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BIOLOGIA MOLECULAR

BIOLOGIA MOLECULAR Guia de trabalhos práticos Ano letivo 2016/2017

Guia de trabalhos práticos

Ano letivo 2016/2017

BIOLOGIA MOLECULAR Guia de trabalhos práticos Ano letivo 2016/2017

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BIOLOGIA MOLECULAR Programação das aulas práticas 2016/2017

6-10/2 Cálculos para a preparação de soluções de uso corrente em Biologia Molecular e preparação
6-10/2
Cálculos para a preparação de soluções de uso corrente em Biologia Molecular e
preparação de uma solução de tampão SB.
13-17/2
Extração de DNA genómico de plantas.
20-24/2
Quantificação de DNA genómico (espectrofotometria) e verificação da qualidade em
gel de agarose.
27/2-3/3
3ª Carnaval
Dias Abertos FCUP
6-10/3
Corte do DNA genómico e de DNA do fago lambda com enzimas de restrição.
13-17/3
Eletroforese em gel de agarose. Análise do padrão eletroforético dos DNAs cortados e
não cortados com enzimas de restrição.
20-24/3
Reação em cadeia da polimerase (PCR).
Primers.
27-31/3
Eletroforese em gel de agarose. Análise do produto de PCR e análise in silico de uma
sequência nucleotídica.
3-7/4
Obtenção de células competentes de Escherichia coli.
10-14/4
Páscoa
17-21/4
Páscoa
Transformação Escherichia coli com DNA plasmídico por choque
térmico.
Transformação E.
3ª Feriado
24-28/4
Dúvidas.
coli
25 Abril
2ª Feriado
Observação de resultados e discussão do trabalho anterior: cálculo
1-5/5
1º Maio
*
da eficiência da transformação, mapa de plasmídeo, etc. Dúvidas.
8-12/5
Semana Académica
15-19/5
Extração e purificação de proteínas
Avaliação teórico-prática (obrigatória)
22-26/5
Dia 24 de maio 10-11h

*Alunos distribuem-se pelas outras turmas Nº de aulas previstas: 12 aulas Limite de faltas : 3;

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Unidade I - Soluções

Na Tabela seguinte encontram-se resumidas algumas características das soluções tampão normalmente utilizadas em Biologia Molecular para separar fragmentos de ácidos nucleicos (DNA e RNA) por eletroforese em gel de agarose.

nucleicos (DNA e RNA) por eletroforese em gel de agarose. TAE – tampão T ris- A

TAE tampão Tris-Acetato-EDTA TBE tampão Tris-Borato-EDTA SB tampão Borato de Sódio

Brody and Kern (2004) Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. BioTechniques

36:214-216

1 Como prepararia 30 mL de tampão TAE 1x a partir de uma solução de TAE 50x?

2 Como prepararia 1 L de tampão SB 1x a partir da solução de SB 20x?

3 Para preparar um gel de agarose é necessário pesar a agarose para a concentração de 0,8 % (p/v)

em tampão SB 1 X , dissolver a agarose no forno micro-ondas, arrefecer a solução para cerca de 60º C e adicionar o corante de DNA GelRed 10.000 x . 3.1. Que massa de agarose necessita para preparar um gel de 25 mL de agarose 0,8 % (p/v)?

3.2. E que volume necessita adicionar do corante Gel Red para que este fique numa concentração final de 1x?

4

4 Para preparar a amostra para carregar no gel é necessário adicionar um tampão de amostra (“loading dye”) que contem uma substância (como glicerol ou sacarose) que aumenta a densidade da amostra e um corante que permite visualizar a corrida da amostra no gel. A uma amostra de 10 µL que quantidade de tampão de amostra 6x seria necessário adicionar para obter a concentração de 1x na mistura final?

Cada grupo (8 grupos):

Preparar 25 mL de tampão SB 20x com concentrações finais dos seguintes produtos NaOH 0,2M e Ácido bórico 0,73M. Utilizar água esterilizada.

Massa molar NaOH : 39,997 g/mol Massa molar H 3 BO 3 : 61,83 g/mol

Treinar carregar amostras (5 µL) nos poços do gel previamente preparado.

