Bioquímica I

Tema IV: Biocatalizadores

Título:Cinética enzimática.
 Sumário
• Factores que modificam a velocidade de uma reacção
enzimática:
 Variação da concentração de enzima.
 Variação da concentração de substrato.
 Variação da concentração de cofactores.
 Variação de pH.
 Variação da temperatura.
 Efecto de inibidores.
 Efecto de ativadores.

Bibliografia: Bioquímica Médica Tomo.I.Cap 16.p283-296.

 Objetivo.

• Explicar os efectos dos factores que modificam

a velocidade das reacções enzimáticas e o
significado dos parâmetros cinéticos das
enzimas.
 Cinética enzimática
• A função fundamental das enzimas é aumentar a
velocidade das reacções químicas que ocorrem nos
seres vivos. O comportamento dessa velocidade e
sua modificação devido à presença de diferentes
agentes físicos ou químicos constitui o objecto de
estudo da cinética enzimática.

• A característica mais sobressalente destas reacções

é a participação das enzimas,o qual significa que
sua velocidade está influenciada não só pela
concentração de substrato e produto,a não ser
(além e principalmente) pela presença de uma
molécula proteínica que não será alterada pela
reacção em que participa.
 Cinética enzimática
• Na medida que a reacção progride a
concentração do substrato vai diminuindo e a do
produto aumenta, mas a concentração total da
enzima permanece invariável.

• O objectivo final da cinética enzimática é

aproveitar os estudos de velocidade para
esclarecer os diferentes mecanismos pelos
quais as enzimas realizam sua função e
correlacionar estes com a estrutura
tridimensional da proteína enzimática.
 Velocidade de uma reacção enzimática

• Para o estudo da velocidade das reacções catalizadas por

uma enzima e a interpretação adequada de seus resultados
se requerem algumas condicione.

• Tendo em conta que são vários os factores que podem

modificar a velocidade da reacção só se pode estudar um
factor de uma vez, com cuidado de que todos outros
permaneçam constantes; entretanto não podem manter-se
constantes: a concentração do substrato nem a do
produto, pois sua variação é o índice que assegura que a
reacção está ocorrendo; para salvar essa dificuldade se
introduziu o conceito de velocidade inicial (Vo) que é a
velocidade da reacção quando ainda não se consumou o
10 % do substrato inicial.
 Velocidade de uma reacção enzimática

• Isto obriga a realizar primeiro alguns ensaios em

diferentes tempos de incubação, de forma tal
que possa fixar-se o intervalo necessário para
estar seguro de que no estudo se medem só
velocidades iniciais.
Além disso, a medida da velocidade inicial evita que as
determinações estejam influídas por outros factores como:

1. Se a reacção for reversível, a velocidade da reacção

inversa aumenta na mesma medida que a concentração do
produto e desce a velocidade de transformação do substrato.

2.Se não se proporcionar substrato em excesso sua

concentração desce com o tempo, o que provoca uma
diminuição progressiva da velocidade.

3. O produto da reacção pode inibir a actividade da enzima.

A velocidade de uma reacção catalisada por
uma enzima, pode medir-se por 2 tipos de
procedimentos:

Técnica descontínua Técnica de observação

(de amostragem)em que
se tomam amostras da
mescla de reacção em
diferentes tempos.
Detém-se a reacção e se
analisa o conteúdo de
substrato ou produto nas
amostras.
Este tipo de procedimento
é o mais aconselhável,
mais não sempre é factível.
contínua em que se faz uso
de uma propriedade física
distintiva do substrato ou
produto ou outro participante
da reacção que se pode
medir quantitativamente sem
interferir o desenvolvimento
da reacção, como pode ser a
mudança que se produz no
espectro de absorção devido
à formação do produto.
 Forma de realizar os estudos cinéticos

• Em primeiro lugar se procede a determinar o tempo de

incubação como já foi explicado, depois se prepara um
conjunto de tubos de ensaio onde se encontram todos os
componentes da mescla de reacção (buffer, substrato,
activadores, etcétera) menos a enzima; esta mescla se
coloca em banheiro de temperatura regulável, fixando esta
em um valor determinado, onde também se incuba por uns
minutos a solução que contém a enzima.

