UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA - UEFS

DEPARTAMENTO DE SAÚDE - DSAU

CURSO DE FARMÁCIA
DISCIPLINA: BIOQUÍMICA I

Amanda Carolina do Carmo Jesus - 21221267

Estudo da Cinética Enzimática da Catalase

Relatório apresentado à Universidade Estadual de

Feira de Santana (UEFS), como parte das exigências do
Curso de Farmácia como requisito avaliativo da disciplina
Bioquímica I, solicitado pela Profª. Dr. Regiane Degan
Fávaro.

Feira de Santana

Novembro de 2022
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO
2. OBJETIVO
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4. CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS

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 1. INTRODUÇÃO

A vida depende de catalisadores poderosos e específicos: as enzimas.

Praticamente todas as reações bioquímicas são catalisadas por enzimas (LEHNINGER).
De todas as funções das proteínas, a catálise provavelmente é a mais importante. Na
ausência de catálise, a maioria das reações nos sistemas biológicos ocorreria de forma
excessivamente lenta para fornecer produtos a um ritmo adequado para um organismo
metabolizante (CAMPBELL; FARRELL, 2007).
O termo “atividade enzimática” designa a própria atividade catalítica da enzima,
em geral expressa em unidades de velocidade, quer dizer, massa transformada por
unidade de tempo (e.g., µmol minuto-1). (BRACHT; ISHII-IWAMOTO, 2003).
As reações catalisadas por enzimas são caracterizadas pela formação de um
complexo entre o substrato e a enzima (complexo ES). A ligação ao substrato ocorre em
um bolsão da enzima, denominado sítio ativo. Nessa lógica, a função das enzimas e dos
outros catalisadores é diminuir a energia de ativação, ΔG transição, da reação e, assim,
aumentar a velocidade da reação. O equilíbrio da reação não é afetado pela enzima
(LEHNINGER, 2019).
Uma porção significativa da energia usada no aumento da velocidade da reação
proporcionada pela enzima provém de interações fracas (ligações de hidrogênio,
agregação devido ao efeito hidrofóbico e interações iônicas) entre o substrato e a
enzima. O sítio ativo das enzimas é estruturado de modo que algumas dessas ligações
fracas ocorrem preferencialmente no estado de transição, estabilizando esse estado
(LEHNINGER, 2019).
A necessidade de interações múltiplas é uma das razões para o grande tamanho
das enzimas. A energia de ligação, ΔGB, é usada para contrabalançar a energia
necessária para a ativação, ΔGtransição, de várias maneiras, como, por exemplo,
diminuindo a entropia, provocando a dessolvatação do substrato ou provocando uma
mudança conformacional na enzima (ajuste induzido). A energia de ligação também é
responsável pela extraordinária especificidade das enzimas por seus substratos
(LEHNINGER, 2019).
Mecanismos catalíticos adicionais utilizados pelas enzimas incluem a catálise
geral ácido básica, a catálise covalente e a catálise por íons metálicos. A catálise
geralmente envolve interações covalentes transitórias entre o substrato e a enzima, ou a

