BIOLOGIA MOLECULAR

Guia de trabalhos prticos

Ano letivo 2016/2017

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BIOLOGIA MOLECULAR
Programao das aulas prticas 2016/2017

Clculos para a preparao de solues de uso corrente em Biologia Molecular e

6-10/2
preparao de uma soluo de tampo SB.

13-17/2 Extrao de DNA genmico de plantas.

Quantificao de DNA genmico (espectrofotometria) e verificao da qualidade em

20-24/2
gel de agarose.

27/2-3/3 3 Carnaval Dias Abertos FCUP

6-10/3 Corte do DNA genmico e de DNA do fago lambda com enzimas de restrio.

Eletroforese em gel de agarose. Anlise do padro eletrofortico dos DNAs cortados e

13-17/3
no cortados com enzimas de restrio.

Reao em cadeia da polimerase (PCR).

20-24/3
Primers.

Eletroforese em gel de agarose. Anlise do produto de PCR e anlise in silico de uma

27-31/3
sequncia nucleotdica.

3-7/4 Obteno de clulas competentes de Escherichia coli.

10-14/4 Pscoa

Transformao Escherichia coli com DNA plasmdico por choque

17-21/4 Pscoa
trmico.

Transformao E. 3 Feriado
24-28/4 Dvidas.
coli 25 Abril
2 Feriado Observao de resultados e discusso do trabalho anterior: clculo
1-5/5
1 Maio* da eficincia da transformao, mapa de plasmdeo, etc. Dvidas.
8-12/5 Semana Acadmica

15-19/5 Extrao e purificao de protenas

Avaliao terico-prtica (obrigatria)

22-26/5
Dia 24 de maio 10-11h
*Alunos distribuem-se pelas outras turmas
N de aulas previstas: 12 aulas Limite de faltas : 3;
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Unidade I - Solues

Na Tabela seguinte encontram-se resumidas algumas caractersticas das solues tampo normalmente
utilizadas em Biologia Molecular para separar fragmentos de cidos nucleicos (DNA e RNA) por
eletroforese em gel de agarose.

TAE tampo Tris-Acetato-EDTA

TBE tampo Tris-Borato-EDTA
SB tampo Borato de Sdio

Brody and Kern (2004) Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. BioTechniques
36:214-216

1 Como prepararia 30 mL de tampo TAE 1x a partir de uma soluo de TAE 50x?

2 Como prepararia 1 L de tampo SB 1x a partir da soluo de SB 20x?

3 Para preparar um gel de agarose necessrio pesar a agarose para a concentrao de 0,8 % (p/v)
em tampo SB 1 X , dissolver a agarose no forno micro-ondas, arrefecer a soluo para cerca de 60 C
e adicionar o corante de DNA GelRed 10.000 x .
3.1. Que massa de agarose necessita para preparar um gel de 25 mL de agarose 0,8 % (p/v)?

3.2. E que volume necessita adicionar do corante Gel Red para que este fique numa concentrao final
de 1x?
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4 Para preparar a amostra para carregar no gel necessrio adicionar um tampo de amostra
(loading dye) que contem uma substncia (como glicerol ou sacarose) que aumenta a densidade da
amostra e um corante que permite visualizar a corrida da amostra no gel.
A uma amostra de 10 L que quantidade de tampo de amostra 6x seria necessrio adicionar para
obter a concentrao de 1x na mistura final?

Cada grupo (8 grupos):

Preparar 25 mL de tampo SB 20x com concentraes finais dos seguintes produtos NaOH 0,2M e
cido brico 0,73M. Utilizar gua esterilizada.
Massa molar NaOH: 39,997 g/mol
Massa molar H3BO3: 61,83 g/mol

Treinar carregar amostras (5 L) nos poos do gel previamente preparado.

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Unidade II Extrao, quantificao e avaliao da qualidade de DNA
genmico (plantas e bactrias)

Usar sempre material e solues esterilizadas

Limpar a mesa com etanol a 70%, lavar as mos, ligar banho a 65C
A. Extrao de DNA genmico

1- Aquecer 5 mL de tampo de extrao a 65 C num tubo cnico de 15 mL estril (Falcon).

