard Buchner descobriu que os extratos de levedo podiam fermentar o
açúcar até álcool e provou que as enzimas envolvidas na fermentação continuavam
funcionando mesmo quando removidas das células vivas. Esta descoberta valeu-lhe o
prêmio Nobel de Química em 1907.
Restava determinar qual a natureza dos enzimas. Alguns afirmavam que as
proteínas, associadas à atividade enzimática, apenas eram o suporte do verdadeiro enzima,
e, por si próprias, incapazes de catálise. Em 1926, James B. Sumner purificou e cristalizou
a urease, mostrando tratar-se de uma proteína pura, e fez o mesmo, em 1937, para a
catalase. A prova final foi feita por Northrop and Stanley em 1930, com o estudo de três
enzimas digestivas, a pepsina, a tripsina e a quimiotripsina, pelo que receberam o Prêmio
Nobel da Química em 1946.
J.B.S. Haldane escreveu um tratado intitulado “Enzimas”, onde continha a notável
sugestão de que as interações por ligações fracas, entre a enzima e seu substrato, poderiam
ser usadas para distorcer a molécula do substrato e catalisar a reação.
A cristalização de enzimas purificadas permitiu que as suas estruturas moleculares
pudessem ser examinadas por cristalografia de raios X, o que aconteceu primeiro com a
lisozima, um enzima que ocorre na saliva, lágrimas e na clara de ovo e destrói a parede
celular de bactérias, em 1965. Começaram assim a bioquímica e biologia estruturais, que se
esforçam por compreender o funcionamento dos enzimas a nível atômico.
A tentativa de compreender o mecanismo da catálise enzimática a nível quântico
tem sido facilitada recentemente pelo aumento de capacidade aritmética dos computadores.

II – Conceito
Enzima é uma molécula protéica que funciona como catalizador biológico,
acelerando praticamente todas as reações químicas que ocorrem nos seres vivos; sem elas, o
processo da vida seria impossível. Operam mediante uma espécie de mecanismo de “chave
e fechadura”, no qual só determinadas moléculas se prendem a uma dada enzima,
ocorrendo então, a reação que combina, modifica ou decompõe as moléculas.

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III – Nomenclatura das Enzimas
Cada enzima recebe dois nomes, o primeiro é seu nome curto ou nome
recomendado, conveniente para o uso no dia-dia. O segundo é o nome sistemático, mais
completo, o qual é usado quando a enzima deve ser identificada sem ambigüidade.

 Nome Recomendado
Os nomes enzimáticos usados mais comumente têm o sufixo “ase” unido ao substrato
da reação (glicosidase, urease, sacarase), ou uma descrição da ação realizada (lactato
desidrogenase e adenilato ciclase). Algumas enzimas retêm seus nomes triviais
originais, que não fornecem indicações sobre a reação enzimática associada (tripsina e
pepsina).

 Nome Sistemático
A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) desenvolveu um
sistema de nomenclatura no qual as enzimas são divididas em seis classes principais,
cada qual com numerosos subgrupos. O sufixo “ase” é unido a uma descrição
razoavelmente completa da reação química catalisada, por exemplo, D-gliceraldeído 3-
fosfato: NAD oxirredutase. Os nomes do UIBMB são preciosos e informativos, mas
algumas vezes são muito convenientes para ser de uso geral.

IV – Classificação das Enzimas

As enzimas podem ser classificadas de acordo com vários critérios. O mais
importante foi estabelecido pela União Internacional de Bioquímica (IUB), e estabelece seis
classes (Fig. 01):

 Oxidorredutases: catalisam reações de transferência de elétrons, ou seja, reações de

oxiredução. Ex.: Desidrogenases e as Oxidases

 Transferases : catalisam reações de transferência de grupamentos funcionais, como

grupos: amina, fosfato, acil, carboxil, etc. Ex.: Quinases e as Transaminases

 Hidrolases : catalisam reações de hidrólise de ligação covalente. Ex.: Peptidades

 Liases: catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água,

amônia e gás carbônico. Ex.: Dehidratases e as Descarboxilases.

 Isomerases: catalisam reações de interconversão entre isômeros ópticos ou

geométricos. Ex.: Epimerases.

 Ligases: catalisam reações de formação e novas moléculas a partir da ligação entre duas
já existentes, sempre às custas de energia (ATP). Ex.: Sintetases.

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Fig.01_ Exemplos das seis principais classes da classificação internacional das enzimas (TF é tetraidrofolato).

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V – Propriedades das Enzimas
Enzimas são catalisadores protéicos que aumentam a velocidade de uma reação
química e não são consumidos durante a reação que catalisam. Alguns tipos de RNA
podem agir como enzimas, geralmente catalisando a clivagem e síntese das ligações das
ligações fosfodiéster; os RNAs com atividade catalítica são denominados ribozimas, e são
encontrados muito menos freqüentemente que os catalisadores protéticos.

 Sítios Ativos
As moléculas de enzimas contêm um bolsão ou fenda especial, denominado sítio ativo,
que contêm aminoácidos cujas cadeias laterais criam uma superfície tridimencional
complementar ao substrato (Fig. 02). O sítio ativo liga-se ao substrato, formando um
complexo enzima-substrato (ES), que é convertido em enzima-produto (EP), que
subseqüente dissocia-se em enzima e produto.