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transferência de um grupo químico da enzima ou para a enzima, de modo a
proporcionar um caminho novo e com menor energia de ativação para a reação. Em
qualquer dos casos, as enzimas retornam ao estado não ligado uma vez que a reação
tenha se completado (LEHNINGER, 2019).
A maioria das enzimas tem algumas propriedades cinéticas em comum. Quando
o substrato é adicionado a uma enzima, a reação rapidamente atinge um estado
estacionário, no qual a velocidade pela qual o complexo ES (Enzima-Substrato) se
forma é compensada pela velocidade pela qual ES se decompõe. Em concentração fixa
de enzima, à medida que a [S] aumenta, a atividade do estado estacionário aumenta de
maneira hiperbólica até se aproximar de uma velocidade máxima característica, Vmax,
na qual, essencialmente, toda a enzima está na forma de um complexo com o substrato
(LEHNINGER, 2019).
A velocidade de uma reação (V) é o número de moléculas de substrato
convertidas em produto por unidade de tempo; geralmente, a velocidade é expressa
como μmol de produto formado por minuto. A velocidade de uma reação catalisada por
enzima aumenta com a concentração do substrato, até uma velocidade máxima (Vmáx)
ser atingida. A obtenção de um platô na velocidade de reação em altas concentrações de
substrato reflete a saturação, pelo substrato, de todos os sítios de ligação disponíveis nas
moléculas enzimáticas presentes (HARVEY, Richard A.; FERRIER, Denise R., 2012).
Leonor Michaelis e Maude Menten propuseram um modelo simples, que explica
a maioria das características das reações catalisadas por enzimas. Nesse modelo, a
enzima combina-se reversivelmente com o substrato, formando um complexo ES que,
subsequentemente, gera o produto, regenerando a enzima livre. A equação de
Michaelis-Menten descreve como a velocidade da reação varia com a concentração do
substrato (HARVEY, Richard A.; FERRIER, Denise R., 2012).
O Km (constante de Michaelis-Menten) é característico da enzima e de seu
substrato específico e reflete a afinidade da enzima por esse substrato. O Km é
numericamente igual à concentração do substrato em que a velocidade da reação é igual
a ½Vmáx. O Km não varia com a concentração da enzima. Um Km numericamente
pequeno reflete alta afinidade da enzima pelo substrato, pois uma baixa concentração de
substrato é necessária para atingir a metade da saturação da enzima - isto é, atingir a
velocidade de ½V máx. Um Km grande (numericamente elevado) reflete baixa
afinidade da enzima pelo substrato, pois é necessária uma alta concentração de substrato

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para atingir a metade da saturação da enzima (HARVEY, Richard A.; FERRIER,
Denise R., 2012).
As catalases - ou mais corretamente hidroperoxidases - são uma das classes de
enzimas mais extensamente estudadas e que não seguem a cinética proposta por
Michaelis-Menten, exceto para concentrações muito baixas do substrato (CHELIKANI
et al., 2004). Adicionalmente, as catalases não dependem de outros agentes redutores
para eliminação de H2O2 o que representa a maior vantagem desta enzima
(FEIERABEND, 2005).

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 2. OBJETIVO
Avaliar os efeitos das variações de temperatura, pH e concentração do substrato
na atividade da enzima catalase nos extratos de plantas das famílias Poaceae (capim
colonião e capim carrapicho) em baterias de tubos de ensaio a partir da construção de
gráficos de curva da velocidade de reação em função desses parâmetros experimentais.

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 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Determinar a atividade enzimática significa medir a velocidade com que

determinada amostra da enzima consegue transformar os substratos. (BRACHT; ISHII-
IWAMOTO, 2003).
O extrato bruto da enzima catalase, obtido a partir do capim, foi
utilizado nos experimentos de avaliação do efeito da variação de parâmetros
cinéticos sobre a atividade da enzima. Para o estudo do efeito do pH, foram testados
sistemas de reação em uma faixa de pH de 4,5 a 10,0. Os resultados mostraram que a
enzima apresenta atividade máxima na faixa de pH em 8,0.
Para o estudo do efeito da temperatura na atividade da catalase, foram testados
baterias de três tubos em temperaturas compreendidas entre 0 °C a 100°C. A atividade
máxima foi observada na temperatura de 37 °C.
Durante o experimento, foi visível a presença de bolhas e de grande
efervescência. O aparecimento de tais fenômenos se deu pela presença da enzima
catalase no interior das células vegetais da planta. Essa enzima catalisa a conversão do
substrato (H2O2 fornecido), transformando-o em moléculas de água e oxigênio.
Para avaliar os efeitos das variáveis com melhor precisão, utilizou-se a
proteína albumina que tem a capacidade de formar uma película no substrato, evitando a
saída do oxigênio a ser detectado no decorrer da reação.
O primeiro parâmetro a ser analisado foi o efeito da variação do pH sobre a
atividade da enzima (Quadro 1).

H 2O Tampão Ácido NaOH Extrat Sol. H2O2 Resul

Tubo Água (2 mL) sulfúrico (gotas) o Albumi (mL) tado
destilada (gotas) (mL) na (nm
(mL) (gotas) de
espu
ma)
1 2,0 ---- 2 --- 3,0 6 1,0 0
2 ---- 4,5 --- --- 3,0 6 1,0 10
3 ---- 6,0 --- --- 3,0 6 1,0 14
4 ---- 7,0 --- --- 3,0 6 1,0 15
5 ---- 8,0 --- --- 3,0 6 1,0 48
6 ---- 10,0 --- --- 3,0 6 1,0 20
7 2,0 ---- --- 2 3,0 6 1,0 0
Quadro 1. Efeito do pH: Reagentes.