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Unidade II Extração, quantificação e avaliação da qualidade de DNA genómico (plantas e bactérias)

Usar sempre material e soluções esterilizadas Limpar a mesa com etanol a 70%, lavar as mãos, ligar banho a 65ºC A. Extração de DNA genómico

1- Aquecer 5 mL de tampão de extração a 65 ºC num tubo cónico de 15 mL estéril (Falcon). 2- Retirar as nervuras e pesar 1,0 g de tecido foliar. 3 - Homogeneizar o tecido foliar num almofariz com o auxílio de areia de quartzo e 3 mL de tampão de extração. 4- Transferir o homogeneizado para o tubo contendo o tampão aquecido com o auxílio de uma espátula. 5- Incubar a 65 ºC durante 15 minutos com inversões ocasionais e suaves. 6- Adicionar 5 mL de uma mistura de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e agitar suavemente durante 5 minutos (HOTE). Calibrar os tubos. 7- Centrifugar durante 3 minutos a 3000 g para separar a fase aquosa (superior) da orgânica. 8- Transferir a fase aquosa para um novo tubo de 15 mL utilizando uma micropipeta (P1000). 9- Adicionar 5 mL de isopropanol frio (4 ºC) (volume igual ao da fase aquosa) para precipitar os ácidos nucleicos. 10- Inverter suavemente para homogeneizar a solução – observar a formação de um “novelo” de ácidos nucleicos incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos. 11- Transferir o “novelo” para um novo tubo de 15 mL contendo 15 mL de tampão de lavagem ou etanol a 75% com o auxílio de uma ponta cortada. 12- Incubar durante 5 minutos com agitação suave à temperatura ambiente 13- Transferir o “novelo” para um tubo de 1,5 mL estéril (Eppendorf) e eliminar o excesso de tampão. 14- Deixar secar o sedimento e ressuspender num volume apropriado de água (200 a 400 µL). 15- Identificar o tubo. 16- Conservar o DNA a 4 ºC até futura utilização

Soluções necessárias:

Tampão de extracção– CTAB “Cetyltrimethyl ammonium bromide3 % (p/v), NaCl 1,4 M, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM pH=8,0. Preparar 500 mL em água estéril. Clorofórmio:alcóol isoamílico 24:1 preparar 250 mL. Tampão de lavagem etanol 70 %, acetato de amónia 10 mM. Preparar 500 mL em água estéril. ou etanol a 75% Água estéril Autoclavar durante 20 minutos a 121 ºC. Isopropanol frio

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B. Quantificação espectrofotométrica de DNA genómico

Determinar a concentração de DNA genómico na solução final de acordo com a tabela fornecida, sabendo que

Absorvância 260 nm = 1 => ~ 50 µg mL -1

(DNA de cadeia dupla)

1- Diluir a suspensão de DNA 1:100 em água estéril num volume final de 1 mL.

2- Determinar os valores de absorvância da suspensão diluída a 260 e 280 nm (cuvete de

quartzo ou UVette), utilizando água como branco, registar os valores obtidos.

3- Determinar a [DNA] e o grau de pureza

Grupo

A

260nm

A

280nm

A

260 /A 280

[DNA] (µg/ µL)

1 µg = ? (µL)

1

         

2

         

3

         

4

         

Exemplo de cálculos:

A 260nm = 0,250 A 280nm = 0,215 Volume de DNA = 30 µL

[DNA]:

DO 260nm = 1,0 ---------------- - 50 µg DNA /mL DO 260nm = 0,250 --------------- x µg

x = 12,5 µg/mL

12,5 µg X 100 (factor diluição) = 1250 µg/mL = 1,25 µg/µL

Pureza:

A 260 /A 280 = 0,250/0,215 = 1,16 Suspensão contaminada com proteínas (<1,8)

1,8 2,0 suspensão pura

< 1,8 contaminação com proteínas

Manutenção do DNA

O

DNA purificado é ressuspendido em água estéril ou tampão TE (Tampão Tris/EDTA : 10mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA)

e

geralmente guardado no frigorífico, a 4°C. O DNA pode ser mantido por longos períodos de tempo no congelador (-

20°C), contudo, se está a ser utilizado com frequência, é preferível não o congelar, pois durante o processo de congelar/descongelar repetidas vezes, formam-se cristais de gelo que podem causar ruturas na molécula de DNA.