2- Retirar as nervuras e pesar 1,0 g de tecido foliar.
3 - Homogeneizar o tecido foliar num almofariz com o auxlio de areia de quartzo e 3 mL de
tampo de extrao.
4- Transferir o homogeneizado para o tubo contendo o tampo aquecido com o auxlio de uma
esptula.
5- Incubar a 65 C durante 15 minutos com inverses ocasionais e suaves.
6- Adicionar 5 mL de uma mistura de clorofrmio:lcool isoamlico (24:1) e agitar suavemente
durante 5 minutos (HOTE). Calibrar os tubos.
7- Centrifugar durante 3 minutos a 3000 g para separar a fase aquosa (superior) da orgnica.
8- Transferir a fase aquosa para um novo tubo de 15 mL utilizando uma micropipeta (P1000).
9- Adicionar 5 mL de isopropanol frio (4 C) (volume igual ao da fase aquosa) para precipitar
os cidos nucleicos.
10- Inverter suavemente para homogeneizar a soluo observar a formao de um novelo
de cidos nucleicos incubar temperatura ambiente durante 5 minutos.
11- Transferir o novelo para um novo tubo de 15 mL contendo 15 mL de tampo de lavagem
ou etanol a 75% com o auxlio de uma ponta cortada.
12- Incubar durante 5 minutos com agitao suave temperatura ambiente
13- Transferir o novelo para um tubo de 1,5 mL estril (Eppendorf) e eliminar o excesso de
tampo.
14- Deixar secar o sedimento e ressuspender num volume apropriado de gua (200 a 400 L).
15- Identificar o tubo.
16- Conservar o DNA a 4 C at futura utilizao
___________________________________________________________________________________________________
Solues necessrias:
Tampo de extraco CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide 3 % (p/v), NaCl 1,4 M, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM pH=8,0.
Preparar 500 mL em gua estril.
Clorofrmio:alcol isoamlico 24:1 preparar 250 mL.
Tampo de lavagem etanol 70 %, acetato de amnia 10 mM. Preparar 500 mL em gua estril. ou etanol a 75%
gua estril Autoclavar durante 20 minutos a 121 C.
Isopropanol frio
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B. Quantificao espectrofotomtrica de DNA genmico

Determinar a concentrao de DNA genmico na soluo final de acordo com a tabela

fornecida, sabendo que

Absorvncia260 nm = 1 => ~ 50 g mL-1 (DNA de cadeia dupla)

1- Diluir a suspenso de DNA 1:100 em gua estril num volume final de 1 mL.
2- Determinar os valores de absorvncia da suspenso diluda a 260 e 280 nm (cuvete de
quartzo ou UVette), utilizando gua como branco, registar os valores obtidos.
3- Determinar a [DNA] e o grau de pureza

Grupo A260nm A280nm A260/A280 [DNA] (g/ L) 1 g = ? (L)

1

Exemplo de clculos:
A260nm = 0,250
A280nm = 0,215
Volume de DNA = 30 L

[DNA]:

DO260nm = 1,0 ---------------- - 50 g DNA /mL

DO260nm = 0,250 --------------- x g x = 12,5 g/mL

12,5 g X 100 (factor diluio) = 1250 g/mL = 1,25 g/L

Pureza:

A260/A280 = 0,250/0,215 = 1,16 Suspenso contaminada com protenas (<1,8)

1,8 2,0 suspenso pura
< 1,8 contaminao com protenas

Manuteno do DNA
O DNA purificado ressuspendido em gua estril ou tampo TE (Tampo Tris/EDTA : 10mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA)
e geralmente guardado no frigorfico, a 4C. O DNA pode ser mantido por longos perodos de tempo no congelador (-
20C), contudo, se est a ser utilizado com frequncia, prefervel no o congelar, pois durante o processo de
congelar/descongelar repetidas vezes, formam-se cristais de gelo que podem causar ruturas na molcula de DNA.
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C. Eletroforese em Gel de Agarose

C1.Montagem do gel:

1- Fechar as extremidades do suporte do gel e inserir o pente para definir os poos.

2- Preparar 25 mL agarose 1,0 % (p/v) em tampo TAE 1x num matraz de 100 mL; dissolver a
agarose em forno micro-ondas ou em banho de gua a ferver; depois de arrefecer para cerca de
50C, adicionar ___ L de uma soluo de GelRed 10.000x.
3- Verter a agarose no suporte do gel e deixar solidificar. Cuidado, a agarose muito quente
deforma o suporte do gel.
4- Abrir as extremidades do suporte do gel, retirar o pente. Ateno: poos do lado do ctodo.
5- Encher a tina com tampo TAE at cobrir a superfcie do gel. Verificar se os poos esto
preenchidos com tampo.

Remover cuidadosamente o pente,

puxando-o na vertical
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C2. Carregar o gel:

1- Prepare uma amostra de 12 L contendo 1 g (__L) de DNA genmico e __L de tampo da

amostra 6x (concentrao final 1x). Se necessrio perfazer o volume com gua. Deixar ficar as pontas
usadas nos tubos.
2- Pipetar o contedo total de cada tubo para um poo do gel, usando a mesma ponta.
3- Estabilizar a pipeta sobre o poo com ambas as mos
4- Expelir o ar da ponta antes de carregar o gel
5- Orientar verticalmente a ponta com a amostra com o centro do poo e submergi-la ligeiramente no
tampo
6- Mergulhar a ponta da pipeta um pouco abaixo da superfcie do lquido (no necessrio introduzir a
ponta dentro do poo), posicion-la na direo do poo e expelir a amostra muito lentamente, que cair
diretamente no poo devido maior densidade do tampo de amostra
Cuidado para no furar o gel com a ponta da pipeta.