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 A concentração de H+ afeta a velocidade da reação de várias maneiras.
Primeiro, o processo catalítico geralmente requer que a enzima e o substrato tenham
determinados grupos químicos em estado ionizado ou não ionizado de modo a
interagirem. Por exemplo, a atividade catalítica pode exigir que um grupo amino da
enzima esteja na forma protonada (-NH3 +). Em pH alcalino, esse grupo não está
protonado e, assim, a velocidade da reação diminui. Segundo, valores extremos de pH
também podem levar à desnaturação da enzima, pois a estrutura da molécula proteica
cataliticamente ativa depende do caráter iônico das cadeias laterais dos aminoácidos.
Assim, em um pH extremamente ácido, a alta concentração de H+ permite a
protonação completa da enzima, então, as cargas iônicas positivas se repelem destruindo
as interações fracas de suas cadeias laterais e consequentemente afetando o seu
funcionamento. O mesmo mecanismo ocorre quando a enzima se encontra em um pH
altamente básico, pois a baixa concentração de H+ promove a desprotonação da enzima
(-COO -), fazendo com que as cargas iônicas negativas destruam a estrutura da enzima.
O gráfico a seguir demonstra o efeito do pH sobre a atividade enzimática da catalase de
acordo com o procedimento experimental realizado em sala:

Gráfico 1. Efeito do pH sobre reações catalisadas pela enzima.

Cada enzima tem um pH ótimo (ou um intervalo de pH), no qual a atividade é
máxima; em pH maior ou menor a atividade diminui. Assim, o pH ótimo da atividade
de uma enzima geralmente é próximo ao pH do ambiente no qual a enzima costuma ser
encontrada (LEHNINGER, 2019).
Teoricamente, o melhor funcionamento da catalase é um pH neutro (pH = 7),
conforme o pH do meio celular onde a enzima é comumente encontrada. Dessa forma,

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em outros valores de pH, ela catalisa em uma velocidade menor (uma enzima apenas
perde atividade se sua estrutura for destruída). Entretanto, o pH = 8 mostrou uma
melhor atividade dessa enzima nesse experimento. Quanto aos outros tubos, houve
pequena variação na atividade, visto que só foi possível observar mudanças
consideráveis nos níveis extremos.
O segundo parâmetro a ser analisado foi o efeito da temperatura sobre a
atividade da enzima (Quadro 2).

H2O Água Sol.

Tubo destilada Extrato Albumina H2O2 Temperatura Resultado(m
(mL) (mL) (gotas) (mL) (°C) m de
espuma)

1 2,0 3,0 6 1,0 0 10

2 2,0 3,0 6 1,0 37 18
3 2,0 3,0 6 1,0 100 0
Quadro 2. Efeito da temperatura: Reagentes.

Nesse sentido, a velocidade de reação aumenta com a temperatura, até um pico

de velocidade ser atingido, conforme mostrado no gráfico 2. Isso ocorre devido ao
aumento do número de moléculas com energia suficiente para atravessar a barreira da
energia de ativação e formar os produtos da reação. Porém, uma elevação maior da
temperatura resulta em redução na velocidade de reação como resultado da
desnaturação da enzima, induzida pela temperatura.

Gráfico 2. Efeito da temperatura sobre as reações

catalisadas pela enzima.

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 A extrema elevação da temperatura atua como um agente desnaturante
irreversível, ou seja, o retorno à temperatura normal não promove a recuperação das
interações fracas que foram quebradas.
Diminuindo a temperatura, há um abaixamento da energia de movimento das
moléculas, assim, a atividade da enzima é afetada de forma que o tempo da reação é
mais lento.
Por último, avaliou-se a cinética enzimática da catalase em relação ao efeito da
concentração do substrato sobre sua atividade.
H2O Água Result
Tubo destilada Extrato Solução H2O2 ado
(mL) (mL) Albumina (mL) (mm)
(gotas)

1 2,0 5,0 6 --- 0

2 1,6 5,0 6 0,4 49
3 1,2 5,0 6 0,8 95
4 0,8 5,0 6 1,2 119
5 0,4 5,0 6 1,6 120
6 ---- 5,0 6 2,0 122
Quadro 3. Efeito da concentração do substrato: Reagentes.