• Por último, acrescenta-se a cada tubo a solução de

enzima; auxiliados de um cronômetro se mede o tempo de
reacção a partir do momento em que se acrescentou a
enzima, ao transcorrer o tempo indicado se procede a
deter a reacção.
 Forma de realizar os estudos cinéticos

• Para isto costuma-se acrescentar algum agente

desnaturante de proteínas, (um dos mais empregados é
o ácido tricloroacéticoTCA), procede-se então a
determinar a concentração do produto (ou do substrato),
calcula-se a diferença com a concentração inicial (que
no caso do produto é zero) e este resultado se divide
entre o tempo de incubação, com o qual se obtém o
valor da velocidade; depois se constrói uma gráfica
cartesiana onde se representa a velocidade inicial no
eixo das ordenadas e o factor que se variou no eixo das
abcissas, a curva que se obtém é a variação da
velocidade em função da variação do factor estudado.
FACTORES QUE INFLUENCIAM NA VELOCIDADE DE UMA
REACÇÃO ENZIMÁTICA

• Concentração da enzima.

• Concentração de substrato.

• Concentração de cofactores.

• ph.

• Temperatura.

• Concentração de inibidores e
ativadores.
 REQUISITOS

1- Quando se mede o efeito de um factor,o

subtraio dois factores se mantém constante.

2- Trabalhar com valores de velocidade inicial.

.
 VELOCIDADE
DA REACÇÂO ENZIMÁTICA

 [S]  [P]
V = ----------- ó V = -----------
t t

V0 ( velocidad inicial)

Quando a quantidade de substrato consumido

É ainda desprezível.
 A obtenção de uma linha
FACTORES QUE INFLUENCIAM NA recta que acontece a origem
VELOCIDADE DE UMA REACÇÃO das coordenadas indica que
ENZIMÁTICA existe uma relação de
proporcionalidade directa
Concentração de enzima
entre a velocidade da
reacção e a concentração da
enzima, que pode expressar-
se pela equação: V=k(E)
A relação de
proporcionalidade directa
entre a velocidade e a
concentração de enzima
permite a determinação da
concentração de alguma
delas nos líquidos ou tecidos
(E) corporais.Apoiado neste
princípio se determinam no
laboratório clínico as
concentrações séricas de
transaminases,quinases,
peptidases, etcétera.
FACTORES
            QUE INFLUENCIAM NA VELOCIDADE DE
UMA REACÇÃO ENZIMÁTICA
Concentração de substrato
A primeira explicação convincente para este
comportamento foi exposta pelo Leonor Michaellis e
Maud Mentem em 1913, que segundo eles a reacção se
produz em dois etapas: a união da enzima (E) com o
substrato (S) para formar um complexo enzima-substrato
ES) de maneira rápida, e a transformação do substrato
em produto (P) com a liberação da enzima, que resulta a
etapa mais lenta.

onde k1, k2, e k3 (ou kcat),são as constantes de

velocidade específica para cada etapa da reacção. Kcat,
conhece-se também como número de recâmbio da
enzima.
Como a segunda etapa é o passo limitante, a velocidade da
reacção depende da decomposição do complexo ES segundo a
equação:

Se pode medir [ES] em diferentes momentos é factível calcular

a velocidade, mas isto não sempre é possível, o qual obriga a
deduzir uma equação que permita calcular a velocidade em
função de variáveis que se possam medir.
Como a formação de ES é reversível e se decompõe
lentamente em produto, estabelecerá-se um equilíbrio entre E, S
e ES quando sua velocidade de formação (vf) seja igual a sua
velocidade de decomposição (vd) e estas vêm dadas pelas
conhecidas equações de velocidade:
 Quando vf=vd teremos que:

O quociente das dois constantes, que é a constante de dissociaçã

do complexo ES recebe o nome de constante do Michaelli
(Km).A enzima livre (E) será igual à enzima total (ET) menos a qu
se encontra em forma de ES.Se introduzirem estas consideraçõe
na equação (5), tem-se que:

Se se limpar [ES].

