NORMA ABNT NBR

BRASILEIRA ISO
9308-1
Primeira edição
30.08.2021

Qualidade da água — Enumeração de

Escherichia coli e bactérias coliformes
Parte 1: Método de filtração por membrana para
águas com baixa carga bacteriana de fundo
Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria
Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora
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ICS 07.100.20 ISBN 978-85-07-08650-5

Número de referência
ABNT NBR ISO 9308-1:2021
10 páginas

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Sumário Página

Prefácio Nacional................................................................................................................................iv
Introdução.............................................................................................................................................v
1 Escopo.................................................................................................................................1
2 Referências normativas......................................................................................................1
3 Termos e definições............................................................................................................2
4 Princípio...............................................................................................................................2
5 Materiais e utensílios de vidro...........................................................................................2
6 Meio de cultura e reagentes...............................................................................................3
7 Amostragem........................................................................................................................3
8 Procedimento......................................................................................................................3
8.1 Preparação da amostra.......................................................................................................3
8.2 Filtração...............................................................................................................................3
8.3 Incubação e diferenciação.................................................................................................3
9 Expressão de resultados....................................................................................................4
10 Relatório de ensaio.............................................................................................................4
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11 Garantia da qualidade.........................................................................................................4
11.1 Geral.....................................................................................................................................4
11.2 Teste de desempenho do ágar coliforme cromogênico (CCA).......................................5
11.3 Teste de desempenho do teste de oxidase......................................................................5
Anexo A (informativo) Informações microbiológicas adicionais sobre bactérias coliformes........6
Anexo B (normativo) Composição e preparação de meios de cultura e reagentes........................7
B.1 Ágar Coliforme Cromogênico (CCA).................................................................................7
B.2 Reagente de oxidase...........................................................................................................8
B.3 Ágar Triptona Soja (TSA)....................................................................................................8
Anexo C (informativo) Características de desempenho.....................................................................9
Bibliografia..........................................................................................................................................10

Tabelas
Tabela 1 – Teste de desempenho do ágar coliforme cromogênico.................................................5
Tabela C.1 – Características de desempenho do ágar coliforme cromogênico.............................9

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Prefácio Nacional

A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Foro Nacional de Normalização. As Normas

Brasileiras, cujo conteúdo é de responsabilidade dos Comitês Brasileiros (ABNT/CB), dos Organismos
de Normalização Setorial (ABNT/ONS) e das Comissões de Estudo Especiais (ABNT/CEE), são
elaboradas por Comissões de Estudo (CE), formadas pelas partes interessadas no tema objeto
da normalização.

Os Documentos Técnicos internacionais adotados são elaborados conforme as regras da

ABNT Diretiva 3.

A ABNT chama a atenção para que, apesar de ter sido solicitada manifestação sobre eventuais direitos
de patentes durante a Consulta Nacional, estes podem ocorrer e devem ser comunicados à ABNT
a qualquer momento (Lei nº 9.279, de 14 de maio de 1996).

Os Documentos Técnicos ABNT, assim como as Normas Internacionais (ISO e IEC), são voluntários
e não incluem requisitos contratuais, legais ou estatutários. Os Documentos Técnicos ABNT não
substituem Leis, Decretos ou Regulamentos, aos quais os usuários devem atender, tendo precedência
sobre qualquer Documento Técnico ABNT.
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Ressalta-se que os Documentos Técnicos ABNT podem ser objeto de citação em Regulamentos
Técnicos. Nestes casos, os órgãos responsáveis pelos Regulamentos Técnicos podem determinar
as datas para exigência dos requisitos de quaisquer Documentos Técnicos ABNT.

A ABNT NBR ISO 9308-1 foi elaborada pela Comissão de Estudo Especial de Microbiologia de
Alimentos (ABNT/CEE-157). O Projeto circulou em Consulta Nacional conforme Edital nº 07,
de 22.07.2021 a 23.08.2021.

A ABNT NBR ISO 9308-1 é uma adoção idêntica, em conteúdo técnico, estrutura e redação, à
ISO 9308-1:2014, incorporando a Amd 1:2016, que foram elaboradas pelo Technical Committee Water
quality (ISO/TC 147), Subcommittee Microbiological methods (SC 4).

