BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA

3. Manipulação de ácidos nucleicos

Eletroforese

1
Eletroforese
- Separa macromoléculas - proteínas ou ácidos nucleicos - que
difiram em tamanho, carga ou conformação.

- Moléculas carregadas - colocadas num campo

elétrico, migram para o pólo (+) ou (-), consoante a
sua carga, a uma velocidade proporcional a:
• intensidade do campo
• carga da molécula

- Contrariamente às proteínas, que podem ter uma

carga positiva ou negativa, os ácidos nucleicos têm
sempre carga negativa, devido aos grupos fosfato 
migram em direção ao ânodo [pólo (+)].
2
Gel de eletroforese

• A eletroforese de proteínas e ácidos nucleicos - é realizada

dentro de uma matriz ou gel.

• Gel - é preparado com a forma do suporte onde vai ser corrido

e com poços onde são colocadas as amostras:

• Gel- é emergido no tampão de eletroforese- fornece iões para

conduzir a corrente e mantém o pH constante. 3
Gel de agarose

-Polissacárido de:
galactose + derivado de galactose

formam um gel por ligações de H. Fotografia, ao microscópio eletrónico: gel de

agarose 2%. Cada uma das fibras de gel tem
cerca de 100Aº de espessura (Courtesy of Sue
Whytock and John Finch.)

O poro do gel é ajustado variando a concentração de agarose:

entre 0.3 e 3%(p/V);

- Consegue-se separar ácidos nucleicos com tamanhos até 50kb

(eletroforese com campo pulsado separa até 10 Mb).
4
 Concentração do gel de agarose

• Variando as [ ]s, conseguem separar-se fragmentos de DNA de

gamas de tamanhos ≠s:

-altas [ ]s de agarose separam bem pequenos fragmentos de DNA

-baixas [ ]s de agarose  “ “ grandes fragmentos de DNA

Os mesmos fragmentos de DNA separados em 3

concentrações ≠s de agarose, no mesmo aparelho, à
mesma voltagem e durante tempos iguais:

Quanto >s são os fragmentos, mais bem separados são no

gel 0.7%, enquanto os pequenos fragmentos são mais bem
separados em agarose 1.5%.
O fragmento de 1000 bp está indicado em cada poço 5
Gel de poliacrilamida
• Resulta da ligação de polímeros de acrilamida ao co-monómero
de bis-acrilamida. A reação covalente de crosslinking é
catalisada pelo PSA (persulfato de amónio) e iniciada pelo
TEMED (amina terciária):

ATENÇÃO
A acrilamida é um neurotóxico potente e deve ser cuidadosamente manuseada!
Usar luvas descartáveis quando se manuseiam soluções de acrilamida e uma máscara
quando se pesa o pó. A poliacrilamida é considerada não tóxica, mas os geis de
poliacrilamida devem ser manuseados com luvas devido à possibilidade de existência
de acrilamida livre. 6
Gel de poliacrilamida
• Preparado entre duas placas de vidro, com um afastamento
de alguns mm, porque o oxigénio inibe a polimerização da
acrilamida:

• Forma poros de < dimensão que os da agarose

• Usa-se para separar ácidos nucleicos com tamanhos

inferiores a 500pb, que difiram apenas em um nucleótido.
7
Géis de agarose : horizontais
Geis de poliacrilamida : verticais

Tina de eletroforese - gel de agarose

Tina de eletroforese - gel de
poliacrilamida

8
Eletroforese de ácidos nucleicos

•Ac. nucleicos na forma linear, em c.d. têm

 a mesma razão carga/massa 
ajustando-se a viscosidade do meio ([ ]
da matriz)  efeitos de fricção e da
conformação da molécula 
separam-se por tamanho

• A pH8 – ác. nucleicos ionizados (poli-

aniões)  num campo elétrico migram para
o polo (+), movendo-se a uma velocidade
inversamente proporcional ao logaritmo do
seu peso molecular
9
Eletroforese - determinação do peso molecular

