1.

Introduo
O DNA formado por um encadeamenteo de nucleotdeos e organizado em duas fitas, formando uma dupla hlice e sua funo relaciona-se com armazenamento e transmisso da informao gentica de um organismo. Os nucleotdeos que formam o DNA, so molculas formadas por uma pentose ( 2'desoxyribose) ligada a uma base orgnica e a um cido fosfrico. Estas bases orgnicas podem ser Adenina, Guanina, Citosina e Timina, comumente representadas por sua letra inicial, A, G, C, T, respectivamente. As bases orgnicas que compem os nucleotdeos so formadas por anis contendo carbono e nitrognio. A Adenina e a Guanina, possuem dois destes aneis e so classificadas como purinas. J a Citosina e a Timina, possem apenas um anel formado de carbono e nitrognio e so classificadas como pirimidinas, como mostra a Figura 1.

Figura 1. Ilustrao das bases orgnicas que compem os nucleotdeos.

Para manter a estrutura do DNA, Figura 2, estas bases so combinadas aos pares, de forma que uma purina seja ligada a uma pirimidina. As ligaes padro so A - T, uma purina (Adenina), com uma pirimidina (Timina) ou G - C, uma purina (Guanina) com uma pirimidina (Citosina). Apesar de ocorrerem outras combinaes, so alteraes muito raras.

Figura 2. Ilustrao da hlice do DNA indicando o pareamento das bases.

No decorrer deste trabalho, discutiremos sobre as propriedades bem como tcnicas de manipulao e anlise do DNA vegetal obtido do espinafre.

2. Objetivo
O objetivo do presente estudo isolar o DNA vegetal e analisar o quo eficiente a extrao. Conhecer, aplicar e utilizar a tcnica de eletroforese em gel de agarose para estimar o tamanho do DNA isolado. E por ltimo, analisar a desnaturao trmica da molcula de DNA e obter a temperatura de desnaturao.

3. Parte Experimental
Seguiu-se o roteiro experimental fornececido em sala de aula, algumas alteraes foram realizadas e esto descritas posteriormente. Os seguintes reagentes e solues foram utilizados nesse mdulo: Espinafre Tampo de Extrao: 10 mM Tris-HCl, 2,5 % de SDS, 0,15 M HCl, 0,15 M NaCl e 1 mM EDTA, pH=7,6 Soluo saturada de fenol Clorofrmio lcool isoamlico lcool etlico

Tampo de corrida TBE (Tris-borato 10x): para 100 mL de tampo utiliza-se 10,8 g de tris-base, 5,5 g de cido brico, 4 mL de soluo de EDTA 0,5 mol/L pH=8,0 e gua deionizada. Tampo de amostra: 25 mg de azul de bromofenol, 4 g de sacarose, gua deionizada (q.s.p. para 7 mL), o pH final 8 e corrigido utilizando soluo de NaCl 1 mol/L.

3.1. Isolamento do DNA Pesou-se 10 g de espinafre e homogeinizou-se com 20 mL de tampo extrao com o auxlio de um almofariz com pistilo durante cinco minutos. Retirou-se os pedaos grandes e transferiu-se a mistura para um erlenmeyer de 250 mL. Para desproteinar a mistura utilizou-se 10 mL de soluo saturada de fenol gelado. Centrifugou-se por dez minutos em rotao mxima, aps separou-se a parte aquosa da orgnica. Repetiu-se esse pocedimento at que a parte aquosa, parte que contm o DNA, estivesse livre de particulados. Preparou-se uma soluo de clorofrmio com lcool isoamlico 24:1, respectivamente. Utilizou-se essa soluo para aumentar em duas vezes o volume da parte aquosa obtida anteriormente. Centrifugou-se a nova mistura por trs vezes a fim que no ocorre mais a precipitao de protenas na interface das fases orgnicas e aquosa. Para precipitar os cidos nuclicos, utilizou-se lcool etlico 4C (mesmo volume da fase aquosa) e 6 gotas de soluo de NaCl 2 mol/L e adicionou-se fase aquosa. Misturou-se e centrifugou-se por dez minutos, o sobrenadante foi descartado. Misturou-se o DNA obtido na ltima centrifugao em 15 mL de gua e obteve-se os valores de absorbncias em 260 e 280 nm. Como a nossa amostra estava muito concentrada, diluiu-se o DNA em gua 1:5, respectivamente, e obteve-se novamente os valores de absorbncias. 3.2. Eletroforese em Gel de Agarose Preparou-se a soluo de agarose 0,8 % em 60 mL de tampo de corrida TBE, depois dilui-se 1x e aqueceu at que a soluo tornar-se transparente. Aplicoou-se a soluo de agarose ainda quente no suporte e colocou-se o pente, deixou-se solidificar por aproximadamente trinta minutos.