 Eficiência Catalítica
A maioria das reações catalisadas por enzimas são altamente eficientes, ocorrendo de
103 à 108 vezes mais rápido que as reações não-catalisadas. Geralmente, cada molécula
de enzima é capaz de transformar 100 a 1.000 moléculas de substrato em produto a cada
segundo. O número de moléculas substrato convertidas em produto por moléculas de
enzima por segundo é denominado número de turnover.
 Especificidade
As enzimas são altamente específicas, interagindo com um ou alguns substratos
específicos e catalisando somente um tipo de reação química.

 Cofatores
Algumas enzimas se associam a um cofator não- protéico que é necessário para a
atividade enzimática. Os cofatores comumente encontrados incluem íons metálicos
(Zn+2, Fe+2) e moléculas orgânicas, conhecidas como coenzimas, que são
freqüentemente derivadas de vitaminas (NAD+, FAD, coenzima A). Holoenzima
refere-se à enzima com seu cofator. Apoenzima refere-se à porção protéica da
holoenzima. Na ausência do cofator apropriado, a apoenzima geralmente não mostra
atividade biológica. Um grupo prostético é uma coenzima fortemente ligada que não
se dissocia da enzima (por exemplo, a biotina das carboxilases).

 Regulação
A atividade enzimática pode ser regulada, isto é, as enzimas podem ser ativadas ou
inibidas de modo que a velocidade de formação do produto responda às necessidades da
células.

 Localização dentro da célula

Muitas enzimas estão localizadas em organelas específicas dentro da célula (Fig. 03).
Esta compartimentalização serve para isolar da reação ou produto de outras reações
competivas, para fornecer um ambiente favorável para a reação e para organizar as
milhares de enzimas presentes na célula em rotas úteis.

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Fig.02_ Representação esquemática de uma enzima com o sítio ativo ligando-se a molécula de substrato.

Fig.03_ Localização intracelular de algumas rotas bioquímicas importantes.

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VI – Como funcionam as Enzimas
O mecanismo da ação enzimática pode ser visto de duas perspectivas diferentes. A
primeira aborda a catálise em termos de alterações de energia que ocorrem durante a
reação, onde as enzimas fornecem uma rota de reação alternativa, energeticamente
favorável, diferente da reação não-catalisada. A segunda descreve como o sítio ativo facilita
quimicamente a catálise.

 Alterações de Energia que ocorrem durante a reação

Quase todas as reações químicas têm uma barreira de energia separando os reatantes e
produtos. Esta barreira, denominada energia livre de ativação, é a diferença entre a
energia dos reatantes e um intermediário de alta energia que ocorre durante a formação
do produto. Por exemplo, a Fig. 04 mostra as alterações na energia durante a conversão
de uma molécula do reatante A ao produto B através do estado de transição T.

 Energia Livre de Ativação

Este pico de energia representa o estado de transição, no qual um intermediário de alta
energia é formado durante a conversão do reatante ao produto. Devido à grande energia
de ativação, a velocidade da reação química não-catalisada é freqüentemente mais lenta.

 Velocidade da Reação
Para as moléculas reagirem, devem conter energia suficiente para superar a barreira de
energia do estado de transição. Na ausência de uma enzima, somente uma pequena
quantidade de moléculas possui energia suficiente para atingir o estado de transição
entre reatante e produto; o número destas moléculas energizadas. Em geral, quanto
menor a energia livre de ativação, mais moléculas têm energia suficiente para superar o
estado de transição e, assim, mais rápida é a velocidade de reação.

 Rota Alternativa de Reação

Uma enzima permite que uma reação ocorra rapidamente sob condições normais na
célula, oferecendo uma rota de reação alternativa com uma menor energia livre de
ativação. A enzima não altera as energias livres dos reatantes ou produtos e, assim, não
altera o equilíbrio da reação.

Fig.04_ Efeito da concentração do

substrato na velocidade de reação.

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 Química do Sítio Ativo
O sítio ativo não é um receptácu/cular complexa empregando uma diversidade de
mecanismo químicos para facilitar a conversão do substrato em produto. Uma série de
fatores são responsáveis pela eficiência catalítica das enzimas, incluindo as seguintes:

 Estabilização do Estado de Transição

O sítio ativo freqüentemente atua como um molde molecular flexível que se liga ao
substrato em uma geometria estruturalmente semelhante ao estado de transição ativado
da molécula (T*; topo da curva na Fig. 04). Estabilizando o substrato em seu estado de
transição, a enzima aumenta grandemente a concentração do intermediário reativo que
pode ser convertido em produto, e assim acelera a reação.

 Outros fatores
O sítio ativo fornece grupos catalíticos que aumentam a probabilidade de se formar o
estado de transição. Em algumas enzimas, estes grupos podem participar na catálise
ácido-básica geral, na qual os resíduos de aminoácidos dão ou aceitam prótons. Em
outras enzimas, a catálise pode envolver a formação transitória de um complexo
covalente enzima-substrato.

 Visualização do Estado de Transição

A conversão do substrato em produto catalisada por enzimas pode ser comparada à
remoção de um suéter de um bebê que não quer cooperar (Fig. 05). O processo possui
uma elevada energia de ativação, pois a única estratégia razoável para remover a roupa
(exceto rasgá-la) requer a suspensão aleatória da criança de modo que ambos os braços
fiquem completamente estendidos acima da cabeça (uma posição improvável).
Entretanto, podemos visualizar um pai agindo como uma enzima, inicialmente entrando
em contato com o bebê (formando ES), e a seguir orientando os braços para uma
posição vertical e estendida, análoga ao estado de transição ES. Esta postura
(conformação) facilita a remoção do suéter, deixando o bebê sem blusa, que aqui
representa o produto. O substrato ligado à enzima (ES) está sob uma energia levemente
menor que o substrato não-ligado (S) e explica a pequena “queda” na curva em ES.