A ABNT NBR ISO 9308, sob o título geral “Qualidade da água – Enumeração de Escherichia coli e
bactérias coliformes”, tem previsão de conter as seguintes partes:

— Parte 1: Método de filtração por membrana para águas com baixa carga bacteriana de fundo

— Parte 2: Método de número mais provável

— Parte 3: Método miniaturizado (número mais provável) para a detecção e enumeração de E. coli
em águas superficiais e residuais

O Escopo em inglês da ABNT NBR ISO 9308-1 é o seguinte:

Scope
This Part of ISO 9308 specifies a method for the enumeration of Escherichia coli (E. coli) and coliform
bacteria. The method is based on membrane filtration, subsequent culture on a chromogenic coliform
agar medium, and calculation of the number of target organisms in the sample. Due to the low selectivity
of the differential agar medium, background growth can interfere with the reliable enumeration of E. coli
and coliform bacteria, for example, in surface waters or shallow well waters. This method is not suitable
for these types of water.

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Introdução

A presença e a extensão da poluição fecal é um fator importante na avaliação da qualidade da água

e o risco de infecção para a saúde humana. O ensaio de amostras de água para a presença de
Escherichia coli (E. coli), que normalmente habita o intestino do homem e de outros animais de sangue
quente, fornece uma indicação dessa poluição. O ensaio de bactérias coliformes pode ser mais difícil
de interpretar porque algumas bactérias coliformes vivem no solo e na superfície da água doce e nem
sempre são intestinais. Portanto, a presença de bactérias coliformes, embora não seja uma prova de
contaminação fecal, pode indicar falha no tratamento, armazenamento ou distribuição.
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Qualidade da água — Enumeração de Escherichia coli e bactérias coliformes

Parte 1: Método de filtração por membrana para águas com baixa carga
bacteriana de fundo

ADVERTÊNCIA – As pessoas que usam este Documento devem estar familiarizadas com as
práticas usuais de laboratório. Este Documento não pretende abordar todos os problemas
de segurança, se houver, associados ao seu uso. É responsabilidade do usuário estabelecer
práticas adequadas de segurança e saúde e assegurar a conformidade com quaisquer condições
regulatórias nacionais.

IMPORTANTE – É absolutamente essencial que os ensaios conduzidos de acordo com este

documento sejam realizados por pessoal devidamente qualificado.

1 Escopo
Esta Parte da ISO 9308 especifica um método para a enumeração de Escherichia coli (E. coli) e
bactérias coliformes. O método é baseado na filtração por membrana, cultivo subsequente em meio
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de ágar coliforme cromogênico e cálculo do número de organismos-alvo na amostra. Devido à baixa

seletividade do meio de ágar diferencial, o crescimento de fundo pode interferir na enumeração confiável
de E. coli e bactérias coliformes, por exemplo, em águas superficiais ou águas rasas de poços. Este
método não é adequado para esses tipos de água.

NOTA BRASILEIRA No Brasil, o termo “background” (de fundo) também é conhecido como “acompanhante”.

Esta Parte da ISO 9308 é especialmente adequada para águas com baixo número de bactérias que
resultarão em menos de 100 colônias totais no ágar coliforme cromogênico (CCA). Pode ser água
potável, água desinfetada de piscina ou água final de estações de tratamento de água potável.

Algumas cepas de E. coli que são β-D-glucuronidase negativas, como Escherichia coli O157, não serão
detectadas como E. coli. Como são positivos para β-D-galactosidase, eles aparecerão como bactérias
coliformes neste ágar cromogênico.

2 Referências normativas
Os documentos a seguir são citados no texto de tal forma que seus conteúdos, totais ou parciais,
constituem requisitos para este Documento. Para referências datadas, aplicam-se somente as edições
citadas. Para referências não datadas, aplicam-se as edições mais recentes do referido documento
(incluindo emendas).

ISO 3696, Water for analytical laboratory use – Specification and test methods

ISO 7704, Water quality – Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses

ISO 8199, Water quality – General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture

ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water – Preparation, production, storage and performance
testing of culture media

ISO 19458, Water quality – Sampling for microbiological analysis

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3 Termos e definições
Para os efeitos deste documento, as definições fornecidas no ABNT ISO/IEC Guia 2 e as seguintes
se aplicam.

3.1
bactéria coliforme
membros das Enterobacteriaceae que expressam β-D-galactosidase

3.2
Escherichia coli
E. coli
membro da Enterobacteriaceae que expressa β-D-galactosidase e β-D-glucuronidase

4 Princípio
Filtração de uma alíquota de ensaio da amostra através de um filtro de membrana, que retém os organismos,
e colocação do filtro de membrana em uma placa de ágar coliforme cromogênico.
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Incubação do filtro de membrana a (36 ± 2) °C por (21 a 24) h.