• Um gráfico: distância migrada dos fragmentos de DNA vs

log10 PM ou nº de pares de bases:
praticamente uma linha reta:

Curva Standard : Semi-log

Tamanho (bp) Distância (mm) 100,000

• 23,000 11.0
•
• 9,400 13.0
10,000

• 6,500

Size, base pairs

15.0
B
• 4,400 18.0

• 2,300 23.0 1,000

• 2,000 24.0

100
A
0 5 10 15 20 25 30
Distance, mm

• A partir da distancia migrada das bandas(mm): determinam-se os

tamanhos dos fragmentos(pb). 10
Eletroforese de moléculas circulares de DNA

• A mobilidade de moléculas de DNA circular é  das

moléculas lineares:

Super-enrolada> linear> cortada/ relaxada

Eletroforese em gel de agarose

11
Eletroforese de ác. nucleicos - capacidade de
separação
Capacidade de
Gel separação (nucleótidos)
0,3% agarose 50 000 -1000
0,7% agarose 20 000 - 300
1,4% agarose 6 000 - 200
4% acrilamida 1 000 -100
10% acrilamida 500 - 25
20% acrilamida 50 - 1

12
Tampões de eletroforese
• Estabilizam o pH e fornecem iões para permitir a condutividade

• Eletrólito usado - tampão de pH idêntico ao que foi incorporado

no gel (pH≈8)

• Tampões + usados em eletroforese de ácidos nucleicos:

TBE (Tris-Borato-EDTA; pH 8,3 ) (10X)

TAE (Tris-Acetato-EDTA; pH 8,0) (50X)

• Os fragmentos de DNA migram a velocidades diferentes em

cada um dos tampões, TAE ou TBE, devido às diferenças de
força iónica 13
Voltagem em eletroforese
•Ao ↑↑ muito a voltagem aplicada a um gel, os fragmentos
grandes migram em proporção mais rapidamente que os
fragmentos pequenos!

a melhor resolução para fragmentos com ~ 2 kb é  5 volts / d

(d - valor de distancia, em cm, entre os dois elétrodos, não o comprimento de

gel).

14
Visualização de fragmentos após eletroforese

As bandas de ácidos nucleicos são detetadas com agentes

intercalantes que fluorescem sob radiação U.V

[Exs: Brometo de etídeo Greensafe (não mutagénico)

15
Agentes intercalantes
• Corantes fluorescentes que intercalam entre as bases dos
ácidos nucleicos e permitem a deteção dos fragmentos nos
geis porque emitem fluorescência sob radiação UV (≈300nm)

• podem ser incorporados nos geis de agarose, ou adicionado às

amostras antes da sua deposição no gel
Gel de agarose

Gel de poliacrilamida
16
NOTA: os geis de poliacrilamida são corados posteriormente à migração.
Solução de deposição (loading buffer)

•Adiciona-se às amostras, antes de as depositar no gel (preparada a

uma concentração de 6X ou 10x), com as funções:

• Aumentar a viscosidade da amostra, facilitando a deposição no

poço (ficol, glicerol ou sacarose)

• Seguir a migração das amostras, observando a migração dos

corantes: azul de bromofenol (AB; migra com fragmentos de 30pb) e
do xileno de cianol
(XC; migra com fragmentos de 4kpb)

17
Eletroforese em campo pulsado (PFGE)

• (Pulsed-field gel electrophoresis = PFGE): a direção do fluxo

de corrente, na tina de eletroforese, é periodicamente alterada:

Alternância entre duas orientações de

fluxo de corrente: quanto maior é a
molécula de DNA, mais tempo demora
a re-orientar

18
 PFGE
• Permite a separação de moléculas de DNA numa gama que
varia de 50,000 a 5 milhões de bp
tamanho muito > do que se consegue separar em gel de agarose
em eletroforese convencional
• Os parâmetros/condições da eletroforese têm que ser otimizadas.
Ex:

Definição das condições: nº de fases; duração dos pulsos; duração de cada

fase; amperagem. Exemplo: Fase 1; pulso 2 segundos; duração da fase 36
minutos; 180 mA; Fase 2; pulso 2 segundos; duração da fase 36 minutos; 180 mA 19
 Aplicações do PFGE

Ex: Utilizada para separar cromossomas de Saccharomyces

cerevisiae, cujas dimensões variam entre 220 000 a 2,5 milhões
de pb (Fingerprint) 20
Como separar DNAs diferentes gamas de tamanho?

