Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE)

23 de setembro de 2018 por Sagar Aryal

Índice
 Princípio da Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE)
 O Método de Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE)
 As principais etapas envolvidas na eletroforese em gel de campo pulsado são:
 Aplicações da Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE)
 Vantagens da eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE)
 Limitações da eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE)
 Referências
 Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) é uma técnica usada para
a separação de grandes moléculas de ácido desoxirribonucléico
(DNA) aplicando a uma matriz de gel um campo elétrico que muda
periodicamente de direção.
 Como o DNA com mais de 15-20 kb que migra através de um gel se move
essencialmente em conjunto de maneira independente do tamanho, a
técnica de eletroforese em gel padrão foi incapaz de separar moléculas
muito grandes de DNA de forma eficaz, o que levou à prática da
eletroforese em gel de campo pulsado.
  Em 1982, Schwartz introduziu o conceito de que as moléculas de DNA
com mais de 50 kb podem ser separadas pelo uso de dois campos
elétricos alternados.

Princípio da Eletroforese em Gel de Campo Pulsado

(PFGE)
Embora, em geral, pequenos fragmentos possam encontrar seu caminho
através da matriz de gel mais facilmente do que grandes fragmentos de DNA,
existe um limite de comprimento acima de 30-50 kb, onde todos os grandes
fragmentos correrão na mesma taxa e aparecerão em um gel como um único
grande difuso banda.
No entanto, com a mudança periódica da direção do campo, os vários
comprimentos de DNA reagem à mudança em taxas diferentes. Ou seja,
pedaços maiores de DNA serão mais lentos para realinhar sua carga quando a
direção do campo for alterada, enquanto pedaços menores serão mais
rápidos. Com o passar do tempo, com a mudança consistente de direções,
cada banda começará a se separar mais e mais, mesmo em comprimentos
muito grandes. Assim, a separação de pedaços de DNA muito grandes usando
PFGE é possível.

O Método de Eletroforese em Gel de Campo Pulsado

(PFGE)

 O procedimento para esta técnica é relativamente semelhante à realização

de uma eletroforese em gel padrão, exceto que, em vez de executar
constantemente a voltagem em uma direção, a voltagem é periodicamente
trocada entre três direções; uma que passa pelo eixo central do gel e duas
que fazem um ângulo de 60 graus de cada lado.
 Os tempos de pulso são iguais para cada direção, resultando em uma
migração direta do DNA.

As principais etapas envolvidas na eletroforese em gel de

campo pulsado são:
 Lise: Primeiro, a suspensão bacteriana é carregada em uma suspensão de
agarose. Isso é feito para proteger o DNA cromossômico de danos
mecânicos, imobilizando-o em blocos de agarose. Em seguida, as células
bacterianas são lisadas para liberar o DNA. A suspensão de agarose-DNA
também é conhecida como molde em tampão.
 Digestão de DNA: O DNA bacteriano é tratado com enzimas de restrição
de corte incomuns para que produza menos número de fragmentos de
DNA de tamanho maior (em contraste com as enzimas de restrição
freqüentemente usadas em RFLP, que produzem um grande número de
fragmentos menores).
 Eletroforese: Os pedaços maiores de DNA são submetidos à eletroforese
em gel de campo de pulso aplicando corrente elétrica e alterando sua
direção em intervalos regulares (em contraste com a eletroforese em gel de
 agarose convencional feita para separar os fragmentos menores onde a
corrente é aplicada em uma única direção) .
 Análise: Os fragmentos de diferentes organismos gerados pelo PFGE são
comparados aos padrões manualmente ou por um software de computador
como o BioNumerics.

Aplicações da Eletroforese em Gel de Campo Pulsado

(PFGE)
 Visto que a eletroforese em gel de campo permite a separação de
fragmentos de DNA contendo até 100.000 pb (pares de 100 quilobases ou
kbp), a caracterização de tais fragmentos grandes permitiu a construção de
um mapa físico para os cromossomos de várias espécies bacterianas.
 PFGE pode ser usado para genotipagem ou impressão digital genética.
 É comumente considerado um padrão ouro em estudos epidemiológicos de
organismos patogênicos.
 A subtipagem tornou mais fácil discriminar entre as cepas de Listeria
monocytogenes e, assim, vincular isolados ambientais ou alimentares a
infecções clínicas.

Vantagens da eletroforese em gel de campo pulsado

(PFGE)
 PFGE separa DNAs de alguns pares kb a mais de 10 Mb.
 A subtipagem PFGE foi aplicada com sucesso à subtipagem de muitas
bactérias patogênicas e tem alta concordância com relação epidemiológica.
 O PFGE tem se mostrado repetidamente mais discriminador do que
métodos como ribotipagem ou tipagem de sequência de múltiplos locus
para muitas bactérias.
 PFGE no mesmo formato básico pode ser aplicado como um método
genérico universal para subtipagem de bactérias. (Apenas a escolha da
enzima de restrição e as condições para eletroforese precisam ser
otimizadas para cada espécie.)
 Os padrões de restrição de DNA gerados por PFGE são estáveis e
reproduzíveis.

Limitações da eletroforese em gel de campo pulsado

(PFGE)
 Demorado.
 Requer técnicos treinados e qualificados.
 Não discrimina entre todos os isolados não relacionados.
 Os resultados do padrão variam ligeiramente entre os técnicos.
 Não é possível otimizar a separação em todas as partes do gel ao mesmo
tempo.
 Não sei realmente se bandas do mesmo tamanho são os mesmos pedaços
de DNA.
 As bandas não são independentes.
 Mudança em um local de restrição pode significar mais de uma mudança
de banda.
 “Parentesco” deve ser usado como um guia, não uma medida filogenética
verdadeira.
 Algumas cepas não podem ser digitadas por PFGE.

Referências
1. Bailey, WR, Scott, EG, Finegold, SM, & Baron, EJ (1986). Microbiologia
diagnóstica de Bailey e Scott. St. Louis: Mosby.
2. Sastry AS & Bhat SK (2016). Essentials of Medical Microbiology. Nova
Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers.
3. Parija SC (2012). Textbook of Microbiology & Immunology. (2 ed.). Índia:
Elsevier Índia.
4. https://www.slideshare.net/pankajgaonkar31/pulse-field-gel-electrophoresis
5. https://en.wikipedia.org/wiki/Pulsed-field_gel_electrophoresis
6. https://www.slideshare.net/jitenderanduat/pulsed-field-gel-electrophoresis-
pfge
7. https://bitesizebio.com/29971/pulsed-field-gel-electrophoresis/