Contagem de colônias positivas para β-D-galactosidase (rosa a vermelho) como bactérias coliformes
presuntivas que não são E. coli. Para evitar resultados falso-positivos, causados por bactérias positivas
para oxidase, por exemplo, Aeromonas spp, as colônias presuntivas devem ser confirmadas por uma
reação oxidase negativa.

Contagem de colônias positivas para β-D-galactosidase e β-D-glucuronidase (azul escuro a violeta)

como E. coli.

Bactérias coliformes totais são a soma de colônias oxidase negativas com coloração rosa a vermelha
e todas as colônias azuis escuras a violeta.

5 Materiais e utensílios de vidro

A seguir está o instrumental usual de laboratório microbiológico.

5.1 Aparelhos adequados para esterilização por vapor (autoclave), de acordo com as instruções
fornecidas na ISO 8199.

5.2 Incubadora, termostaticamente controlada a (36 ± 2) °C.

5.3 Peagômetro, com exatidão de ± 0,1 entre 20 °C e 25 °C.

NOTA BRASILEIRA O equipamento medidor de pH, denominado “peagômetro”, é conhecido também no

meio técnico pelo jargão “peagâmetro”.

5.4 Instrumental para filtração por membrana.

5.5 Filtros de membrana, compostos de ésteres de celulose ou outro material adequado, geralmente
cerca de 47 mm ou 50 mm de diâmetro, com características de filtração equivalentes a um diâmetro
nominal de poro de 0,45 µm e, preferencialmente, com linhas de grade.

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Os filtros de membrana devem estar isentos de propriedades inibidoras ou promotoras de crescimento

e a tinta de impressão usada para a grade não pode afetar o crescimento de bactérias. Se não forem
adquiridos estéreis, devem ser esterilizados de acordo com as instruções do fabricante. Cada lote
de filtros de membrana deve ser testado quanto à sua adequação para o ensaio de acordo com a
ISO 7704, especialmente porque o uso de diferentes marcas de filtros de membrana pode resultar em
variações na recuperação e desenvolvimento de cor.

5.6 Pinça desinfetada, para manuseio de filtros de membrana.

6 Meio de cultura e reagentes

Para a preparação de meios de cultura e reagentes, ver ISO 8199 e ISO 11133. Usar ingredientes de
qualidade uniforme e produtos químicos de grau analítico (ver nota); seguir as instruções fornecidas no
Anexo B. Alternativamente, usar meios e reagentes disponíveis no mercado que estejam em conformidade
com as composições fornecidas no Anexo B e seguir estritamente as instruções do fabricante.

NOTA O uso de produtos químicos de outros graus é possível, desde que seja demonstrado que eles têm
o mesmo desempenho no ensaio.

Para a preparação dos meios de cultura, usar água destilada ou água deionizada isenta de substâncias
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que possam inibir o crescimento bacteriano nas condições do ensaio e que esteja de acordo com a
ISO 3696.

7 Amostragem
Coletar as amostras e entregá-las ao laboratório de acordo com a ISO 19458.

8 Procedimento
8.1 Preparação da amostra
Para a preparação da amostra, filtração e inoculação em meio de isolamento, seguir as instruções
fornecidas na ISO 8199. As amostras têm que ser transportadas e armazenadas a (5 ± 3) °C de acordo
com a ISO 19458. Em circunstâncias excepcionais, as amostras podem ser mantidas a (5 ± 3) °C
por até 24 h antes do ensaio. Neste caso, o tempo de armazenamento tem que ser mencionado no
relatório de ensaio.

8.2 Filtração
Filtrar 100 mL (ou outros volumes, por exemplo, 250 mL para água engarrafada) da amostra a ser
estudada usando um filtro de membrana (5.5). O volume mínimo para filtração é de 10 mL de amostra
ou diluições para assegurar uma distribuição uniforme das bactérias no filtro de membrana.

8.3 Incubação e diferenciação

Após a filtração (8.2), colocar o filtro de membrana no Ágar Coliforme Cromogênico (CCA) (B.1),
assegurando que nenhum ar fique preso embaixo, inverter a placa de Petri e incubar a (36 ± 2) °C por
(21 a 24) h.

Examinar os filtros de membrana e contar todas as colônias que apresentarem uma reação
β-D-galactosidase positiva (rosa a vermelho) como bactérias coliformes presuntivas que não são E. coli.