Fig.05_ Representação esquemática nas alterações de energia que acompanha a formação do complexo
enzimático substrato e a formação de um complexo no estado de transição.

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VII – Fatores que Afetam a Velocidade de Reação
As enzimas podem ser isoladas das células e ter suas propriedades estudadas em
tubo de ensaio (in vitro). As diferentes enzimas mostram respostas diferentes às alterações
na concentração do substrato, da temperatura e do pH. As respostas fornecem informações
valiosas sobre como funcionam as enzimas nas células vivas. A seguir, há uma descrição
dos fatores que influenciam na velocidade de reação da enzima.

 Concentração do Substrato

 Velocidade Máxima
A velocidade máxima de uma reação (V) é o número de moléculas de substrato
convertidas em produto por unidade de tempo, e geralmente é expresso como
micromoles de produto formados por minuto. A velocidade de uma reação catalisada
por enzimas aumenta conforme a concentração do substrato até atingir uma velocidade
máxima (Vmáx) (Fig. 06). A obtenção de um platô na velocidade de reação em altas
concentrações de substrato reflete a saturação pelo substrato de todos os sítios de
ligação disponíveis na enzima.

 Formato Hiperbólico da Curva Velocidade vs. Substrato

A maioria das enzimas mostram cinéticas de Michaelis-Menten, e uma curva de
velocidade de reação, V0, versus concentração do substrato, [S], possui uma forma
hiperbólica similar à curva de dissociação de oxigênio da mioglobina. Ao contrário, as
enzimas alostéricas freqüentemente mostram uma curva sigmóide (Fig. 06), similar à
curva de dissociação de oxigênio da hemoglobina.

Fig.06_ Efeito da concentração do Fig.07_ Efeito da temperatura em uma

substrato na velocidade da reação. reação catalisada por enzima.

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 Temperatura

 Aumento da Velocidade com a Temperatura

A velocidade de reação aumenta com a temperatura até um pico de velocidade ser
atingido. Este aumento é devido ao número aumentado de moléculas com energia
suficiente para atravessar a barreira de energia e formar os produtos da reação.

 Diminuição da Velocidade com a Temperatura

Uma elevação adicional da temperatura resulta em uma redução na velocidade de
reação, como resultado da desnaturação da enzima induzida pela temperatura (Fig. 07).

 pH

 Efeito do pH sobre a Ionização do Sítio Ativo

A concentração de pH afeta a velocidade de reação de várias formas. Primeiro, o
processo catalítico geralmente requer que enzima e substrato tenham grupos químicos
específicos em um estado ionizado ou não-ionizado, de modo a interagir. Por exemplo,
a atividade catalítica pode requerer que um grupo amino da enzima esteja na forma
protonado (-NH3+). Em pH alcalino, este grupo é desprotonado, e assim, a velocidade da
reação diminui.

 Efeito do pH na Desnaturação da Enzima

Extremos de pH também podem levar à desnaturação da enzima, pois a estrutura da
molécula de proteína cataliticamente ativa do caráter iônico das cadeias laterais de
aminoácidos(Fig. 08)

 O pH Ótimo varia para Diferentes Enzimas

O pH no qual a atividade máxima da enzima é atingida para cada enzima, e
freqüentemente reflete a [H+] na qual a enzima funciona no corpo. Por exemplo, a
pepsina, uma enzima digestiva no estômago, é ao máximo ativada em pH 2, enquanto
outras enzimas, destinadas a funcionar em pH neutro, são desnaturadas neste ambiente
ácido (Fig. 08).

Fig.08_ Efeito do pH nas reações catalisadas por enzimas.

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VIII – Equação de Michaelis-Menten
 Modelo de Reação
Michaelis e Menten propuseram um modelo simples que leva em consideração a
maioria das características das reações catalisadas por enzimas. Neste modelo, a enzima
combina-se reversivelmente a seu substrato para formar um complexo ES que
subseqüentemente degrada-se em um produto, regenerando a enzima livre. O modelo,
envolvendo uma molécula de substrato, é representado abaixo:

K1 K2
E + S ES E +P
K-1

onde: S : é o substrato.
E : é a enzima.
ES : é o complexo enzima-substrato.
K1 , K-1 , K2 : são constantes de velocidade.

 Equação de Michaelis-Menten
A equação de Michaelis-Menten descreve como a velocidade de reação varia com a
concentração do substrato:

V0 = Vmáx[S] / Km + [S]

As seguintes conclusões são feitas ao derivar a equação de velocidade de Michaelis-

Menten.

 Concentrações Relativas de E e S
A concentração de substrato, [S], é muito maior que a concentração de enzima, [E], de
modo que a quantidade de substrato ligado à enzima em qualquer momento é pequena.

 Estado de Equilíbrio
A [S] não se altera com o tempo (estado de equilíbrio) – isto é, a velocidade de
formação de ES é igual à degradação de ES (para E + S e para E + P). Em geral, diz-se
que um intermediário quando sua velocidade de síntese é igual a sua velocidade de
degradação.