C3. Eletroforese:

1- Fechar a cmara de eletroforese e ligar os cabos eltricos a uma fonte de alimentao eltrica de
modo a que o ctodo da cmara fique ligado ao ctodo da fonte (preto preto), assim como o nodo
(vermelho vermelho). Verificar se os poos com DNA esto do lado do ctodo (polo negativo).
2- Ligar a fonte de alimentao e regular a voltagem para 80 V. Verificar a formao de pequenas
bolhas gasosas nos eltrodos da cmara. Passados alguns instantes de corrida, deve ver-se o corante
deslocar-se no gel em direo ao polo positivo. Num gel de agarose a 1%, o azul de bromofenol
desloca-se mesma velocidade de um fragmento de DNA de aproximadamente 500 bp.
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3- Deixar de correr a eletroforese at o azul de bromofenol se encontrar a meio do gel.
4- Desligar a fonte de alimentao, desligar os cabos de ligao e remover a tampa da cmara de
eletroforese.
5- Cuidadosamente, e usando luvas, retirar o gel com o respetivo suporte da cmara de eletroforese.
6- Examinar o gel com iluminao UV e registar o padro de bandas em fotografia ou desenhando

numa folha de acetato sobreposta ao gel. Neste caso, no esquecer de marcar a posio dos poos.
Ateno: proteger os olhos da radiao UV por meio de culos adequados.

Nota: Quando um campo eltrico aplicado atravs do gel conduz a uma migrao dos diferentes fragmentos do DNA da
amostra em direo ao polo positivo (a pH alcalino). As molculas de DNA mais pequenas migram mais rapidamente do
que as de maiores dimenses, e assim os fragmentos de diferentes tamanhos ficam separados em bandas diferentes.
As bandas so visveis com radiao UV devido a um composto que se liga molcula de DNA (ex. GelRed).
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Unidade III Anlise de DNA cortado com enzimas de restrio

ANLISE DE DNA CORTADO COM ENZIMAS DE RESTRIO

Usar sempre material e solues esterilizadas

Neste trabalho, o DNA de bacterifago Lambda (48502 pares de bases - bp = 48,5 kb), o DNA de uma
cianobactria (Nostoc sp. PCC 7120 7,2 Mb) sero cortados com enzimas de restrio e os
fragmentos resultantes separados por eletroforese em gel de agarose. Duas amostras de cada DNA so
incubadas a 37C, com uma das seguintes endonucleases de restrio: EcoRI ou HindIII. Uma terceira
amostra, que constitui o controlo negativo, incubada sem endonuclease.
As amostras de DNA so submetidas a electroforese em gel de agarose. Para um determinado
DNA, o nmero e o padro das bandas produzidas por cada enzima de restrio so caractersticos e
constituem um DNA fingerprint.
A. Reaes de restrio
Notas: As DNases so abundantes, nomeadamente nas mos. Usar s material esterelizado e no tocar com as mos nas
pontas das pipetas e nas tampas e interior dos tubos Eppendorf.

Ao pipetar olhar sempre para a ponta da pipeta para verificar se entrou lquido. Pegar no tubo Eppendorf com a mo e
colocar o lquido no fundo.

necessrio ter o mximo de cuidado com as enzimas de restrio para no desnaturarem: devem ser retiradas do
frigorfico para um recipiente com gelo s no momento da utilizao.

1- Preparar seis reaes de restrio em tubos Eppendorf (1,5 mL) de acordo com a seguinte tabela:

Tubo DNA* Tampo** HindIII EcoRI H2 O Volume

10x final
Controlo lambda
3 L 1 L --- --- 6 L 10 L

lambdaH 3 L 1 L 1 L --- 5 L 10 L

lambdaE 3 L 1 L --- 1 L 5 L 10 L
Controlo genmico
2 L 1 L --- --- 7 L 10 L
cianobactria
cianoH
2 L 1 L 1 L --- 6 L 10 L
cianoE
2 L 1 L --- 1 L 6 L 10 L
* 500 ng - 1 g, ** o tampo a utilizar especfico para cada uma das enzimas
2- Misturar os reagentes batendo suavemente na extremidade do tubo. Se necessrio, centrifugar para
evitar que fique lquido nas paredes.

3- Incubar todos os tubos de reaco por um perodo mnimo de 1h a 37C (FastDigest ~15 min).