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C. Eletroforese em Gel de Agarose

C1.Montagem do gel:

1- Fechar as extremidades do suporte do gel e inserir o pente para definir os poços. 2- Preparar 25 mL agarose 1,0 % (p/v) em tampão TAE 1x num matraz de 100 mL; dissolver a agarose em forno micro-ondas ou em banho de água a ferver; depois de arrefecer para cerca de

50ºC, adicionar

3- Verter a agarose no suporte do gel e deixar solidificar. Cuidado, a agarose muito quente deforma o suporte do gel. 4- Abrir as extremidades do suporte do gel, retirar o pente. Atenção: poços do lado do cátodo. 5- Encher a tina com tampão TAE até cobrir a superfície do gel. Verificar se os poços estão preenchidos com tampão.

L de uma solução de GelRed 10.000x.

preenchidos com tampão.  L de uma solução de GelRed 10.000x. Remover cuidadosamente o pente, puxando-o

Remover cuidadosamente o pente, puxando-o na vertical

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C2. Carregar o gel:

1- Prepare uma amostra de 12 L contendo 1 g (

amostra 6x (concentração final 1x). Se necessário perfazer o volume com água. Deixar ficar as pontas usadas nos tubos. 2- Pipetar o conteúdo total de cada tubo para um poço do gel, usando a mesma ponta. 3- Estabilizar a pipeta sobre o poço com ambas as mãos 4- Expelir o ar da ponta antes de carregar o gel 5- Orientar verticalmente a ponta com a amostra com o centro do poço e submergi-la ligeiramente no tampão 6- Mergulhar a ponta da pipeta um pouco abaixo da superfície do líquido (não é necessário introduzir a ponta dentro do poço), posicioná-la na direção do poço e expelir a amostra muito lentamente, que cairá diretamente no poço devido à maior densidade do tampão de amostra Cuidado para não furar o gel com a ponta da pipeta.

L de tampão da

L) de DNA genómico e

da pipeta .  L de tampão da  L) de DNA genómico e C3. Eletroforese:
da pipeta .  L de tampão da  L) de DNA genómico e C3. Eletroforese:

C3. Eletroforese:

L de tampão da  L) de DNA genómico e C3. Eletroforese: 1- Fechar a câmara

1- Fechar a câmara de eletroforese e ligar os cabos elétricos a uma fonte de alimentação elétrica de modo a que o cátodo da câmara fique ligado ao cátodo da fonte (preto preto), assim como o ânodo (vermelho vermelho). Verificar se os poços com DNA estão do lado do cátodo (polo negativo). 2- Ligar a fonte de alimentação e regular a voltagem para 80 V. Verificar a formação de pequenas bolhas gasosas nos elétrodos da câmara. Passados alguns instantes de corrida, deve ver-se o corante deslocar-se no gel em direção ao polo positivo. Num gel de agarose a 1%, o azul de bromofenol desloca-se à mesma velocidade de um fragmento de DNA de aproximadamente 500 bp.

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3- Deixar de correr a eletroforese até o azul de bromofenol se encontrar a meio do gel. 4- Desligar a fonte de alimentação, desligar os cabos de ligação e remover a tampa da câmara de eletroforese. 5- Cuidadosamente, e usando luvas, retirar o gel com o respetivo suporte da câmara de eletroforese. 6- Examinar o gel com iluminação UV e registar o padrão de bandas em fotografia ou desenhando

e registar o padrão de bandas em fotografia ou desenhando numa folha de acetato sobreposta ao

numa folha de acetato sobreposta ao gel. Neste caso, não esquecer de marcar a posição dos poços. Atenção: proteger os olhos da radiação UV por meio de óculos adequados.

