6.
3: A cinética enzimática como ALTAS [S]: V0 aumenta em pequenas
abordagem a compreensão do
mecanismo
Cinética enzimática - determinar a
velocidade da reação e como ela se modifica
em resposta a mudanças nos parâmetros
experimentais.
A concentração do substrato influi na
velocidade das reações catalisadas por
enzimas
fator-chave que afeta a velocidade das
reações catalisadas por enzimas é a
concentração do substrato, [S] (modifica-se
durante o curso de uma reação in vitro à
medida que o substrato é convertido em
produto)
O efeito da variação de [S] sobre V0 quando
a concentração da enzima é mantida
constante:
Cínética de saturação
A velocidade máxima, Vmáx, é extrapolada
a partir de gráficos como este, pois a V0
aproxima-se, mas nunca atinge a Vmáx. A
concentração do substrato na qual V0 é
metade da Vmáx é o Km, a constante de
Michaelis. A concentração da enzima em
experimentos como este geralmente é tão
baixa que [S] >> [E], mesmo quando [S] é
descrita como baixa ou relativamente baixa.
BAIXAS [S]: V0 aumenta quase
linearmente com o aumento de [S].
quantidades em resposta ao aumento da [S].
Enfim, é atingido um ponto além do qual o
aumento de [S] leva a um aumento
insignificantemente pequeno em V0. Essa
região de V0 tipo platô está próxima à
velocidade máxima, Vmáx.
a combinação de uma enzima com a
molécula do substrato formando um
complexo ES é uma etapa necessária na
catálise enzimática:
a enzima primeiramente combina-se de
modo reversível com o substrato, formando
um complexo enzima-substrato em uma
etapa reversível e relativamente rápida:
Então, o complexo ES é rompido em uma
segunda etapa mais lenta (limita a
velocidade da reação total), fornecendo a
enzima livre e o produto P:
velocidade total deve ser proporcional à
concentração das espécies que reagem na
segunda etapa, isto é, ES.
Em determinado instante de uma reação
catalisada por enzima, a enzima existe em
duas formas, na forma livre ou não
combinada (E) na forma combinada (ES).
• Baixa [S], a maior parte da enzima
está na forma não combinada E a
velocidade é proporcional à [S]
porque o equilíbrio é deslocado na
direção da formação de mais ES à
medida que [S] aumenta.
• Alta [S]: A velocidade inicial
máxima de uma reação catalisada
(Vmáx) ocorre quando quase toda a
enzima estiver presente como
complexo ES, enzima está
“saturada” com o substrato, e então
um incremento de [S] não produz
efeito na velocidade.
Após o rompimento do complexo ES,
fornecendo produto (P), a enzima fica livre
para catalisar a reação de mais uma molécula
do substrato.
Logo que a enzima é misturada com um
grande excesso de substrato, há um período
inicial, o estado pré-estacionário, durante o
qual a concentração de ES aumenta.
A reação rapidamente atinge o estado
estacionário no qual [ES] (e as
concentrações de qualquer outro
intermediário) permanece constante ao
longo do tempo.
A determinação de V0 geralmente reflete o
estado estacionário e a análise da velocidade
inicial é denominada cinética do estado
estacionário.
A relação entre a concentração do
substrato e a velocidade da reação
pode ser expressa quantitativamente
A curva que expressa a relação entre [S] e V0
tem a mesma forma geral para a maioria das
enzimas (hipérbole retangular) e pode ser
expressa algebricamente pela equação de
Michaelis-Menten.
Equação de Michaelis-Menten: equação da
velocidade da reação com um único
substrato, catalisada por uma enzima. Ela
define a relação quantitativa entre a
velocidade inicial, V0, a velocidade máxima,
Vmáx, e a concentração inicial de substrato,
[S], todas em relação à constante de
Michaelis, Km.