4- Separar os fragmentos em gel de agarose a 1% em TAE 1x ou congelar as amostras (podem

inativar-se as enzimas, ex. 80C 10 min).
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B. Resultados e Discusso
1- Os fragmentos lineares de DNA migram a velocidades inversamente proporcionais ao log 10 das suas
massas moleculares. Para simplificar, substitui-se a massa molecular dos fragmentos pelo seu
tamanho em pares de bases (bp).
2- Na tabela seguinte esto os tamanhos de fragmentos de DNA de Lambda originados por digesto
com HindIII:

HindIII EcoRI
Distncia (mm) bp real Distncia (mm) bp calculado bp real
23130
9416
6557
4361
2322
2027
*564
*125
* estas bandas podem no ser visveis

3- Medir a distncia, em mm, desde o bordo do poo a cada uma das bandas e registar na tabela.
4- Fazer corresponder a distncia a cada banda ao tamanho do respectivo fragmento.
5- Usando papel semi-logartmico, marcar a distncia migrada no eixo dos xx e o logartmo de kb no
eixo dos yy, para cada fragmento de HindIII. Unir os pontos.
6- Usar a curva obtida para determinar o tamanho, em kb dos fragmentos obtidos com a EcoRI, a partir
das distncias migradas.
7- Registar o valor obtido na tabela, na coluna correspondente a bp calculado. Comparar com os
valores reais.
8- Descreva o que observou no caso do DNA da cianobactria.
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Imagem do gel obtido aps

electroforese de produtos de
restrio do DNA de fago
Lambda cortado com EcoRI,
Hind III e do DNA no cortado

Compare o nmero de bandas

visveis no gel com o nmero de
bandas esperadas a partir do
mapa de restrio da pg. 20.

Justifique as diferenas
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25 50 75 100 125 150 175

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Exerccios:

1- Foi realizada uma extrao de DNA a partir de tecido foliar e o DNA obtido foi ressuspendido em
gua (amostra de DNA). A absorvncia (=260nm) desta amostra de DNA diluda de 1:100 foi de
0,175.
1.1- Sabendo que uma Abs260nm = 1.0 corresponde a uma concentrao de DNA em cadeia dupla de 50
g/mL, calcule a concentrao de DNA na amostra.

1.2- Qual a composio do ensaio a branco e para que o utilizaria?

2-

Estimating concentrations of DNA templates using Lambda DNA HindIII digest

solution as a standard:
Total size of Lambda DNA: 48502 bp.
Concentration: 200ng/l
Load on gel 10l = 2000ng, 5l = 1000ng, 2.5l = 500ng

Band % of total Load 2g=___ng of Load 1g=___ng of Load 0.5g=___ng of

bp size
# DNA DNA DNA
1 23,130 47.69% 954ng 477ng 238.5ng
2 9,416 19.41% 388ng 194ng 97ng
3 6,557 13.52% 270ng 135ng 67.5ng
4 4,361 8.99% 180ng 90ng 45ng
5 2,322 4.79% 96ng 48ng 24ng
6 2,027 4.18% 84ng 42ng 21ng
7 564 1.16% 23ng 11.5ng 5.75ng
8 125 0.26% 5ng 2.5ng 1.25ng
Total 48502 100% 2000ng 1000ng 500ng

2.1- Partindo do facto que em condies normais s bem visvel uma banda de DNA com 10 ng de
massa (visualizada com brometo de etdio/UV), qual ser a massa total de DNA de lambda cortado
com Hind III a carregar no gel para que a banda de 125 bp fosse visvel?
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3 - Na figura esto representados os mapas de restrio de um fragmento de DNA de 18 000 bp

obtidos para a enzima de restrio A e para a enzima de restrio B respectivamente.

A A
Enzima A | | | |
3500 1000 13500

B B
Enzima B | | | |
2000 10000 6000

Faa os dois mapas de restrio possveis do fragmento de DNA de 18 kb cortado com as duas enzimas A e
B.

4- O esquema seguinte representa um mapa de restrio de um fragmento de DNA obtido aps

digesto com as enzimas EcoRI e HindIII:

HindIII HindIII HindIII

EcoRI EcoRI

DNA

Escala

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
kb

A digesto simultnea do fragmento de DNA com as duas enzimas de restrio origina os seguintes
fragmentos:

a) 1 kb, 2 kb (2 fragmentos), 5,5 kb e 7,5 kb

b) 1kb, 2,5 kb, 3 kb, 4,5 kb e 5 kb
c) 1 kb (2 fragmentos), 1,5 kb, 2 kb, 4 kb e 4,5 kb
d) 1 kb (2 fragmentos), 1,5 kb ,2kb, 4 kb e 5,5 kb
e) 1 kb, 1,5 kb (2 fragmentos), 4,5 kb e 5, 5 kb