Nessa lógica, a concentração da enzima é constante enquanto que a

concentração do substrato é variável. Assim, quanto maior a concentração do substrato,
mais rápida é a atividade da enzima.
Para o estudo do efeito da concentração de substrato sobre a velocidade
da reação catalisada pela enzima catalase deste trabalho considerou-se o esquema de
BRIGS-HALDANE (1925), onde: E + H2O2 ⇄ E-H2O2 → E + H2O + O2. Este
esquema considera as reações de formação e dissociação do complexo enzima-
substrato (ES) e a reação de decomposição deste complexo para a formação de produto.
Neste mecanismo, a enzima forma um complexo intermediário com o substrato
(H2O2) e esse complexo dá origem aos produtos (H 2O e O2), regenerando a enzima na
sequência. Quando este esquema é aplicado à aproximação do estado estacionário,
considera-se a concentração do complexo ES praticamente constante ao longo do
tempo. A velocidade inicial (𝑣0) medida reflete, neste caso, o estado estacionário,
ainda que 𝑣0 seja limitada aos tempos iniciais da reação. Na cinética de estado
estacionário, a curva que expressa a relação entre a 𝑣0 e a concentração de
substrato tem a forma de uma hipérbole retangular para a maioria das enzimas,
sendo expressa algebricamente pela equação de Michaelis-Menten.

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 A velocidade da reação é proporcional à concentração do complexo ES. Se a
concentração de substrato é muito alta em relação à concentração de enzima, a
enzima pode estar saturada de substrato e neste ponto o aumento da concentração
de substrato não aumenta a concentração do complexo enzima-substrato, atingindo-se
a velocidade máxima (Vmáx).
A velocidade da reação enzimática pode ser observada pela formação de
produto (P) ou pela diminuição da concentração de substrato, no início da mistura
de enzima (E) e substrato (S).
Assim, evita-se a interferência da variação da concentração de substrato [S],
considerando-se que sua concentração é muito próxima do valor inicial. Desta forma,
determina-se a velocidade inicial(𝑣0) em que [S] é geralmente muito maior que [E].

Gráfico 3. Efeito da concentração do substrato sobre a velocidade da reação.

Teoricamente, a ordem de tamanho da espuma deve estar crescente até a
saturação. Porém, o gráfico (Gráfico 3) acima foi construído com base nos dados
experimentais de um experimento em que a curva crescente de espuma não pôde ser
formada devido à falha no contato entre enzima e substrato, ou seja, a catalase agiu
apenas na superfície. Para prevenir esse tipo de erro durante o experimento, deve-se
inverter o tubo de ensaio logo após a adição do substrato.
Em suma, os resultados dessa etapa do experimento deveriam ser semelhantes
aos do gráfico abaixo:

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 Gráfico 4. Efeito da concentração do substrato sobre a velocidade da reação.

4. CONCLUSÃO

O estudo da enzima catalase de extrato bruto de poaceae (capim) com relação a

catálise da reação de conversão de peróxido de hidrogênio a água e gás oxigênio sugeriu
atividade máxima da enzima em pH 8,0 e temperatura de 37 °C.

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 REFERÊNCIAS

Belo, M. F. R. F., & Souza, A. L. F. (2016). Estudo cinético da enzima catalase (E.C.
1.11.1.6) de extrato bruto de batata doce (Ipomoea batatas). Scientia Plena, 12(7).
https://doi.org/10.14808/sci.plena.2016.071001.
BRACHT, A.; ISHII-IWAMOTO, E.L. Métodos de laboratório em bioquímica. Barueri:
Manole, 2003.
CHELIKANI, P.; FITA, I.; LOEWEN, P. C. Diversity of structures and properties
among catalases. Cellular Molec. Life Sci., v. 61, n. 1, p. 192-208, 2004.
FEIERABEND, J. Catalases in plants: molecular and functional properties and role in
stress defense. In: SMIRNOFF, N. (Ed.). Antioxidants and reactive oxygen species in
plants. Oxford: Blackwell, 2005. p. 101-140.
NELSON, David L.; COX, Michael M.. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 7 ed.
Porto Alegre: Artmed, 2019. p. 187-201.
HARVEY, Richard A.; FERRIER, Denise R.. Bioquímica Ilustrada. 5. ed. Porto
Alegre: Artmed, 2012. p. 56-59.

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