• Gama apertada de tamanhos de DNA: gel de

poliacrilamida

• Gama alargada de tamanhos de DNA: gel de

agarose

• DNA de alto PM (>30-50kb): eletroforese de

campo pulsado em gel de agarose.

21
Eletroforese capilar
Ver: https://slidetodoc.com/eletroforese-capilar-eletroforese-capilar-em-zona-
eletroforese-capilar/

Fig 1 Esquema das etapas de funcionamento da Eletroforese Capilar

22
num Sequenciador Automático
Amplificação de um fragmento de DNA
específico
• Muitos dos métodos de manipulação e análise de
sequências de DNA não se fazem em sequências
únicas, requerem muitas cópias de um fragmento
específico

Um gene é uma pequena fração do DNA celular total

Tem que ser amplificado antes de ser estudado

• Há duas formas básicas de amplificar um fragmento de

DNA específico:
1)replicando o DNA em células (in vivo): clonagem génica
2)replicando o DNA enzimaticamente in vitro: PCR
23
 PCR (Polymerase chain reaction)
= Reação em cadeia da polimerase

PCR : “Polymerase chain reaction”Saiki, R.M., Scharf, S.J., Faloona, F., Mullis, K.B, Horn, G. T., Erlich, H.A. and Arnheim, N. (1985)
Enzymatic amplification of beta-globin sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230: 1350-
1354.
24
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
A amplificação enzimática de DNA: permite obter (copiar), in vitro,
grandes quantidades de uma sequência específica de DNA:

https://www.youtube.com/w
atch?v=ClhUe53W7xw

25
 1- PCR- definição
2- Os ciclos do PCR
3- DNA molde
4- Primers
5- Enzima
6- Otimização do PCR
Reação em cadeia da polimerase
• Amplificação de uma sequência de DNA, pela utilização de
um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers), cada um
deles complementar a uma das extremidades da sequência a
amplificar
• É NECESSÁRIO: conhecer a sequência das extremidades 5’
e 3’ do fragmento de DNA, para amplificação da sequência
compreendida entre as 2 regiões.

Para isolamento de genes: podem usar-se variantes do PCR, que

têm como base características das regiões 5’UTR e 3’UTR do
mRNA 26
• Ao fazer-se PCR a partir de DNA molde, os fragmentos com
extremidades abruptas, aparecem no 3º ciclo de PCR

• A partir daí, os produtos amplificados acumulam-se

exponencialmente, tal como descrito :

Nf = No(1+Y)n

Nf = o nº de cópias da sequência amplificada após n ciclos de amplificação

No= o nº inicial de cópias da sequência alvo no DNA molde
Y= a eficiência de amplificação por ciclo

aplica-se na fase exponencial de amplificação, que ocorre até que

um dos componentes da reação se torne limitante

27
Cinética da reacção de PCR

Fase “plateau”
paragem
Fase linear
Variabilidade

Fase exponencial
Máxima eficiência
Eficiência ~1

Ciclos de PCR 28
 1- PCR- definição
2- Os ciclos do PCR
3- DNA molde
4- Primers
5- Enzima
6- Otimização do PCR

• Numa reação de PCR fazem-se ~ 30-40 ciclos de 3 passos

cada um, a diferentes temperaturas:
-Desnaturação: as cadeias do DNA molde são desnaturadas, por
aquecimento a 94-95ºC