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Contar todas as colônias que apresentarem uma reação β-D-galactosidase e β-D-glucuronidase

positiva (azul escuro a violeta) como E. coli.

Para confirmar as bactérias coliformes presuntivas que não são E. coli, um teste de oxidase tem que ser
realizado. Testar preferencialmente todas, ou pelo menos 10 colônias rosas a vermelhas selecionadas
conforme descrito na ISO 8199. Para esta etapa de confirmação, testes de oxidase comercializados
apropriados podem ser usados.

Se o teste de oxidase comercial não for usado, o teste de oxidase pode ser realizado adicionando
duas a três gotas de reagente de oxidase recém-preparado (B.2) em um papel de filtro em uma placa
de Petri. As colônias que tem que ser confirmadas são transferidas para o papel de filtro pré-tratado
usando uma alça de inoculação de plástico ou platina. Uma reação de oxidase positiva é mostrada
pelo aparecimento de uma cor azul escura em 30 s. Isto não pode ser observado para bactérias coliformes,
uma vez que são oxidase negativas.

Se muitas colônias cresceram no filtro de membrana ou se uma colônia presuntiva estiver localizada
próxima a outras colônias, pode ser necessário preparar subculturas das colônias presuntivas para
assegurar que o teste de oxidase seja realizado com culturas puras. Também é necessário fazer
subculturas se as colônias presuntivas forem muito pequenas para um desempenho confiável do teste
de oxidase. Subcultivar em um ágar não seletivo (por exemplo, B.3) a (36 ± 2) °C por (21 ± 3) h.
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9 Expressão de resultados
A partir do número de colônias confirmadas contadas no filtro de membrana (8.3), calcular o número
de E. coli e bactérias coliformes presentes em 100 mL da amostra (ou outro volume filtrado) de acordo
com a ISO 8199. A contagem de bactérias coliformes é a soma de todas as colônias rosas a vermelhas,
oxidase negativas, mais todas as colônias do azul-escuro ao violeta. E. coli são todas colônias de azul
escuro a violeta.

10 Relatório de ensaio
O relatório de ensaio deve conter pelo menos as seguintes informações:

a) o método de ensaio utilizado, juntamente com uma referência a esta Parte da ABNT NBR ISO 9308
(ABNT NBR ISO 9308-1:2021);

b) todas as informações necessárias para a identificação completa da amostra;

c) os resultados expressos de acordo com a Seção 9;

d) qualquer ocorrência particular observada durante o curso da análise e quaisquer operações não
especificadas nesta Parte da ABNT NBR ISO 9308 que possa ter influenciado os resultados.

11 Garantia da qualidade
11.1 Geral

O laboratório deve ter um sistema de controle de qualidade claramente definido para garantir que
a aparelhagem, os reagentes e as técnicas sejam adequados para o ensaio. O uso de controles positivos,
controles negativos e brancos faz parte do ensaio.

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11.2 Teste de desempenho do ágar coliforme cromogênico (CCA)

Para a definição de produtividade, seletividade e especificidade, ver a ISO 11133. O desempenho do

CCA deve ser testado de acordo com os métodos e critérios descritos na ISO 11133.

A Tabela 1 apresenta os testes de desempenho para CCA.

Tabela 1 – Teste de desempenho do ágar coliforme cromogênico

Função Incubação Cepas-controle a Meio de Método de Critério Reações
referência controle (Produtividade) características
Produtividade (21 a 24) h/ E. coli TSA Quantitativo PR ≥ 0,7 Colônias de
(36 ± 2) °C WDCM 00013 ou azul escuro
a violeta
WDCM 00012
Ent. aerogenes TSA Quantitativo PR ≥ 0,7 Colônias
WDCM 00175 ou de rosa
ao vermelho
C. freundii
WDCM 00006
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Seletividade (21 a 24) h/ E. faecalis – Qualitativo Inibição total –

(36 ± 2) °C WDCM 00087 ou ou parcial
WDCM 00009
Especificidade (21 a 24) h/ P. aeruginosa – Qualitativo – Colônias
(36 ± 2) °C WDCM 00024 incolores
a Consultar o catálogo de cepas de referência disponível (visto 2016-10-28) em http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_
Reference_ Strain_Catalogue.pdf para obter os números de cepas de coleta de cultura e detalhes de contato.

11.3 Teste de desempenho do teste de oxidase

Exemplos de cepas-controle adequadas são Pseudomonas aeruginosa WDCM 00024 [7] (controle
positivo), Escherichia coli WDCM 00013 [7] ou WDCM 00012 [7] (controle negativo).

