UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

INSTITUTO DE QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA

LABORATÓRIO DE BIOQUIMICA
PROF. DRA. SÔNIA SALGUEIRO MACHADO

JOSÉ RONALDO DE ARAUJO

PRATICA 04: QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE CATALÍTICA DO

ACETILCOLINESTERASE

Maceió/AL
2021
 JOSÉ RONALDO DE ARAUJO

PRATICA 04: QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE CATALÍTICA DO

ACETILCOLINESTERASE

Relatório de aula prática apresentando ao

Curso de graduação em Química
Tecnológica e Industrial, da Universidade
Federal de Alagoas, como requisito para
obtenção de nota da disciplina de
Laboratório de Bioquímica.

Maceió/AL
2021
1. Introdução

As colinesterases (ChE) são enzimas responsáveis pela hidrólise (degradação) da

acetilcolina (ACh), neurotransmissor responsável pela transmissão dos impulsos
nervosos. Existem duas enzimas que possuem a capacidade de hidrolisar a acetilcolina: a
acetilcolinesterase (AChE) ou colinesteraseverdadeira, e a pseudocolinesterase, também
denominada butirilcolinesterase (BChE) ou colinesterase inespecífica. A AChE redomina
os eritrócitos, pulmões, baço, neurônios e na matéria cinza do cérebro; e a BChE
prepondera no plasma, fígado, pâncreas, intestino delgado e matéria branca do cérebro
(Alonzo; Corrêa, 2003; Motta, 2003)1.
O método mais utilizado para medir a atividade da colinesterase em sangue total,
eritrócitos ou plasma, é o ensaio enzimático descrito por Ellman et al. (1961). Este se
constitui em uma técnica espectrofotométrica para a atividade da colinesterase e pode ser
rotineiramente empregado. O método é baseado na capacidade de a colinesterase
(presente na amostra) hidrolisar a propioniltiocolina em tiocolina e ácido propiônico.A
tiocolina formada reagecom o ácido 5,5-ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB),formando um
complexo amarelo mensurável a 405 nm (Ellman et al., 1961; Silva et al., 2001)
2. Objetivo do Experimento

Preparo de extrato celular e quantificação da atividade catalítica de enzimas por

técnicas espectrométricas.

3. Reagentes, vidrarias e material usado

3.1. Cérebro de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus);

3.2. Acetiltiocolina (ATCh);
3.3. DTNB (5-dithiobis-2-nitrobenzeno);
3.4. Cloreto de Sódio (NaCl);
3.5. Tampão fosfato (0,1 M e pH 8,0);
3.6. Espectrofotômetro UV/VIS (Perkin Elmer UV/VIS Lambda 2), disruptor de células
ultrassônico;

4. Procedimento (Metodologia)

4.1. Prate 1 – Preparo dos reagentes

4.1.1. Preparo da solução estoque de acetiltiocolina 75 mmol/L (MM = 289,18

g/mol), preparar para 5 mL;
4.1.2. Solução de NaCl a 0,9% (m/v) quantidade V=100 mL;
4.1.3. Solução de DNTB (Ácido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico) 10 mmol/L (MM
= 396,35 g/mol), prepara 25 mL.

4.2. Parte 2 – Extração do cérebro de tilápia do nilo

4.2.1. Pegou-se os peixes tilápia (fonte da enzima) e retirou-se o cérebro (Figura

01), foram etiquetados, embalados em papel alumínio com o respectivo
tratamento e período de exposição e congelados em nitrogênio líquido e
depois em freezer -20°C até a análise;

Figura 01 – Extração dos cérebros de tilápia do Nilo (O. niloticus)

 4.3. Preparação do extrato cerebral

4.3.1. Para o preparo do extrato cerebral, foram retirados 3 cerebros de tilapias

reunidos em pool, medidos as massas e macerados sob banho de gelo em
uma solução refrigeradas de NaCl 0,9% (m/v) (80 mg: 1 mLNaCl a 0,9%),
em seguida transferido para um homogeneizador de vidro potter,
parcialmente submerso em banho de gelo. A ruptura de células foi realizada
em ultrassom fisher scientific Sonic (5 ciclos de 15’’ com intervalos de 15’’)
a uma frequência de 22,5 KHz. Os intervalos foram em banho de gelo para
resfriamento da haste metálica do ultrassom (Figura 2)

OBS: Massa de cérebro pesada = 0,161 g

Figura 02 – Esquema do Preparo do extrato cerebral

4.4. Ensaio Enzimático

4.4.1. Mistura Reacional: O Ensaio foi realizado em uma mistura de reação

contendo:
a) fosfato de potássio (KH2PO4/K2HPO4) a 0,1 M e pH 8,0;
b) Solução 0,01M de Ácido 5,5-Ditiobis-2-nitrobenzoico (DNTB);
c) Solução 0,075 M de Iodeto de Acetiocolina (AChI) como substrato
para ChE;
d) E a diluição dos extratos de cérebro respectivamente. Volume
reacional de 1500 µL;

4.4.2. BRANCO: Para leitura do branco, foi adicionado água desmineralizada

ao invés do substrato ATCh;
4.4.3. O tempo de reação foi de 5 minutos e todos os ensaios realizados em
triplicata;
4.4.4. O volume final utilizado foi de 1,5 mL;
4.4.5. A unidade da atividade colinesterásica (U) representa uma quantidade de
enzima catalisando a hidroxila de 1 µmol de substrato por minuto (U =
µmol/min-1)
5. Resultados e Discussões

Após a conclusão de todo procedimento experimental, com os resultados de

Absorbância calcula-se a atividade da enzima com a formula a seguir:

Onde:
∆
U=
∆
= 𝑥
.

ΔAbs = ABSf – ABSi = 0,208 – 0 = 0,208.

ɛ = coeficiente de extinção molar do DTNB (ɛ = 14,15 mM-1.cm-1);

Ve = volume do extrato enzimático adicionado ao ensaio = 10 µL
D = diluição do extrato = 25 µL
l = o caminho ótico percorrido pela luz ( que no caso da cubeta é l=1 cm )
V = volume reacional = 1500 µL

Foram feitas 3 diluições (1:25, 1:50 e 1:100), a diluição que apresentou o melhor
resultado de atividade enzimática foi a diluição 1:25.

Calculando, temos:
0,208
𝑈 5 𝑚𝑖𝑛 1500 𝜇𝐿 0,0416 𝑚𝑖𝑛 1500 𝜇𝐿
= 𝑥 = 𝑥
𝑚𝐿 14,15 𝑚𝑀 . 𝑐𝑚 𝑥 1 𝑐𝑚 10 𝜇𝐿 14,15 𝑚𝑀 0,4 µ𝐿
25 𝜇𝐿

𝑈
= 2,94. 10 𝑥 3750 = 11,025 𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑐𝑚
𝑚𝐿

Com os resultados obtidos, pode-se afirmar que o desejo do experimento foi

atingido e assim garantindo a eficácia do método de Ellman.
6. Conclusão
Diante dos resultados obtidos na pratica e descrito neste relatório, conclui-se que o
método de Ellman para quantificação da atividade catalítica da actilcolinesterase é
eficiente para a finalidade que foi proposta.
7. Referências Bibliográficas

Roteiro da aula prática, fornecido pela professora;

1
file:///C:/Users/Ronaldo/AppData/Local/Temp/1425-Texto%20do%20artigo%20-
5875-1-10-20130610.pdf;
2
http://static.sites.sbq.org.br/rvq.sbq.org.br/pdf/CleoniaNoPrelo.pdf