 Velocidade Inicial
Somente as velocidades iniciais de reação são usadas na análise das reações enzimáticas
– isto é, a velocidade de reação é medida assim que a enzima e substrato são
misturados. Neste momento, a concentração de produto é muito pequena e, portanto, a
velocidade da reação reversa de P para S pode ser ignorada.

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 Conclusões importantes sobre a Cinética de Michaelis-Menten

 Características da Km
A constante de Michaelis é característica de uma enzima e um substrato específico, e
reflete a afinidade da enzima para que aquele substrato. K m é numericamente igual à
concentração do substrato na qual a velocidade de reação é igual à metade da V máx (Fig.
09). O Km não varia com a concentração da enzima.

- Km pequeno
Um Km numericamente pequeno (baixo) reflete uma afinidade elevada da enzima
ao substrato, pois uma baixa concentração de substrato é necessária para saturar a
enzima em 50% - isto é, atingir uma velocidade que é 1/2Vmáx (Fig. 09).

- Km grande
Um Km numericamente grande (elevado) reflete uma baixa afinidade da enzima ao
substrato, pois uma concentração elevada de substrato é necessária para saturar a
enzima em 50%.

 Relação da Velocidade com a Concentração da Enzima

A velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima, em todas
as concentrações de substrato. Por exemplo, se a concentração da enzima é reduzida
pela metade, a velocidade inicial da reação (V0) é reduzida à metade da original.

Fig.09_ Efeito da concentração de substrato

nas velocidades de reação de duas enzimas, Fig.10_ Efeito da concentração do substrato na
enzima 1 com um Km pequeno e a enzima 2 velocidade de reação para uma enzima
reação com um Grande Km. catalisada por enzimas.

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 Ordem da Reação
Quando [S] é muito menor que Km, a velocidade da reação é proporcional à
concentração (Fig. 10).Diz-se então que a velocidade da reação é de primeira ordem
com relação ao substrato. Quando [S] é muito maior que o K m, a velocidade é constante
e igual à Vmáx. A velocidade de reação é, neste caso, independente da concentração de
substrato, e denominada ordem zero com relação à concentração do substrato (Fig. 10).

- Gráfico de Lineweaver-Burke
Quando se desenha um gráfico representando a velocidade de reação versus a
concentração do substrato [S], nem sempre é possível determinar quando a V máx foi
atingida, devido à ascensão gradual da curva hiperbólica em concentrações elevadas
de substrato. Porém, quando se traça o gráfico 1/V0 versus 1/[S], uma linha reta é
obtida (Fig. 11). Esta curva é denominada de Lineweaver-Burke (também
denominada curva duplo-recíproca) e pode ser usada para calcular o K m e Vmáx,
bem como para determinar o mecanismo de reação dos inibidores enzimáticos.

1. A equação descrevendo a curva de Lineweaver-Burke é:

1/V0 = Km/Vmáx[S] + 1 / Vmáx

2. A intersecção no eixo X é igual a –1/Km.

3. A intersecção no eixo Y é igual a 1/Vmáx.

Fig.11_ Gráfico de Lineweaver-Burke.

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IX – Inibição da Atividade Enzimática
Qualquer substância que possa diminuir a velocidade de uma reação catalisada por
enzima é denominada um inibidor. Os inibidores reversíveis ligam-se às enzimas através
de ligações não-covalentes. A diluição do complexo enzima-inibidor resulta na dissociação
do inibidor reversivelmente ligado e recuperação da atividade enzimática. A inibição
irreversível ocorre quando uma enzima inibida não retoma sua atividade após a diluição do
complexo enzima-inibidor. Alguns inibidores irreversíveis agem formando ligações
covalentes com grupos específicos de enzimas; por exemplo, os efeitos neurotóxicos de
certos inseticidas são devido a sua ligação irreversível ao sítio catalítico da enzima
acetilcolinesterase. Os dois tipos mais comumente encontrados de inibição são a
competitiva e não-competitiva.

 Inibição Competitiva
Este tipo de inibição ocorre quando o inibidor liga-se reversivelmente ao mesmo sítio
que o substrato normalmente ocuparia e, assim, compete com o substrato por aquele
sítio.

 Efeito sobre a Vmáx

O efeito de um inibidor competitivo é revertido aumentando-se [S]. Em uma
concentração de substrato suficientemente elevada, a velocidade de reação atinge a Vmáx
observada na ausência de inibidor (Fig. 12).

 Efeito sobre a Km
Um inibidor competitivo aumenta o Km aparente para um dado substrato. Isto significa
que, em presença de um inibidor competitivo, mais substrato é necessário para atingir a
metade da Vmáx.

 Efeito sobre a Curva de Lineweaver-Burke

A inibição competitiva mostra uma curva característica de Lineweaver-Burke, na qual
as curvas das reações inibidas e não-inibidas apresentam intersecção sobre o eixo Y em
1/Vmáx (Vmáx não é alterada). As reações inibidas e não-inibidas atravessam o eixo X em
diferentes pontos, indicando que o Km aparente está aumentando em presença do
inibidor competitivo (Fig. 12).