-Hibridação (annealing) dos primers: a temperatura é  até 55-60ºC para

permitir a hibridação dos primers

- Extensão (elongação, ou polimerização): a temperatura é  até 72ºC para

que se dê a polimerização [necessita dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) e
Mg2+].
29
Os ciclos de PCR

30-40 ciclos de três passos:

Passo 1: Desnaturação

Template
Molde
Primers
Passo 2: Hibridação

Enzimas
Passo 3: Extensão

30
 1- PCR
2- Os ciclos do PCR
3- DNA molde
4- Primers
5- Enzima
6- Otimização do PCR

• Qualquer fonte de DNA que forneça uma ou mais moléculas

alvo pode ser utilizado como molde para PCR

• É necessaria alguma informação sobre a sequência, para se

poderem desenhar os primers

31
 1- PCR
2- Os ciclos do PCR
3- DNA molde
4- Primers
5- Enzima
6- Otimização do PCR

• Devem ser desenhados para:

-hibridarem em cadeias opostas do DNA molde
-conterem entre 18 e 30 nt
-terem % G+C equivalentes, de tal modo que hibridem à mesma
temperatura [Tm próximas]
Tm=2(A+T)+4(G+C): com primers entre 18-30 nt, a temperatura de hibridação
usada no PCR deve ser ~Tm5oC

NOTA: existem programas informáticos específicos para desenhar primers

(Ex: Primer-Blast (gratuito); Beacon; Primer designer)
32
 1- PCR
2- Os ciclos do PCR
3- DNA molde
4- Primers
5- Enzima
6- Otimização do PCR

Thermus aquaticus.

• A mais comum é a Taq polimerase - enzima termo-estável

(DNA polimerase isolada da bactéria termofílica Thermus
aquaticus);

• Esta enzima não tem atividade exonucleolítica proofreading

3’ → 5’

• A fidelidade é baixa! NÃO é boa para clonagem

33
 1- PCR
2- Os ciclos do PCR
3- DNA molde
4- Primers
5- Enzima
6- Otimização do PCR

Para otimizar uma reação de PCR pode alterar-se:

-a temperatura de hibridação

-a concentração de Mg2+ - o tampão de PCR tem MgCl2 , o

Mg2+ influencia a hibridação dos primers

ou fazer nested PCR.

34
Nested PCR

First round
primers Gene of interest

Second round
PCR

First round
PCR
Second round
primers

35
PCR - variações
Primers degenerados : um pool de primers derivados de uma
sequência proteica.

Ex: His-Phe-Pro-Phe-Met-Lys

Pode gerar o primer :

5’-CAY TTY CCN TTY ATG AAR

Y= Pirimidina
N= qualquer base
R= purina
Objetivo: isolar/clonar o gene que codifica para essa proteína.
Nota: também se usam primers degenerados para outros fins como por ex.
amplificar genes homólogos 36
Nucleases e enzimas de modificação
Ferramentas para analisar/modificar o DNA e o RNA
são enzimas:
cortar
aparar

copiar

coser marcar

37
Enzimas para analisar o DNA e o RNA

Podem ser divididas em 3 grupos:

- que hidrolisam ligações fosfodiéster (nucleases: exo e
endonucleases);
- que criam ligações fosfodiéster (polimerases, transferases,
ligases e quinases);
- fosfatases- também hidrolisam ligações fosfodiéster
(Ex: fosfatase alcalina bacteriana- remove grupos 5’ fosfato de DNA,
RNA, NTPs e dNTPs).