Nota: Quando um campo elétrico é aplicado através do gel conduz a uma migração dos diferentes fragmentos do DNA da amostra em direção ao polo positivo (a pH alcalino). As moléculas de DNA mais pequenas migram mais rapidamente do que as de maiores dimensões, e assim os fragmentos de diferentes tamanhos ficam separados em bandas diferentes. As bandas são visíveis com radiação UV devido a um composto que se liga à molécula de DNA (ex. GelRed).

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Unidade III Análise de DNA cortado com enzimas de restrição

ANÁLISE DE DNA CORTADO COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Usar sempre material e soluções esterilizadas

Neste trabalho, o DNA de bacteriófago Lambda (48502 pares de bases - bp = 48,5 kb), o DNA de uma cianobactéria (Nostoc sp. PCC 7120 7,2 Mb) serão cortados com enzimas de restrição e os fragmentos resultantes separados por eletroforese em gel de agarose. Duas amostras de cada DNA são incubadas a 37ºC, com uma das seguintes endonucleases de restrição: EcoRI ou HindIII. Uma terceira amostra, que constitui o controlo negativo, é incubada sem endonuclease.

As amostras de DNA são submetidas a electroforese em gel de agarose. Para um determinado DNA, o número e o padrão das bandas produzidas por cada enzima de restrição são característicos e constituem um “DNA fingerprint”.

A. Reações de restrição

Notas: As DNases são abundantes, nomeadamente nas mãos. Usar só material esterelizado e não tocar com as mãos nas pontas das pipetas e nas tampas e interior dos tubos “Eppendorf”.

Ao pipetar olhar sempre para a ponta da pipeta para verificar se entrou líquido. Pegar no tubo “Eppendorf” com a mão e colocar o líquido no fundo.

É necessário ter o máximo de cuidado com as enzimas de restrição para não desnaturarem: devem ser retiradas do frigorífico para um recipiente com gelo no momento da utilização.

1- Preparar seis reações de restrição em tubos “Eppendorf” (1,5 mL) de acordo com a seguinte tabela:

Tubo

DNA*

Tampão**

HindIII

EcoRI

H

2 O

Volume

10x

 

final

Controlo lambda

3

L

1 L

---

---

6

L

10

L

lambdaH

3

L

1 L

1 L

---

5

L

10

L

lambdaE

3

L

1 L

---

1 L

5

L

10

L

Controlo genómico cianobactéria

2

L

1 L

---

---

7

L

10

L

cianoH

2

L

1 L

1 L

---

6

L

10

L

cianoE

2

L

1 L

---

1 L

6

L

10

L

* 500 ng - 1 g, ** o tampão a utilizar é específico para cada uma das enzimas

2- Misturar os reagentes batendo suavemente na extremidade do tubo. Se necessário, centrifugar para evitar que fique líquido nas paredes.

3- Incubar todos os tubos de reacção por um período mínimo de 1h a 37ºC (FastDigest ~15 min).

4- Separar os fragmentos em gel de agarose a 1% em TAE 1x ou congelar as amostras (podem inativar-se as enzimas, ex. 80ºC 10 min).

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B. Resultados e Discussão

1- Os fragmentos lineares de DNA migram a velocidades inversamente proporcionais ao log 10 das suas

massas moleculares. Para simplificar, substitui-se a massa molecular dos fragmentos pelo seu

tamanho em pares de bases (bp).

2- Na tabela seguinte estão os tamanhos de fragmentos de DNA de Lambda originados por digestão

com HindIII:

HindIII

 

EcoRI

Distância (mm)

bp real

Distância (mm)

bp calculado

bp real

 

23130

     

9416

6557

4361

2322

2027

*564

*125

* estas bandas podem não ser visíveis

3- Medir a distância, em mm, desde o bordo do poço a cada uma das bandas e registar na tabela.

4- Fazer corresponder a distância a cada banda ao tamanho do respectivo fragmento.

5- Usando papel semi-logarítmico, marcar a distância migrada no eixo dos xx e o logarítmo de kb no

eixo dos yy, para cada fragmento de HindIII. Unir os pontos.

6- Usar a curva obtida para determinar o tamanho, em kb dos fragmentos obtidos com a EcoRI, a partir

das distâncias migradas.

7- Registar o valor obtido na tabela, na coluna correspondente a “bp calculado”. Comparar com os

valores reais.

