23/4/2012

Técnicas de Eletroforese

Prof. Helton Resende

Eletroforese
Diversos métodos para análise de:

 Ácidos nucléicos (DNA e RNA)

 Proteínas

 Enzimas

ETAPAS

 Preparar a amostra (DNA total, Produtos de PCR,

Proteínas, etc...)

 Preparar o gel

 Aplicar as amostras no gel

 Eletroforese

 Coloração do gel, Fixação, Documentação

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CLASSIFICAÇÃO

• Tipos:
- agarose
- poliacrilamida desnaturante
não desnaturante
- amido (para isoenzimas)

• Princípios:
- carga elétrica e tamanho da molécula (partícula)

- pH (focalização isoelétrica)

• Detecção:
– brometo de etídeo, SYBR, nitrato de prata,
fluorescência
– substratos específicos (isoenzimas)

• Visualização:

– UV, direta, câmera

Eletroforese

Sharp, Sambrook and Sugden

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Eletroforese

Singer VL, Lawlor TE, Yue S. 1999. Comparison of SYBR Green I

nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity
in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay
Syber green (Ames test). Mutat. Res. 439(1):37-47.

http://www.probes.com/servlets/product?region=0&item=7563

Àcidos Nucléicos
• Ácido nucléico exposto a campo elétrico
migra para eletrodo na velocidade ou
mobilidade proporcional a força do campo e
a carga líquida da molécula
– mobilidade: inversamente proporcional ao
coeficiente friccional
– coeficiente friccional: função do tamanho e
forma da molécula e viscosidade do meio

Eletroforese
• Moléculas separadas por:
– tamanho
– forma ou conformação
– magnitude de cargas

• Sob pH fisiológico -> fosfatos ionizados

– poliânions correm em direção ao eletrodo
positivo
– Eletroforese pólo negativo -> pólo positivo

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Eletroforese

Eletroforese
• Tamanho da Molécula de DNA
– DNA linear migra inversa/ proporcional ao log10
do seu peso molecular

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Eletroforese
• AGAROSE:
• polissacarídeo linear de galactose com
unidades de -D-galactopiranose com ligações
1,3 e 3,6-anidro-a-L-galactopiranose

• PM médio: 120.000 Da

Agarose

Eletroforese em gel de agarose

- Tampão (TAE ou TBE) e agarose

- Concentração agarose varia entre 1 e 3%

- Fundir a agarose no tampão e aplicar na fôrma

- Esperar esfriar, retirar o pente

- Aplicar as amostras no gel

- Iniciar a eletroforese

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Eletroforese
• Tampões: água eletrolisada gerando H+
• no anodo e OH- no catodo

– terminal catódico (+) -> básica

– terminal anódico (-) -> ácida

• requer tampão para evitar gradientes de

pH

Eletroforese
Tampão Aplicação e comentários
TAE Usar quando o DNA vai ser recuperado
Usar para eletroforese de DNA de grande tamanho (> 12 Kb)
Baixa força iônica
Propriedades:
Baixa capacidade tamponante - recirculação pode ser necessária para
corridas eletroforéticas longas (> 6 horas).
TBE Usar para eletroforese de DNA pequeno (< 1 Kb)
Melhor resolução de DNA pequeno (< 1 Kb)
Mobilidade do DNA mais restrita
Alta força iônica
Propriedades:
Diminui a mobilidade do DNA.
Alta capacidade tamponante - não requer recirculação para corridas
longas.

Eletroforese
• TAE
– para recuperação de fragmentos
– preferido moléculas maiores
– menor campo de força
– maior porosidade

• TBE
– preferido para moléculas menores < 1Kb
– interage com agarose - poros menores

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Eletroforese
• Voltagem
– expressar sempre em V cm-1
– gradiente de voltagem - distância entre eletrodos

– voltagem excessiva - rastro de banda

– voltagem baixa - difusão de bandas pequenas <1 Kb

– TBE - bandas pequenas mais finas

– TAE - bandas maiores

Eletroforese

Tampão
Tamanho Voltagem
Recuperação Análise
< 1 kb 5 V/cm TAE TBE
1 to 12 kb 4-10 V/cm TAE TAE/TBE

> 12 kb 1-2 V/cm TAE TAE

Eletroforese
• Tempo de corrida

– correr gel até banda de interesse ter migrado de

40 a 60% do comprimento do gel

– parte inferior do gel - difusão e dispersão

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Eletroforese
• Tampão de Carregamento:
• Concentração 6 a 10x
– aumentar densidade da amostra - depositar
amostra no fundo do poço
– adicionar cor a amostra
– adicionar corantes de mobilidade ou migração
• azul de bromofenol
• xileno cianol
• verde de bromocresol

Eletroforese- Poliacrilamida

GEL DE POLIACRILAMIDA

- Géis de Poliacrilamida são obtidos a partir da

formação de ligações entre o polímero acrilamida e o
co-monômero bis-acrilamida.

- Essa reação covalente é geralmente catalizada por

persulfato de amônio e iniciada por TEMED, uma
amina terciária.

- Uma ampla faixa de tamanho de poros pode ser

obtida através de variações de:
 Concentração de acrilamida e bis-acrilamida
 Grau de polimerização

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GEL DE POLIACRILAMIDA

- A matriz de poliacrilamida por possuir poros

menores do que a matriz de agarose, géis de
acrilamida são usados para separar fragmentos de
DNA menores que 2 kpb, enquanto que moléculas de
até 200 kpb podem ser separaradas em géis de
agarose.

- De forma geral, um gel de 12 cm, a 1% de agarose

separa fragmentos na faixa de 30 a 0,2 Kbp,
enquanto que a 7,5% de poliacrilamida separa entre 1
a 0,05 Kpb.

Eletroforese
O corante Azul de Bromofenol (Bromphenol Blue) migra a
aproximadamente a 300 pares de base e Xileno Cianol (Xylene
Cyanol) a 4 Kpb, independente da concentração de agarose
entre 0,5 e 1,4% em 0,5 x de TBE.

Tamanho de Migração de Corante

Acrilamida* Fragmentos
(%) Separados Xileno Cianol Azul
(pares de de Bromofenol
base) pb pb
3,5 100 – 1000 460 100
5,0 80 – 500 260 65
8,0 60 – 400 160 45
12,0 40 – 200 70 20
15,0 25 – 150 60 15
20,0 6 – 100 45 12

ACRILAMIDA DESNTAURANTE

- Acréscimo de Uréia no gel para a manutenção do DNA na

forma de fita simples

- Amostras de DNA são desnaturadas a 94 -96o C, na

presença de Formamida, antes da eletroforese