38
Nucleases: hidrolisam ligações fosfodiéster
: Hidrolisam o DNA no interior da cadeia: ativas em DNA circular
ou linear

Ex.:

- hidrolisam os ácidos nucleicos, nas extremidades da molécula;

ativas só em moléculas lineares.
- Ex: a partir da extremidade 3´do DNA

- classificadas com base na especificidade da extremidade em

que atuam: na extremidade 3’ ou 5’ livre.
39
Endonucleases = Enzimas de restrição

Reconhecem sequências específicas de DNA em cadeia dupla,

cortando as 2 cadeias e originando extremidades abruptas ou
coesivas:
Ex. de uma extremidade coesiva

Bgl II

40
Enzimas de restrição

41
Enzimas de restrição

- “Tesouras” de DNA

- nucleases que clivam o DNA em sequências específicas

- as sequências de reconhecimento são geralmente

palindrómicas- as enzimas ligam-se a estes sítios como
dímeros:

Corte

Extremidades coesivas

42
Enzimas de restrição

- O nº de nt da sequência de reconhecimento varia:

Ex.:
-EcoRI reconhece uma sequência de DNA de 6pb
-NotI “ “ “ 8pb

• o comprimento da sequência de reconhecimento:

inversamente relacionado com a frequência de corte da
enzima de restrição

• iso-esquisómeros = enzimas diferentes, com a mesma

sequência de reconhecimento
43
Enzimas de restrição e metilação
- Há enzimas de r. sensíveis à metilação do DNA não cortam
as moléculas de DNA se as sequências estiverem metiladas:

Ex:

DNA não
metilado

EcoRI não corta

DNA metilado

DNA
metilado

44
Enzimas de restrição - padrão de corte

• Hidrolisam a cadeia de DNA entre a desoxirribose e o grupo

fosfato

fosfato(-P) na ext. 5’ + hidroxilo(-OH) na ext. 3’

ex: OH p
p HO

Nota: Há poucas enzimas de restrição que hidrolisam DNA em

cadeia simples

45
Enzimas de restrição
Podem originar 3 tipos de extremidade:

• coesiva 5’
OH p
Ex: p HO

• coesiva 3’
p
Ex: OH
p HO

• abrupta
OH p
Ex: p HO 46
Enzimas de restrição- nomenclatura
-relacionada com o nome da bactéria a partir da qual
a enzima foi isolada:

• A 1ª letra: a 1ª do nome da espécie da bactéria, em itálico

• depois: primeiras duas letras da categoria, em itálico

• depois: 1ª letra da estirpe do organismo

• Por fim: em números romanos, a ordem da descoberta

47
Enzimas de restrição- nomenclatura

Ex:
EcoRI
a 1ª enzima deste
Escherichia coli R13 tipo encontrada
Espécie categoria estirpe

48
49
Extremidades compatíveis

Fragmentos de restrição com extremidades coesivas

complementares, mesmo provenientes de enzimas
diferentes, são ligáveis:

50
DNase (desoxirribonuclease) e RNase (ribonuclease)

• Nucleases que podem funcionar como inimigas dos biólogos

moleculares!

Mas, as DNase e as RNase têm alguns papéis fundamentais!

• Estas duas nucleases diferem:

-especificidade do substrato
-co-fatores
-local de clivagem: extremidade (exo) ou
internamente (endonuclease)
• A sua especificidade depende da concentração da enzima
usada na reação: altas concentrações promovem cortes não
específicos. 51
DNase I (pâncreas bovino)
- cortes aleatórios numa das cadeias de DNA- em presença
de Mg2+ , pH=7,5-8
- cortes nas duas cadeias- em presença de Mn2+
- produtos: extremidades 5’ fosfato e 3’OH.

Aplicações da DNase I:
- Eliminação DNA contaminante em preparações de RNA
- Analise interações DNA - proteína (footprinting com DNase I)
- Nicking de DNA, antes da marcação radioativa por nick
translaction
52
 RNase (pâncreas bovino)

- endorribonuclease;
- corta RNA em cadeia simples, a 3’ de uma pirimidina (U, C);
- degrada RNA em mononucleotídeos 3’-P

Aplicações da RNase A:
- Eliminação RNA contaminante de preparações de DNA
- Mapeamento mutações no DNA ou RNA por clivagem em
mismatch
(RNase A corta o RNA em híbridos RNA:DNA em sítios com mismatches de
bases únicas, e o produto de clivagem pode ser sequenciado, revelando a
sequência do mismatch).
53
Enzimas de modificação