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Anexo A
(informativo)

Informações microbiológicas adicionais sobre bactérias coliformes

Além de expressar atividade β-D-galactosidase, as bactérias coliformes são bactérias Gram-negativas

não formadoras de esporos, oxidase negativas e em forma de bastonete, que são capazes de crescimento
aeróbio e anaeróbio facultativo na presença de sais biliares (ou outros agentes surfactantes com
semelhantes propriedades inibidoras de crescimento) e que são normalmente capazes de fermentar
lactose com a produção de ácido e aldeído em 48 h quando incubados a uma temperatura de (36 ± 2) °C.

Além de expressar atividade β-D-glucuronidase, E. coli são bactérias coliformes que são capazes de
produzir indol a partir do triptofano a (44,0 ± 0,5) °C em (21 ± 3) h. Portanto, em caso de dúvida sobre
as colônias de E. coli no meio de ágar primário, o teste de indol pode ser usado como uma confirmação
adicional. E. coli também apresenta resultados positivos no teste do vermelho de metila e pode
descarboxilar o ácido l-glutâmico, mas não é capaz de produzir acetilmetil carbinol, utilizar citrato
como única fonte de carbono ou crescer em caldo KCN.
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Anexo B
(normativo)

Composição e preparação de meios de cultura e reagentes

B.1 Ágar Coliforme Cromogênico (CCA)

Digestão enzimática de caseína 1,0 g
Extrato de levedura 2,0 g
Cloreto de Sódio 5,0 g
Di-hidrogenofosfato de sódio × 2H2O 2,2 g
Hidrogenofosfato dissódico 2,7 g
Piruvato de sódio 1,0 g
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Sorbitol 1,0 g
Triptofano 1,0 g
Tensoativo de etiloxilato de álcool secundário (CAS No. 0,15 g
68131-40-8) a (por exemplo, tensoativo Tergitol® 15-S-7) b
6-Cloro-3-indoxil-β-D-galactopiranosídeo 0,2 g
(Salmão-beta-D-galactosídeo), (CAS No. 138182-21-5)
Ácido 5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-β-D-glucurônico, sal de 0,1 g
ciclohexilamônio monoidratado (sal CHX de X-beta-G-
glucuronídeo) (CAS No. 114162-64-0)
Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) 0,1 g
(CAS No. 367-93-1)
Ágar bacteriológico (em pó ou em flocos) 9 g a 18 g c
Água 1 000 mL
a O número CAS/número de registro CAS é um identificador numérico exclusivo do Chemical Abstracts
Service (CAS) para elementos químicos, compostos, polímeros, sequências biológicas, misturas e ligas.
b Tergitol® é um exemplo de um produto adequado disponível comercialmente. Essa informação é dada para
facilitar aos usuários desta Norma e não constitui um endosso por parte da ABNT ao produto citado.
c Dependendo da força de gel do ágar.

Suspender os ingredientes em água aquecendo em banho-maria fervente ou em vapor fluente com

agitação frequente até a completa dissolução (aproximadamente 35 min). Se necessário, ajustar o pH
para que após o tratamento térmico tenha um valor correspondente a 6,8 ± 0,2 a 25 °C. Não esterilizar
em autoclave, não aquecer demais. Verter em placas de Petri a uma profundidade de pelo menos
4 mm. Se não for para uso imediato, as placas podem ser armazenadas a (5 ± 3) °C no escuro e
protegidas contra evaporação, por pelo menos um mês. Convém que não haja nenhuma umidade
visível nas placas antes do uso. Quando houver umidade, convém que as placas sejam secas pelo tempo
mínimo necessário para remover a umidade visível.

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B.2 Reagente de oxidase

Dicloridrato de N,N,N´,N´-tetrametil-p- 0,1 g
fenilenodiamina (CAS No. 637-01-4)
Água 10 mL

Este reagente não é estável. Deve ser preparado na hora em pequenas porções cada vez que for
necessário e tem que ser protegido da luz.

ADVERTÊNCIA – O dicloridrato de N, N, N´,N´-tetrametil-p-fenilenodiamina é carcinogênico.

O trabalho de preparação tem que ser feito em exaustor. Usar luvas de proteção e evitar o contato
com a pele.

B.3 Ágar Triptona Soja (TSA)

Triptona 15,0 g
Peptona de soja 5,0 g
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Cloreto de Sódio 5,0 g

Ágar (em pó ou em flocos) 15 g a 25 g a
Água 1 000 mL
a Dependendo da força de gel do ágar.