 Malonato como um exemplo de Inibidor Competitivo

A sucinato desidrogenase catalisa a oxidação do sucinato em fumarato. O malonato é
estruturalmente similar ao substrato, e compete pela ligação no sítio ativo da enzima
(Fig. 13). Entretanto, o complexo enzima-malonato não é reativo, pois a desidrogenação
do malonato é impossível sem a quebra de ligações estáveis carbono. Aumentando a
concentração do sucinato, aumenta a probabilidade de que o sítio ativo seja ocupado por
uma molécula de substrato, ao invés de um inibidor.

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Fig.12_ A. Efeito de um inibidor competitivo na curva de velocidade de reação (V0) versus substrato [S].
B. Gráfico de Lineweaver-Burke da inibição competitiva de uma enzima.

Fig.13_ O malonato compete com o sucinato pelo sítio ativo da sucinato desidrogenase.

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 Inibição Não-Competitiva
Este tipo de inibição é reconhecido por seu efeito característico sobre a Vmáx (Fig. 14).
A inibição não-competitiva ocorre quando o inibidor e substrato ligam-se em diferentes
sítios na enzima. O inibidor não-competitivo pode ligar-se à enzima livre ou ao
complexo ES, impedindo assim a ocorrência da reação (Fig. 15).

 Efeito sobre a Vmáx

A inibição não-competitiva não pode ser superada pelo aumento da concentração de
substrato. Assim, inibidores não-competitivos diminuem a Vmáx da reação.

 Efeito sobre o Km
Os inibidores não-competitivos não interferem com a ligação do substrato à enzima.
Logo, a enzima mostra o mesmo Km na presença ou ausência do inibidor não-
competitivo.

 Efeito sobre a Curva de Lineweaver-Burke

A inibição não-competitiva é facilmente diferenciada da inibição competitiva pela curva
de 1/V0 vs. 1/[S] e pela observação de que a V máx diminui na presença de um inibidor
não-competitivo, enquanto o Km permanece inalterado (Fig. 14).

 Envenenamento pelo Chumbo

O chumbo forma ligações covalentes com as cadeias laterais sulfidrila da cisteína em
proteínas. A ligação do metal pesado é irreversível e mostra inibição não-competitiva.
A ferroquelatase, uma enzima que catalisa a inerção de Fe2+ na protoporfirina, e a
-aminolevulinato desidrase são exemplos de enzimas sensíveis à inibição por chumbo.

 Inibidores Enzimáticos como Drogas

No mínimo a metade das dez drogas mais comumente prescritas nos EUA agem como
inibidores de enzimas. Por exemplo, os antibióticos lactâmicos amplamente prescritos,
como a penicilina e amoxacilina, atuam inibindo uma ou mais enzimas da síntese da
parede celular bacteriana. As drogas também podem agir inibindo reações
extracelulares. Isto é ilustrado pelos inibidores da enzima conversora da angiotensina
(ECA), que diminuem a pressão arterial bloqueando a enzima que cliva a angiotensina I
para formar o potente vasoconstritor angiotensina II. Estas drogas, que incluem o
captopril, enalapril e lisinopril, causam vasodilatação e uma resultante redução na
pressão arterial.

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Fig.14_ A. Efeito de um inibidor não-competitivo na curva de velocidade de reação (V0) versus substrato [S].
B. Gráfico de Lineweaver-Burke da inibição competitiva de uma enzima.

Fig.15_ Um inibidor não-competitivo ligando-se à enzima livre e também ao complexo enzima-substrato.

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X – Regulação da Atividade Enzimática
A regulação da velocidade de reação das enzimas é essencial para o organismo
coordenar seus inúmeros processos metabólicos. As velocidades da maioria das enzimas
são sensíveis a alterações na concentração de substrato, pois o nível intracelular de muitos
substratos está na faixa de Km. Assim, um aumento na concentração de substrato é seguido
de um aumento na velocidade de reação, o que tende a fazer a concentração de substrato
retornar ao normal. Além disso, algumas enzimas com funções reguladoras especializadas
respondem a efetores alostéricos ou modificação covalente, ou mostram velocidade
alteradas de síntese enzimática quando as condições fisiológicas são alteradas.

 Sítios de Ligação Alostéricos

As enzimas alostéricas são reguladas por moléculas denominadas efetores (também
chamadas modificadores ou modeladores) que se ligam de modo não-covalente a um
sítio ativo. A presença de um efetor alostérico pode alterar a afinidade da enzima por
seu substrato ou modificar a atividade catalítica máxima da enzima, ou ambos. Os
efetores que inibem a atividade enzimáticas são denominados efetores negativos,
enquanto aqueles que aumentam a atividade enzimática são denominadas efetores
positivos. As enzimas alostéricas geralmente contêm múltiplas subunidades e
freqüentemente catalisam a etapa comprometida no início de uma rota.

 Efetores Homotrópicos
Quando o próprio substrato serve como um efetor, o efeito é dito homotrópico. Mais
freqüentemente, um substrato alostérico funciona como um efetor positivo. Neste caso,
a presença de uma molécula de substrato em um sítio da enzima aumenta as
propriedades catalíticas dos outros sítios de ligação ao substrato, isto é, sítios exibem
cooperatividade. Estas enzimas apresentam uma curva sigmóide quando a velocidade
de reação (V0) é relacionada com a concentração do substrato [S] (Fig. 16). Isto
contrasta com a curva hiperbólica característica das enzimas que seguem a cinética de
Michaelis-Menten, como destacado previamente. O conceito de cooperatividade da
ligação ao substrato é análogo à ligação do oxigênio à hemoglobina. No caso das
enzimas, o substrato é comparável ao oxigênio.