Para V0 = Vmáx/2:
Os parâmetros cinéticos são
utilizados para comparar a atividade
de enzimas
A equação descreve o comportamento
cinético da grande maioria das enzimas,
sendo que todas as enzimas que exibem uma
dependência hiperbólica de V0 sobre [S] são
consideradas como seguindo a cinética de
Michaelis-Menten. A regra prática de que
Km = [S] quando V0 5 ½ Vmáx é válida para
todas as enzimas que seguem a cinética de
Michaelis-Menten. (enzimas regulatórias
são as exceções)
Muitas das enzimas que seguem a cinética de
Michaelis- Menten têm mecanismos de
reação muito diferentes, ou seja, o
significado verdadeiro tanto de Vmáx como
de Km pode ser diferente para enzimas
diferentes.
Interpretacao de Vmax e Km:
Km pode variar muito de acordo com a
enzima e mesmo para substratos diferentes
de uma mesma
O significado verdadeiro do Km depende de
aspectos específicos do mecanismo da
reação, como o número e as velocidades
relativas das várias etapas.
Para duas etapas:
Quando k2 é a etapa limitante, k2 V k–1, e o
km fica reduzido a k–1/k1, que é definido
como a constante de dissociação, Kd, do
complexo ES. Nessas condições, Km
representa uma medida da afinidade da
enzima pelo substrato no complexo ES.
Entretanto, esse cenário não se aplica para a
maioria das enzimas.
A grandeza Vmáx também varia muito entre
enzimas diferentes.
Se uma enzima reage pelo mecanismo de
duas etapas de Michaelis-Menten, então
Vmáx 5 k2[Et], onde k2 é a etapa limitante
da velocidade. Entretanto, o número de
etapas da reação e a identidade das etapas
limitantes da velocidade podem variar de
acordo com a enzima.
Kcat: constante de primeira ordem da
velocidade, tendo como unidade a recíproca
do tempo. Ela também é chamada de
número de renovação (“turnover”), sendo,
quando a enzima estiver saturada com o
substrato, equivalente ao número de
moléculas de substrato convertidas em
produto por unidade de tempo por uma única
molécula de enzima.
Na equação de Michaelis-Menten, kcat =
Vmáx/[Et].
Cada enzima tem valores de kcat e Km que
refletem o ambiente celular, a concentração
de substrato normalmente encontrada in vivo
pela enzima e a química da reação
catalisada. kcat e Km também possibilitam
que se avalie a eficiência cinética das
enzimas;
Duas enzimas que catalisam reações
diferentes podem ter o mesmo kcat (número
de renovação), entretanto, as velocidades
dessas reações quando não catalisadas
podem ser diferentes entre si e, portanto, o
aumento de velocidade propiciado por cada
enzima pode ser muito diferente
Km de uma enzima que atue sobre um
substrato presente em concentrações muito
baixas na célula geralmente é menor do que
o Km de uma enzima que age sobre um
substrato mais abundante.
A melhor maneira de comparar as
eficiências catalíticas de enzimas diferentes,
ou o número de vezes que diferentes
substratos são catalisados por uma mesma
enzima, é comparar a relação kcat/Km para
as duas reações – CONSTANTE DE
ESPEREFICIDADE (constante de
velocidade para a conversão de E + S em E
+ P).
Quando [S] >> Km:
Muitas enzimas catalisam reações
com dois ou mais substratos
As reações enzimáticas com dois substratos
geralmente envolvem a transferência de um
átomo de um grupo funcional de um
substrato para o outro. Essas reações
ocorrem por vários mecanismos diferentes.
• Ambos os substratos se ligam à
enzima simultaneamente em algum
ponto do curso da reação, formando
um complexo não covalente ternário
(Figura 6-13a). Os substratos ligam-
se segundo uma sequência aleatória
ou em uma sequência com ordem
específica.
• primeiro substrato é convertido em
um produto que se dissocia antes
que o segundo substrato se ligue, de
modo que não há formação de um
complexo ternário.
A cinética de estado estacionário geralmente
ajuda a distinguir entre essas possibilidades.
A cinética do estado pré-estacionário
pode fornecer evidências de etapas
específicas das reações
Os dois parâmetros experimentais mais
importantes obtidos da cinética do estado
estacionário são kcat e kcat/Km.
Uma descrição completa de uma reação
catalisada por uma enzima requer a medida
direta das velocidades de cada uma das
etapas.