Suspender os ingredientes em água, aquecendo-os em banho-maria fervente ou em vapor fluente.

Se necessário, ajustar o pH para que após a autoclavagem tenha um valor correspondente a 7,2 ± 0,1
a 25 °C. Esterilizar por 15 min a (121 ± 3) °C em uma autoclave. Deixar arrefecer até aprox. 50 °C e
verter em placas de Petri a uma profundidade de pelo menos 4 mm. Se não for para uso imediato,
as placas podem ser armazenadas a (5 ± 3) °C no escuro e protegidas contra evaporação, por pelo
menos oito semanas.

NOTA Qualquer outro ágar não seletivo pode ser usado para subcultura antes do teste de oxidase, desde
que não interfira com o teste de oxidase.

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Anexo C
(informativo)

Características de desempenho

Tabela C.1 – Características de desempenho do ágar coliforme cromogênico

E. coli Bactérias coliformes
Identificação (n = 220)
Sensibilidade 94 % 91 %
Especificidade 97 % 94 %
Taxa de falso-positivos 6% 5%
Taxa de falso-negativos 3% 11 %
Eficiência 96 % 92 %
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Seletividade − 0,78 − 0,32

Faixa de determinação quantitativa 10 a 100 10 a 100

(colônias por membrana 47 mm)
Recuperação > 80 % > 70 %
Incerteza de contagem (RSD)
Repetibilidade 0,046 0,035
Reprodutibilidade 0,127 0,114
Robustez do tempo de incubação Aumento explícito de colônias presuntivas entre 18 h e 24 h
no período de incubação a
a Convém que o tempo de incubação preferencial para amostras de água seja de 21 h. A incubação durante
24 h aumenta a recuperação das bactérias-alvo, especialmente se estiverem estressadas, por exemplo,
de águas tratadas.

Os dados para o cálculo das características de desempenho foram coletados em 2012 no IWW
Rheinisch-Westfälisches Institut für Wasser Beratungs- und Entwicklungsgesellschaft mbH, em Mülheim
a. d. Ruhr, Alemanha. A maioria dos testes foi realizada com água potável da rede de distribuição em
Mülheim a. d. Ruhr que foi enriquecido com águas superficiais do rio Ruhr. Dependendo dos tipos de
amostras de água e dos processos individuais dos laboratórios, pode ser necessário que os laboratórios
realizem sua própria validação secundária.

Todos os dados foram publicados no artigo “Validação de desempenho do ágar coliforme cromogênico
para a enumeração de Escherichia coli e bactérias coliformes” em “Letters in Applied Microbiology”
em dezembro de 2013. [6]

O artigo e as informações de apoio também estão disponíveis na versão on-line em http://onlinelibrary.

wiley.com/doi/10.1111/lam.12147/suppinfo

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 ABNT NBR ISO 9308-1:2021

Bibliografia

[1]  ABNT NBR ISO 7218:2019, Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal – Requisitos
gerais e orientações para análises microbiológicas

[2]  Byamukama D., Kansiime F., Mach R.L., Farnleitner A.H. Determination of Escherichia coli
Contamination with Chromocult Coliform Agar Showed a High Level of Discrimination Efficiency for
Differing Fecal Pollution Levels in Tropical Waters of Kampala, Uganda. Appl. Environ. Microbiol. 2000,
66 pp. 864-868

[3]  Geissler K., Manafi M., Amoros I., Alonso J.L. Quantitative determination of total coliforms and
Escherichia coli in marine waters with chromogenic and fluorogenic media. J. Appl. Microbiol. 2000,
88 pp. 280-285

[4]  Ossmer R., Schmidt W., Mende U. Chromocult Coliform Agar – Influence of Membrane Filter Quality
on Performance. Poster presentation, 1999. Congreso de la Sociedad Española de Microbiologia,
Granada, Spain (http://www.univie.ac.at/chromogenic/OSSMER.PDF)
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[5]  USEPA: 40 CFR Part 141 (sec. 141.21) Federal Register/Vol. 67, No. 209, Tuesday October 29,
2002/Rules and Regulations

[6]  Lange, B., Strathmann, M., Ossmer, R. Performance validation of chromogenic coliform agar for
the enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria. Lett. Appl. Microbiol. 2013, 57 pp. 547-553
(http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/lam.12147/suppinfo)

[7]  http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.pdf (viewed 03-01-2014)

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