 Efetores Heterotrópicos
O efetor pode ser diferente do substrato; neste caso, o efeito é dito heterotrópico. Por
exemplo, considere a inibição por feedback mostrada na Fig. 17. A enzima que
converte A em B possui um sítio alostérico que se liga ao produto final E. Se a
concentração de E aumenta (pois não é utilizado tão rapidamente quanto é sintetizado),
a enzima inicial na rota é inibida. A inibição por feedback serve para coordenar o fluxo
de molécula de substrato através de uma série de reações de acordo com a necessidade
da célula para o produto daquela rota em particular.

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 Regulação de Enzimas por Modificação Covalente
Muitas enzimas podem ser reguladas por modificação covalente, mais freqüente por
Adição ou remoção de grupos fosfato de resíduos específicos de serina, treonina ou
tirosina da enzima (Fig. 18). A fosforilação de proteínas é reconhecida como uma das
formas primárias pelas quais os processos celulares são regulados.

 Fosforilação e Defosforilação
As reações de fosforilação são catalisadas por uma família de enzimas, denominadas
proteína quinases, que utiliza adenosina triofosfato como doador de fosfato. Os grupos
fosfato são clivados das enzimas fosforiladas pela ação das fosfoproteína fosfatases.

 Resposta da Enzima à Fosforilação

Dependendo da enzima, a forma fosforilada pode ser mais ou menos ativa que a enzima
não-fosforilada. Por exemplo, a fosforilação da glicogênio fosforilase (uma enzima que
degrada o glicogênio) aumenta sua atividade, enquanto a adição de fosfato à glicogênio
sintase (uma enzima que sintetiza glicogênio) diminui sua capacidade.

 Indução e Regressão da Síntese de Enzima

Os mecanismos regulatórios descritos anteriormente modificam a atividade das
moléculas enzimáticas existentes. Entretanto, as células também podem regular a
quantidade de enzima presente, geralmente alterando a velocidade da síntese da enzima.
A síntese aumentada (indução) ou diminuída (regressão) da proteína leva a uma
alteração na quantidade total de sítios ativos, em vez de influenciar a eficiência das
moléculas de enzima existentes. As enzimas sujeitas à regulação da síntese
freqüentemente são aquelas necessárias somente em um estágio do desenvolvimento, ou
em condições fisiológicas selecionadas. Por exemplo, níveis elevados de insulina
devido a uma glicemia elevada causam um aumento na síntese das enzimas-chave
envolvidas na metabolismo da glicose. Por outro lado, enzimas que estão em uso
constante geralmente não são reguladas por alteração da velocidade da síntese da
enzima. As alterações nos níveis enzimáticos devido a uma indução ou repressão da
síntese protéica são lentas (horas a dias), se comparadas às alterações alostéricas na
atividade, que ocorrem em segundos a minutos. Estão resumidas na Tabela 1 as formas
comuns pelas quais a atividade enzimática é regulada.

Tabela 1_ Mecanismos para a Regulação da Atividade Enzimática

Evento regulador Efetor típico Resultados Tempo requerido

para a alteração
Disponibilidade de Substrato Alteração na velocidade Imediata
substrato
Inibição do produto Produto Alteração na Vm e/ou Km Imediata
Controle alostérico Produto Final Alteração na Vm e/ou Km Imediata
Modificação covalente Outra enzima Alteração na Vm e/ou Km Imediata a minutos
Síntese ou degradação Hormônio ou Alteração na quantidade da Horas e dias
de enzima metabólito enzima

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 Fig.16_ Efeito da concentração do substrato na velocidade de reação para uma enzima alostérica.

Fig.17_ Inibição por feedback de uma rota metabólica.

Fig.18_ Modificação covalente pela adição e remoção de grupos fosfato.

XI – Enzimas no Diagnóstico Clínico

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 As enzimas plasmáticas podem ser classificadas em dois grupos principais.
Primeiro, um grupo relativamente pequeno de enzimas é secretado ativamente no plasma
por certos órgãos, como o fígado, que secreta zimogênios (precursores inativos) das
enzimas envolvidas na coagulação do sangue. Segundo, um grande número de espécies
enzimáticas é liberado pelas células durante o metabolismo celular normal. Estas enzimas
normalmente são intracelulares e não têm função fisiológica no plasma. Em indivíduos
saudáveis, os níveis destas enzimas são razoavelmente constantes e representam um estado
de equilíbrio no qual a velocidade de liberação das células ao plasma é equilibrada por uma
velocidade de liberação aumentada de enzimas intracelulares. Os exames laboratoriais de
atividade enzimática, geralmente utilizam o soro(preparado em laboratório), que é obtido
por centrifugação do sangue total após ele ter coagulado.

 Alteração dos Níveis Plasmáticos das Enzimas nas Doenças

Muitas doenças que causam lesão tecidual resultam em uma liberação das enzimas
intracelulares no plasma. A s atividades de muitas destas enzimas são rotineiramente
determinadas para fins diagnósticos em doenças do coração, fígado, músculo
esquelético e outros tecidos. O nível de atividade enzimática específica no plasma
freqüentemente se correlaciona com a extensão da lesão tecidual. Assim, o grau de
elevação da atividade de uma enzima em particular no plasma freqüentemente é útil
para avaliar o prognóstico do paciente.