Substituindo [ES] por seu equivalente em

(1) obtém-se:
1. Quando [S] >>> Km: neste caso o denominador Km + [S
for quase igual a [S] e simplificando obtemos:

As concentrações muito elevadas de substrato produzem um

efeito de saturação e quase toda a enzima se encontra em
forma de ES. Tendo presente a equação (1) é possível inferir
que nesse momento se alcançou a maior velocidade possível
para a reacção que se denomina velocidade máxima (Vm).
Nestes momentos a velocidade se faz independente da [S],
ou seja, é de ordem zero.
2. Quando [S] <<Km: neste caso o valor do denominador será
virtualmente igual a Km e a equação se transforma em

o quociente das duas constantes Vm/Km é uma constante e

portanto, a velocidade da reacção é directamente proporcional à
concentração de substrato ou, dito de outra forma, é de primeira
ordem com respeito à concentração de substrato.
3. Quando [S]=Km: neste caso o denominador passa a ser 2 [S]
que ao simplificar fica:
             Equação de Michaelis-Menten:

Vmax. (S)
V=
Km + (S)

O Km de um substrato para uma enzima

específica é característico,e nos fornece um
parâmetro de especificidade dela enzima pelo
substrato.
Quanto menor o Km, maior a especificidade, e
vice-versa.
Km =K2 + K3
K1
 Significado do Vmáx e Km:

• Vmáx: alcança-se quando as moléculas de

substrato ocuparam todos os sítios activos de
todas as moléculas da enzima, por isso a
velocidade de reacção nesse momento só
depende da capacidade que tenha a enzima
para transformar o substrato.

• Km: é igual a constante de dissociação do

complexo ES e por isso representa uma medida
da afinidade da enzima pelo substrato, de forma
que enquanto major seja a afinidade menor será
o valor da Km.
 V = Vmax. (S)
Km + (S)

Quando:
v = 1/2 Vmax
Km
= (s)
• Para determinar graficamente os valores do
Vmáx e Km é mais singelo utilizar a
representação dobro recíproca (1/Vo vs 1/[S]),
já que é uma linha recta.
• Esta representação dobro recíproca recebe o
nome de Representação ou Equação do
Linerweaver –Burk.
Transformação da equação de Michaelis - Menten
Equação de Lineweaver-Burk
Y=aX+b 1/v = KM X 1 + 1
Vmax [S] Vmax
Equação de uma
linha recta 1/v
declive = KM/Vmax

1/Vmax

[1/S]
- 1/KM
 Factores que influenciam na
           
Velocidade de uma reacção
enzimática

A concentração de cofactores
Concentração de cofactores está acostumado a ter um efeito
similar à concentração de
substrato.

A coincidência das dois

gráficas é um facto experimental
importante para afirmar que os
cofactores se unem à enzima por
um sítio específico e em uma
relação estequiométrica que
explica o fenômeno de saturação
(C) observado; este sítio pudesse
ser o centro activo.
 Factores que A influência da temperatura sobre a
velocidade da reacção é um problema
influenciam na complexo no qual intervêm vários factores,
Velocidade de uma entre eles o aumento da energia do sistema
reacção enzimática ao aumentar a temperatura, o qual faz que os
reagentes possuam uma energia cinética
Temperatura maior e portanto estejam mais próximos ao
estado activado, além disso, os efeitos
desestabilizantes da temperatura sobre a
estrutura tridimensional da proteína
enzimática são imprescindíveis para sua
acção.

O aumento da temperatura reflecte um

aumento da energia cinética das moléculas, o
T qual favorece a colisão entre as moléculas de
enzima e substrato, enquanto major seja a
temperatura maior é o número de choques e
maior a velocidade da reacção; mas a partir
de um valor de temperatura começa a
desnaturação da proteína enzimática e com
isso a perda da actividade que se observa
Temperatura Ótima nos valores elevados de temperatura.
 Factores que
influenciam na Como se observa, a curva tem uma forma de
sino com uma zona central estreita que se
Velocidade de uma corresponde com os maiores valores da
reacção enzimática velocidade; ao valor de pH onde se obtém a
maior velocidade lhe denomina pH óptimo.
pH
Esta gráfica se explica tendo em conta que o
pH modifica o estado de dissociação dos
grupos químicos presentes na enzima ou no
complexo enzima-substrato, com o que pode
modificar umas vezes a união e outras a
transformação.Em valores extremos de pH
(perto de 0 ou 14)pode produzir-se
desnaturação da proteína enzimática, o que
contribui à pouca actividade observada nesta
zona.