- Polimerases do DNA ou do RNA- requerem uma cadeia

molde e podem ou não necessitar de uma extremidade
iniciadora;
- Ligases - requerem uma extremidade de DNA, 3’OH livre,
que ligam a um grupo 5’-P livre , de outro DNA;
- Transferases - requerem uma extremidade 3’OH livre, à
qual adicionam nucleotídeos por passos sucessivos;
- Quinases - requerem uma extremidade 5’OH livre, para a
qual transferem um grupo fosfato.

54
DNA polimerase
-in vivo: replica e ajuda à reparação do DNA

DNA
-in vitro: polimeriza a partir de uma
polimerase
extremidade 3’OH (primer) de um DNA,
fazendo uma cópia da cadeia molde, à qual
este está hibridado

55
DNA polimerase I de E.coli

- A haloenzima atua no DNA, e tem as atividades:

-polimerásica e
-exonucleásica 3’→5’
- “ 5’ →3’

- de um modo geral, in vitro, não se usa a haloenzima

- cada uma das 3 atividades está num domínio diferente
da enzima

56
DNA polimerase - fragmento de Klenow

Domínio polimerásico +
3’→5’ exonucleásico

- O fragmento de Klenow da DNA polimerase I (= grande

fragmento da DNA polimerase I)- tem as actividades:
polimerásica e exonucleásica 3’→5’.

57
Fragmento de Klenow: aplicações

Usado para:

• síntese de DNA em cd, a partir de moldes em cadeia simples:

• digestão de extremidades coesivas 3’ :

58
• preenchimento de extremidades de DNA, 3’ recessivas :

• preparação de sondas radioativas – se um dos nucleotídeos

incorporados incorporado estiver marcado com um composto
radioativo (no fosfato α)  o fragmento neo-intetizado fica
marcado:

  α
59
DNA polimerase do fago T4

- Atividade idêntica à do fragmento de Klenow,

embora a atividade exonucleásica 3’→ 5’ seja mais
forte.

60
RNA polimerase
- in vivo: transcreve genes originando cópias
de RNA
- in vitro: síntese de grandes quantidades de
RNAs, a partir de uma sequência desejada

- catalisa a polimerização de NTPs

- não necessita de iniciador
-necessita de uma cadeia molde: DNAcd, DNAcs ou RNA
-a polimerização é mais longa a partir de DNA cd que contenha
sítios específicos para a ligação da RNA polimerase (promotores)
61
Há ≠s RNA polimerases de fago, disponíveis no mercado:

-designadas pelo nome do fago que as codifica

-purificadas a partir da bactéria infetada pelo fago ou
recombinantes

Nome da polimerase Hospedeiro do fago Sequência do promotor

RNA polimerase T7 E. coli TAATACGACTCACTATAGGG

RNA polimerase T3 E. coli AATTAACCCTCACTAAAGGG

RNA polimerase SP6 Salmonella typhimurium AATTTAGGTGACACTATAGAA

62
Bibliografia recomendada:

[1] Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. “Molecular Cell Biology”. 9th Ed
(ou edições anteriores). New York: W. H. Freeman, 2021(Chap6)

[2] Alberts B., Bray D., Hopkin K. et al, “Fundamentos de Biologia

Celular”,4th Ed. Artmed, 2017(Cap 10)

[3] José Luque, Angel Herraez “Biologia Molecular e Ingenieria

Genética”- Conceptos, técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la
Salud. Elsevier, 2006 (tema 15,16)

[4] Benjamin A. Pierce. “Genetics - A Conceptual Approach”, 7th Edition,

2020. W. H. Freeman Publisher. (Chap 19)

Enzimas de restrição Tipo II :

https://www.youtube.com/watch?v=6U8bGOG9OAI

63