 Enzimas Plasmáticas como Ferramenta Diagnósticas

Algumas enzimas mostram atividade relativamente elevada somente em um ou em
poucos tecidos. Assim, a presença de níveis aumentados destas enzimas no plasma
reflete lesão ao tecido correspondente. Por exemplo, a enzima alanina aminotransferase,
ALT (também denominada transaminase glutâmico pirúvica, TGP), é abundante no
fígado. O surgimento de níveis elevados de ALT no plasma assinala uma possível lesão
ao tecido hepático. Aumentos nos níveis plasmáticos de enzimas com uma distribuição
tecidual ampla oferecem uma indicação menos específica do sítio de lesão celular. Esta
falta de especificidade quanto ao tecido limita o valor diagnóstico de muitas enzimas
plasmáticas.

 Isoenzimas e Doença Cardíaca

A maioria das isoenzimas (também chamadas isozimas) são enzimas que catalisam a
mesma reação mas deferem em suas propriedades físicas, devido a diferenças
geneticamente determinadas na seqüência de aminoácidos. As isoenzimas podem conter
diferentes números de aminoácidos carregados, e podem ser separadas umas das outras
por eletroforese (Fig. 19). Diferentes órgãos freqüentemente contêm isoenzimas
diferentes em proporções características. Assim, o padrão de isoenzimas encontrado no
plasma pode servir como um meio de identificar o sítio de lesão tecidual. Por exemplo,
os níveis plasmáticos de creatina quinase (CK, anteriormente denominada creatina
fosfoquinase, CPK), lactato desidrogenase (LDH) e a transaminase glutâmico
oxalacética (TGO) são comumente determinados no diagnóstico do infarto do
miocárdio. Eles são particularmente úteis quando o eletrocardiograma é de difícil
interpretação, como quando ocorrem episódios prévios de doença cardíaca.
 Estrutura Quaternária das Isoenzimas

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 Muitas isoenzimas contêm subunidades diferentes em várias combinações. Por
exemplo, a creatina quinase ocorre na forma de três isoenzimas. Cada isoenzima é um
dímero composto de dois polipeptídeos (denominados subunidades B e M) associados
em uma de três combinações: CK1=BB ; CK2=MB ; CK3=MM . Cada uma das
isoenzimas CK apresentam uma mobilidade eletrosférica característica (Fig. 19).

 Diagnóstico do Infarto do Miocárdio

O músculo miocárdio é o único tecido que contém mais de 5% da atividade total da CK
como isoenzima CK2 (MB). O surgimento da isoenzima híbrida CK2 no plasma é
praticamente específico para o infarto do miocárdio. Após um infarto agudo do
miocárdio, esta isoenzima surge aproximadamente 4 a 8 horas do início da dor toráxica
e atinge um pico de atividade em aproximadamente 24 horas (Fig. 20). A atividade da
lactato desidrogenase também está elevada no plasma após o infarto, atingindo um pico
em 3 a 6 dias após o início dos sintomas. Portanto, a atividade da LDH é de valor
diagnóstico em pacientes admitidos mais de 48 horas após o infarto, um período de
tempo no qual a CK2 plasmática pode fornecer resultados equívocos.

Fig.19_ Estrutura de subunidades e mobilidade eletroforética das isoenzimas da creatina quinase.

Fig.20_ Surgimento da creatina quinase no plasma após um infarto do miocárdio.

XII – Enzimas atuantes na Agricultura

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 Algumas enzimas têm, tido também, êxito em outros campos, como na agricultura,
onde são utilizados:

 Caracterização de variedades de milho, feijão, soja, etc, através de isoenzimas.

 Transformação industrial de dissacarídeos em frutose pelo frutose isomerase.

 Uso em Biologia e Genética Molecular - Engenharia Genética - Enzimas de restrição,

etc.

 Fabricação de pães, vinhos, cervejas, etc, produtos fermentados.

XIII - Técnicas Empregadas no Estudo das Enzimas

 Análise de Velocidade de Reação Catalítica
Existem duas formas essenciais para o estudo da cinética de uma enzima.
Primeiramente deve ser feito medições sob condições na qual mantenha o estado de
equilíbrio, depois observar a aplicabilidade da equação de Michaelis-Menten, e
determinar a velocidade de reação pela concentração do substrato e da enzima.

 Análise do Equilíbrio de Reação

O equilíbrio de uma reação enzimática é estabelecido em segundos ou poucos minutos .
Vejamos algumas técnicas de avaliação:

 Espectrofotometria
É um método simples e apurado. É medido pela absorção de luz na região espectral do
substrato ou produto formado na reação.

 Fluorescência
É similar a metodologia de espectrofotometria. O substrato ou o produto deve emitir
fluorescência neste espectro. A técnica é vantajosa por ser altamente sensível, a solução
a ser empregada deve estar extremamente diluída.

 Titulação automática
É utilizada quando a reação produz ou consome ácido ou base. Titula-se na solução
ácido ou base para que o pH continue constante. A quantidade de ácido ou base
consumido é o valor da reação catalítica enzimática.

 Análise Radioativa
É avaliado quando o substrato é marcado com isótopo radioativo, o qual será perdido ou
transferido durante a reação a ser estudada. É um método extremamente sensível para
análise cinética enzimática.