Colocou-se o gel na cuba e adicionou-se o tampo de corrida TBE at 1 cm acima do gel (aproximadamente 220 mL), retirou-se o pente e as amostras foram aplicadas nos pocinhos de forma que elas no extravasassem, em uma voltagem de 100 V por aproximadamente sessenta minutos. Usou-se trs amostras DNA padro, DNA concentrado e DNA diludo misturado com o tampo amostra. Transferiu-se o gel para um bquer e adicionou-se o tampo de corrida at cobri-lo. Adicionou-se a soluo de brometo de etdeo de forma que a concentrao final fosse de 1 g/mL e incubou-se por trinta minutos aproximadamente. Observou-se as posies das amostras de DNA isolado sob uma lmpada de luz UV e calculou-se o tamanho do DNA isolado do espinafre. Obteve-se algumas complicaes durante a parte experimental, as amostras aplicadas na corrida no ficavam no fundo dos pocinhos, possivelmente alteraes como a concentrao de sacarose da soluo tampo pode influenciar esse problema.

Figura 3. Ilustrao do equipamento utilizado experimentalmente na eletroforese em gel de agarose (figura feita por Adriana Medaglia).

3.3. Desnaturao Trmica do DNA Nessa parte do mdulo, utilizou-se a amostra de DNA diludo em gua 1:5 preparado na parte 3.2. Essa amostra foi diluda novamente em gua 1:2. Aps a diluio, dividiu-se a amostra em sete tubos de ensaio e incubou-os nas seguintes temperaturas: 23C (ambiente), 40C, 50C, 60C, 70C, 80C e 100C durante trinta minutos. Aps atingir o equilbro trmico obteve-se os valores de absorbncia no comprimento de onda de 260 nm para todas as sete amostras.

4. Resultados e Discusso
4.1. Isolamento de DNA O isolamento de DNA de plantas e de material vegetal proveniente de cultura de tecidos uma etapa importante na anlise da sua estrutura e sua organizao. Preparaes de DNA vegetal tambm so, comumente, utilizadas como substratos em reaes de PCR e outras tcnicas. Independente do tipo de estudo molecular, as preparaes de DNA devem produzir amostras puras suficientes para no inibir os tratamentos enzimticos ou causar interferncias nos padres de migrao em gel de eletroforese. Os cidos nucleicos (DNA e RNA) absorvem luz no comprimento de onda de 260nm. Dessa forma, podem ser quantificados em espectrofotmetro. J as protenas absorvem luz no comprimento de onda de 280nm. Nesse sentido, a relao absorbncia de 260nm/280nm fornece um parametro de qualidade do DNA. Razo entre 1,8 e 2,2 considerada ideal. Valores inferiores a 1,8 indicam excesso de protenas e, valores superiores, excesso de solventes orgnicos.3 Nesse experimento, obtivemos a seguinte razo entre as absorbncias para a amostra de DNA diluda, conforme a seo 3.1: 260nm / 280nm = 1,05 / 0,728 = 1,45 ~ 1,5 A amostra de DNA analisada possui uma razo de 1,5, isso indica o excesso de protenas presente no material que poderia ser menor se algumas etapas do processo de isolamento fossem repetidas por mais algumas vezes. 4.2. Eletroforese em gel de agarose O princpio dessa tcnica est baseado no fato da molcula de DNA possuir carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e consequentemente, quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel submetida a um campo eltrico, migra em direo ao plo positivo (ando). A velocidade da migrao depende do tamanho da molcula. Por isso em um dado momento da eletroforese molculas de tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos da matriz. O tipo de matriz que usada (agarose ou poliacrilamida) depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Devido diferena no tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se normalmente o gel de agarose para a separao de

fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases) e o gel de poliacrilamida para separao de fragmentos pequenos, de at 1kb. Nesse experimento, utilizou-se a agarose, um polissacardeo extrado de uma alga marinha vermelha e formado por resduos de D e L galactose unidos por ligaes glicosdicas (13) e (14), um material gelatinoso e semelhante a gelatina incolor. O uso do gel de agarose pode ser desvantajoso, pois frequentemente utiliza-se a colorao com brometo de etdio (EtBr), uma substncia mutagnica. Em adio, para a visualizao do DNA corado com EtBr, necessria a utilizao de luz ultravioleta. Antes da aplicao, as amostras de DNA foram misturadas a um tampo de amostra. O tampo de amostra contm corantes e reagentes de alta densidade (sacarose, glicerol ou ficol) que asseguram que a amostra de DNA entre no poo pela fora da gravidade. O mtodo mais usual para se visualizar o DNA em gis de agarose por colorao com brometo de etdeo (EtBr), esse corante se intercala entre as bases dos cidos nuclicos e, na presena de luz Ultra Violeta (entre 260 e 360nm), fluoresce em vermelho alaranjado (590nm). Com este mtodo pode-se detectar uma quantidade igual ou maior que 10 ng de DNA e a intensidade de fluorescncia emitida proporcional concentrao de DNA presente na amostra. O brometo de etdeo pode ser utilizado de 3 diferentes formas: aplicado diretamente no gel (uso mais frequente), no tampo da amostra a ser aplicada, ou aps a corrida quando o gel submergido em soluo de EtBr. Na Figura 4, temos o resultado da corrida de eletroforese em gel de agarose da amostra isolada de DNA do espinafre. Observa-se na banda 1, o DNA padro fragmentado e com boa resoluo das bandas. Em contrapartida, nas bandas 2 e 3 encontram-se as amostras de DNA isolado concentrado e diludo, respectivamente conforme a seo 3.1. Nessas bandas no observa-se a migrao dos fragmentos ao polo positivo como o esperado e nem uma notria emisso de fluorescncia, impossibilitando estimar o tamanho dos fragmentos de DNA. Durante o experimento, ocorreu diversos contratempos principalmente no momento de aplicao das amostras nos pocinhos, o que pode ter desencadeado o resultado obtido. As amostras quando aplicados nos pocinhos no se continham no fundo dos mesmos, ocorrendo vazamentos e diluio com o tampo. Esse problema pode ter ocorrido devido a alteraes na concentrao de sacarose do tampo utilizado, que garante assegura que a amostra de DNA entre no poo pela fora da gravidade.