8- Descreva o que observou no caso do DNA da cianobactéria.

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13 Imagem do gel obtido após electroforese de produtos de restrição do DNA de fago Lambda
13 Imagem do gel obtido após electroforese de produtos de restrição do DNA de fago Lambda

Imagem do gel obtido após electroforese de produtos de restrição do DNA de fago Lambda cortado com EcoRI, Hind III e do DNA não cortado

Compare o número de bandas visíveis no gel com o número de bandas esperadas a partir do mapa de restrição da pág. 20.

Justifique as diferenças

no gel com o número de bandas esperadas a partir do mapa de restrição da pág.

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25 50 75 100 125 150 175
25
50
75
100
125
150
175

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Exercícios:

1- Foi realizada uma extração de DNA a partir de tecido foliar e o DNA obtido foi ressuspendido em água (amostra de DNA). A absorvância (λ=260nm) desta amostra de DNA diluída de 1:100 foi de

0,175.

1.1- Sabendo que uma Abs λ260nm = 1.0 corresponde a uma concentração de DNA em cadeia dupla de 50 µg/mL, calcule a concentração de DNA na amostra.

1.2- Qual a composição do ensaio a branco e para que o utilizaria?

2-

composição do ensaio a branco e para que o utilizaria? 2- Estimating concentrations of DNA templates

Estimating concentrations of DNA templates using Lambda DNA HindIII digest solution as a standard:

Total size of Lambda DNA: 48502 bp. Concentration: 200ng/l Load on gel 10l = 2000ng, 5l = 1000ng, 2.5l = 500ng

Band

bp

% of total

Load 2g=

ng

of

Load 1g=

ng

of

Load 0.5g=

ng

of

#

size

DNA

DNA

DNA

1

23,130

47.69%

954ng

477ng

238.5ng

2

9,416

19.41%

388ng

194ng

97ng

3

6,557

13.52%

270ng

135ng

67.5ng

4

4,361

8.99%

180ng

90ng

45ng

5

2,322

4.79%

96ng

48ng

24ng

6

2,027

4.18%

84ng

42ng

21ng

7

564

1.16%

23ng

11.5ng

5.75ng

8

125

0.26%

5ng

2.5ng

1.25ng

Total

48502

100%

2000ng

1000ng

500ng

Total 48502 100% 2000ng 1000ng 500ng 2.1- Partindo do facto que em condições normais só é

2.1- Partindo do facto que em condições normais só é bem visível uma banda de DNA com 10 ng de

massa (visualizada com brometo de etídio/UV), qual será a massa total de DNA de lambda cortado

com Hind III a carregar no gel para que a banda de 125 bp fosse visível?

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3 - Na figura estão representados os mapas de restrição de um fragmento de DNA de 18 000 bp obtidos para a enzima de restrição A e para a enzima de restrição B respectivamente.

 

A

A

Enzima A |

|

|

|

 

3500

1000

13500

B

 

B

Enzima B

|

|

|

|

2000

10000

6000

Faça os dois mapas de restrição possíveis do fragmento de DNA de 18 kb cortado com as duas enzimas A e

B.

4- O esquema seguinte representa um mapa de restrição de um fragmento de DNA obtido após digestão com as enzimas EcoRI e HindIII:

HindIII HindIII HindIII EcoRI EcoRI DNA Escala 0 1 2 3 4 5 6 7
HindIII
HindIII
HindIII
EcoRI
EcoRI
DNA
Escala
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
kb

A digestão simultânea do fragmento de DNA com as duas enzimas de restrição origina os seguintes fragmentos:

a) 1 kb, 2 kb (2 fragmentos), 5,5 kb e 7,5 kb

b) 1kb, 2,5 kb, 3 kb, 4,5 kb e 5 kb

c) 1 kb (2 fragmentos), 1,5 kb, 2 kb, 4 kb e 4,5 kb

d) 1 kb (2 fragmentos), 1,5 kb ,2kb, 4 kb e 5,5 kb

e) 1 kb, 1,5 kb (2 fragmentos), 4,5 kb e 5, 5 kb