 Análises de Reações com Alta Velocidade

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 “Stopped Flow"
A enzima e o substrato são inicialmente separados em seringas, que rapidamente libera
seu conteúdo até uma câmara misturadora e em seguida passa para a seringa que pára a
reação. Neste instante um detector mede a absorbância de luz ou fluorimetria (Fig. 21).

Fig.21_ “Stopped Flow”

 "Temperature Jump"
O processo ocorre quando a mistura de reação, que está em equilíbrio numa
Temperatura 1, é rapidamente passada uma temperatura 2 . O ponto de equilíbrio
mudará e a reação deve ocorrer para que a reação alcance um novo equilíbrio. A
mudança rápida de temperatura é obtida por uma explosão de corrente elétrica nos
eletrodos imergidos na mistura de reação. O tempo de relaxamento entre a mudança de
temperatura é medido por absorbância ou fluorescência (Fig. 22).

Fig.22_ "Temperature Jump"

 Análise Quantitativa da Atividade Enzimática

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 Para obtenção de uma análise quantitativa é necessário saber:

 Toda estequiometria de uma reação catalítica;

 Se a enzima requer adição de cofatores como um íon ou coenzima;

 A dependência da enzima sob a concentração do cofator ou substrato;

 pH ótimo;

 A temperatura pela qual a enzima está estável e apresenta alta atividade;

 O procedimento para determinação do aparecimento e desaparecimento do substrato de

um produto de reação;

A análise quantitativa é confirmada quando o substrato ou o produto é colorido ou

absorvido em luz ultravioleta. O valor de aparecimento ou desaparecimento do produto ou
substrato absorvido por luz pode ser analisado pelo espectrofotômetro. Além do produto ou
substrato pode-se analisar o intermediário (aquele que serve como ponte para o
desencadeamento de outra reação):

a) Purificação Enzimática
As enzimas são encontradas na natureza em misturas complexas, geralmente as células
apresentam centenas ou mais diferentes enzimas, para um estudo aprofundado deve-se
purificar a enzima a ser estudada.
Em alguns casos é possível através da aplicação de métodos específicos utilizar enzimas
nos estado impuro, mas na maioria dos casos, a presença de outras enzimas interfere
nos substratos desviando as reações específicas.

b) Métodos de Purificação

- Teste: primeiramente faz-se uma análise quantitativa da atividade da enzima a ser

estudada. A enzima deve ser isolada utilizando - se o teste de atividade em diferentes
frações, sendo mais importante que a exatidão do método.

- Procedimento Geral: definição da unidade enzimática, concentração e atividade

específica.

- Origem enzimática: determinação do local (tecido) de maior quantidade, geralmente a

rápida centrifugação adquire enzimas mitocondrial.

- Extração: é necessário ter a enzima em solução e, portanto, a ruptura de membranas.

Deve –se utilizar um tampão, pois ao romper o tecido pode ocorrer liberação de
substâncias ácidas que degradam a enzima. Os métodos utilizados são o mecânico com
partículas de areia, nitrogênio líquido, "shaker" em alta velocidade , ondas de ultra-som
e solventes como acetona.
c) Unidade de Atividade Enzimática

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 É definida pela quantidade que causa transformação de 1 mol de substrato por minuto a
25°C sob condições ótimas. A atividade específica é o número de unidade de enzimas
por miligrama de proteína, mede a pureza da enzima.
A atividade molar ou molecular ou número de "turnover", é o número de moléculas do
substrato transformado por uma única molécula de enzima ou único sítio de ligação em
um minuto, quando a enzima está no valor de limite. A atividade molar pode ser
calculada pela velocidade máxima.
A nova unidade internacional da atividade enzimática determinada pela "Comissão da
Enzima" é o "katal", o qual é definido como a transformação do substrato em 1 mol por
segundo.

 Métodos de Fracionamento
O extrato de enzimas apresenta inúmeras substâncias com diferentes pesos moleculares
e de acordo com seu interesse de estudo utilizam-se diferentes métodos:

 Precipitação por diferença de pH;

 Desnaturação por aquecimento;

 Precipitação com solventes orgânicos (etanol, acetona);

 Precipitação por sais (sulfato de amônia);

 Adsorção;

 Cromatografia: o mecanismo de separação depende da adsorção, troca iônica, afinidade

específica para imobilizar ligantes específicos ou efeitos de peneiramento molecular;

 Eletroforese: a mobilidade das proteínas é causada por campo elétrico;

 Cristalização;

 Concentração: redução de volume através de evaporação do solvente ou congelamento;

Conclusão

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 A ampla aplicabilidade da atividade enzimática permite utiliza-la em diversos
processos. Através do controle das enzimas pode-se interferir desde a matéria-prima à
colheita, o armazenamento, o processamento até em situações mais específicas da ciência,
como é o caso da imobilização e do uso em todos em métodos analíticos.
Atualmente, o número de enzimas conhecidas é caracterizadas quimicamente anda
por volta de 2000, mas não passa de vinte número de enzimas que são produzidas e
aplicadas industrialmente em grandes quantidades. Por isso torna-se necessário um estudo
avançado das enzimas e suas condições ótimas dez atuação.
Em volta do exposto pode-se concluir que a estrutura química integral das proteínas
com atividade característica é determinante para a atuação delas. No entanto, fatores
externos que alteram a conformação protéica, e portanto a velocidade das reações
enzimáticas são as ferramentas empregadas nos processos naturais ou não para modular as
reações metabólicas dos seres vivos.

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