As enzimas estão sujeitas à inibição
reversível e irreversível
Inibidores de enzimas são moléculas que
interferem com a catálise, diminuindo ou
interrompendo as reações enzimáticas.
Existem duas amplas classes de inibidores
de enzimas: reversíveis e irreversíveis.
Inibição reversível: Um tipo muito comum
de inibição reversível é denominado
competitivo. Um inibidor competitivo
compete com o substrato pelo sítio ativo da
enzima. À medida que o inibidor (I) ocupa o
sítio ativo, ele impede que o substrato se
ligue à enzima. Muitos inibidores
competitivos têm estrutura similar à
estrutura do substrato e se combinam com a
enzima formando um complexo EI, mas que
não leva à catálise. Mesmo ligações desse
tipo que sejam transitórias reduzem a
eficiência da enzima.
Km observado na presença do inibidor,
geralmente é denominada de Km “aparente”.
Uma vez que o inibidor liga-se
reversivelmente à enzima, a competição
pode ser deslocada em favor do substrato
simplesmente pela adição de mais substrato.
Quando [S] exceder muito a [I], é
minimizada a probabilidade de uma
molécula de inibidor se ligar à enzima, e a
reação apresenta Vmáx normal. Entretanto,
em [S] na qual V0 = ½ Vmáx, a presença do
inibidor aumenta o valor do Km aparente por
um fator a. Esse efeito no Km aparente,
combinado com a ausência de efeito sobre
Vmáx, diagnostica uma inibição
competitiva.
Outros exemplos: inibição incopetitiva e
mista. Um inibidor incompetitivo liga-se
em um sítio distinto do sítio ativo do
substrato e, ao contrário do inibidor
competitivo, liga-se apenas ao complexo ES.
em altas concentrações de substrato, V0
aproxima-se de Vmáx/a’. Então, um inibidor
incompetitivo diminui a Vmáx medida. O
Km aparente também diminui, porque a [S]
necessária para atingir metade da Vmáx
diminui por um fator de a’.
No um inibidor misto há ligação a um sítio
distinto do sítio ativo, ao qual o substrato se
liga. Nesse caso, o inibidor pode ligar-se
tanto à enzima quanto a ES.
Na prática, as inibições incompetitiva e
mista são observadas apenas em enzimas
com dois ou mais substratos.
Inibição irreversível. Os inibidores
irreversíveis ligam-se covalentemente com
ou destroem um grupo funcional da enzima
essencial à atividade da enzima ou então
formam uma associação não covalente
estável. A formação de uma ligação
covalente entre um inibidor irreversível e
uma enzima é uma possibilidade.
Uma classe especial de inibidores
irreversíveis é formada pelos inativadores
suicidas, os quais passa pelas primeiras
etapas químicas de uma reação enzimática,
mas em vez de ser transformado no produto
normal, é convertido em um composto muito
reativo que se combina irreversivelmente
com a enzima. Esses compostos também são
denominados inativadores com base no
mecanismo, pois sequestram o mecanismo
normal da reação para inativar a enzima. Um
inativador suicida bem planejado é
específico para uma única enzima e
permanece sem reatividade até que se ligue
no sítio ativo da mesma.
Na inibição irreversível, o inibidor liga-se
permanentemente ao sítio ativo pela
formação de uma ligação covalente ou por
uma interação não covalente muito estável.
Análogos do estado de transição: ligam-se à
enzima mais fortemente do que o substrato
no complexo ES porque elas se encaixam
melhor no sítio ativo (i.e., formam um
número maior de interações fracas) do que o
próprio substrato.

A atividade enzimática depende do

Ph
enzimas têm um pH (ou uma faixa de pH)
ótimo no qual a atividade catalítica é
máxima; a atividade decresce em pH maior
ou menor
As cadeias laterais dos aminoácidos do sítio
ativo podem funcionar como ácidos ou bases
fracas em funções críticas que dependem da
manutenção de certo estado de ionização, e
em outras partes da proteína as cadeias
laterais ionizáveis podem ter uma
participação essencial nas interações que
mantêm a estrutura proteica.
A faixa de pH na qual uma enzima sofre
mudança na atividade pode fornecer uma
pista para o tipo de resíduo de aminoácido
envolvido