Figura 4. Gel de agarose da aula experimental aps corrida eletrofortica com brometo de etdeo sob iluminao de luz ultravioleta. Em (1) amostra de DNA padro fornecido na aula experimental; (2) amostra de DNA isolado, obtido conforme seo 3.1; (3) amostra de DNA diludo, obtido conforme seo 3.1. As outras bandas no demarcadas na foto representam os contratempos que obteve-se durante a aula experimental.

4.3. Desnaturao Trmica do DNA A desnaturao de cidos nucleicos acompanhado por um aumento da absorbncia no comprimento de onda a 260 nm. Este aumento de absorbncia denominado por Efeito hipercrmico, o qual deve-se separao das bases de cadeias complementares. Existem vrios mtodos para promover a desnaturao de cidos nucleicos, como aquecimento, aumento de pH, mtodos qumicos (por ex., utilizao de formaldedo que promove a formao de bases Schiff, as quais, por sua vez, impedem a formao de pontes de hidrognio), adio de formamida e abaixamento da fora inica. No entanto, o mtodo mais utilizado o aumento da temperatura do DNA. Nesse experimento, o objetivo foi determinar experimentalmente a temperatura de desnaturao (Tm) que corresponde temperatura qual 50 % das molculas de um dado cido nucleico se encontram desnaturadas, conforme mostra o exemplo na Figura 5. Essa temperatura est ligada estabilidade trmica da molcula de cido desoxirribonucleico (DNA), Mandel & Marmur (1968) determinaram que essa estabilidade diretamente proporcional ao nmero de pares guanina citosina (G-C) de uma molcula de DNA.

Figura 5. Curva de desnaturao de um cido nucleico por aumento da temperatura. Temperatura de Desnaturao (Tm) corresponde temperatura qual uma dada molcula de DNA se encontra 50 % no estado de cadeia dupla e 50 % no estado de cadeia simples .

Experimentalmente, obteve-se o grfico mostrado na Figura 6 com valores de absorbncia no comprimento de onda de 260 nm. A desnaturao em % mostrada no grfico foi calculada conforme a frmula descrita na Figura 5. Sabe-se que Tm a temperatura qual 50 % das molculas de um dado cido nucleico se encontram desnaturadas, assim atravs do grfico, Figura 6, pode-se estimar T m em torno de 60C.

Figura 4. Grfico de desnaturao da amostra de DNA isolado experimentalmente versus temperatura.

A forma sigmide da curva, permite-nos afirmar que o processo de desnaturao

um

processo

cooperativo.

Com

aumento

da

temperatura

interaces

intramoleculares responsveis pela manuteno da estrutura tridimensional que vo enfraquecendo progressivamente.

5. Concluso
A amostra de DNA isolado possui uma razo de 1,5, isso indica o excesso de protenas presente no material que poderia ser menor se algumas etapas do processo de isolamento fossem repetidas por mais algumas vezes. No procedimento de eletroforese em gel de agarose no foi possvel determinar o tamanho dos fragmentos de DNA devido a erros experimentais, as amostras quando aplicadas nos pocinhos no se continham no fundo dos mesmos, ocorrendo vazamentos e diluio com o tampo. Esse problema pode ter ocorrido devido a alteraes na concentrao de sacarose do tampo utilizado, que assegura que a amostra de DNA entre no poo pela fora da gravidade. Utilizando os dados experimentais, foi possvel estimar Tm em torno de 60C, a forma sigmide da curva, permite-nos afirmar que o processo de desnaturao um processo cooperativo.

6. Bibliografia
1. VOET, Donald; VOET, Judith G. Biochemistry. 3rd ed. New York, NY: John Wiley, c2004. 2v., il. +. Inclui indice. ISBN 047119350x (enc.). 2. LEHNINGER, Albert L. Biochemistry: the molecular basis of cell structure and function. 2nd ed. New York, NY: Worth, 1978. 1104 p. 3. Gl. Sci. Technol., v. 02, n. 01, p. 22 33, jan/abr. 2009.