O pH ótimo é um valor característico para

cada enzima e expressa que nesse valor a
enzima se encontra em sua conformação mais
pH ótimo activa.
 Efeito dos activadores

• Como activadores enzimáticos se definem às

pequenas moléculas,geralmente iões
inorgânicos,que são requeridos, ou ao menos
estimulam,a actividade catalítica de uma
enzima, e ao contrário dos cofactores,não são
participantes explícitos da reacção.
 Mesmo que podem expor-se
diferentes forma de actuar:

Interacção obrigatória Interacção obrigatória

com a enzima livre: com o substrato livre:
encontram-se muitas encontram-se enzimas
enzimas que possuem que catalisam reacções
iões metálicos em seu nas quais intervêm
centro activo como a nucleósidos di e
carboxipeptidase que trifosfatados, que
contém Zn2+ outras requerem da
enzimas parecem participação simultânea
requerer a presença de de um catião bivalente
um ião para estabilizar (especialmente Mg2+)
sua conformação de em quantidades
máxima actividade estequiométricas.
catalítica.
 Fenômeno no qual, uma substância
química denominada inibidor,
interactua com a enzima,
provocando uma diminuição ou
desaparecimento de sua actividade catalítica.

REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS
 Efeito de inibidores
• Os inibidores enzimáticos são substâncias que
têm em comum a propriedade de diminuir a
velocidade das reacções catalizadas pelas
enzimas.
Tipos gerais de inibidores
 Reversíveis: o inibidor forma com a enzima um
complexo enzima-inibidor (EI) unido por forças
não covalentes e que portanto pode dissociar-
se.
 Irreversíveis:produzem-se modificações
covalentes da enzima que não podem eliminar-
se fácilmente.
 Classificação da
inibição reversível

Não
Competitiva Competitiva
Inibidor competitivo
• Similitude estrutural substrato-inibidor.
• União del inibidor a centro activo.
• Depende das concentrações.
relativas substrato-inibidor.
• Aumenta KM .
• Não afeita a Vmax.
•Não são análogos estrutural substrato-inibidor .
•Aceita-se que a união enzima-inibidor se
produz em um sítio diferente do centro activo.
•Não impede a união do substrato mais dificulta
grandemente sua transformação.
• Não afeita a KM .
•Uma diminuição a Vmax.
Inibição não competitiva
 Conclusões.
• A velocidade das reacções é uma função de muitas
variáveis, não obstante podemos expor que as
variações na velocidade das reacções enzimáticas em
dependência dos distintos factores é uma consequência
das variações no número ou a formação dos centros
activos (causa-efecto).

• Neste sentido é importante destacar o valor da Vmáx. e

a Km como indicadores cinéticos.

• Os estudos de hoje nos permite reforçar o princípio da

relação entre a estrutura e a função das biomoléculas,
posto que vimos que as variações na estrutura do centro
activo provocam mudanças na actividade enzimática.
 Orientação do estudo independente.
Estudar os aspectos do sumário.Bibliografia:
Bioquímica Médica Tomo I. Cap 16.p 283-296.

1. Quais são as razões pelas que nos estudos cinéticos

deve sempre medir-se velocidades iniciais?
2. Em uma experiência cinética se observa que ao
aumentá-la concentração de enzima não se produz o
esperado aumento proporcional da velocidade. A que
factores podem dever-se estes resultados?
3. Se dois enzimas atuarem sobre o mismo substrato com
Km de 4 x 10-4 e 7 x 10-4 respectivamente.Que
conclusões podem derivar-se de esto valore?