Análise de Restrição

LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
ANÁLISES DE RESTRIÇÃO
ANÁLISE DE RESTRIÇÃO
A análise do perfil de restrição consiste em submeter amostras de DNA à

clivagem por enzimas de restrição e, a partir do tamanho dos fragmentos gerados, obter
informações sobre a sequência nucleotídica observada e/ou realizar a identificação de
diferentes amostras.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E A CLIVAGEM DE SEQUÊNCIAS

ESPECÍFICAS DO DNA
Uma das descobertas fundamentais para o desenvolvimento das técnicas de

biologia molecular ocorreu na década de 1970, com o isolamento das enzimas de
restrição (também chamadas de endonucleases de restrição). Essa classe especial de
enzima é produzida por determinadas bactérias como resposta de defesa à invasão por
vírus, denominados bacteriófagos. No processo de infecção, o bacteriófago transfere
seu material genético para a célula hospedeira e passa a produzir cópias de si mesmo
até que a célula bacteriana se rompa e libere novos vírus. Nesse processo, as enzimas
de restrição atuam como tesouras moleculares, produzindo cortes no genoma viral, de
modo a torná-lo inativo.
O grande diferencial das enzimas de restrição reside na capacidade de clivar

cadeias duplas de DNA exógeno em sequências específicas de nucleotídeos. Isso ocorre
porque cada enzima reconhece apenas um determinado sítio de restrição, ou seja, uma
sequência específica de quatro a oito pares de bases onde ocorrerá a clivagem da
molécula de DNA (Figura 1).
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CEP: 40260-215 Fone: 71 3272-3504
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Figura 1 – Representação ilustrativa de algumas enzimas de restrição com os respectivos sítios de clivagem (setas
verticais) e os organismos em que foram isoladas.
Fonte: Klug et al. (2010).
A maioria dos sítios de restrição são constituídos por sequências simétricas

denominadas palíndromo, ou seja, sequências nucleotídicas lidas igualmente em ambas
as fitas no sentido 5’ → 3’. Além disso, cada enzima tem um padrão de clivagem que
pode produzir extremidades lisas devido ao corte da dupla fita de DNA no mesmo par
de nucleotídeos, como é o caso da AluI e HaeIII; ou elaborar extremidades coesivas
devido a cortes desencontrados, como é o caso das enzimas EcoRI e HindIII (Figura 1).
Essa alta especificidade torna as enzimas de restrição ferramentas laboratoriais muito
úteis, pois permitem a identificação de semelhanças ou diferenças por meio da análise
do perfil de restrição apresentado por amostras distintas de DNA.
Atualmente, centenas de enzimas de restrição já foram isoladas de

microrganismos específicos, sendo frequentemente empregadas na prática laboratorial.
Ao incubar qualquer amostra de DNA em solução com uma enzima de restrição e todas
as condições necessárias para o seu funcionamento (tampão, temperatura e tempo
adequados), a digestão enzimática produzirá a clivagem de todos os sítios de restrição
específicos existentes na amostra em questão. Por exemplo, se uma amostra for

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submetida à clivagem pela enzima EcoRI, todas as sequências 5’ GAATTC 3’ serão

reconhecidas e clivadas por essa enzima. Por outro lado, se a enzima utilizada na reação
for a AluI, então todas as sequências 5’ AGCT 3’ serão reconhecidas e clivadas, conforme
observado na Figura 1. Nesse sentido, cada amostra de DNA submetida à clivagem por
uma determinada enzima de restrição produzirá um número fixo de fragmentos que
corresponderá ao número de sítios de restrição ali existentes, formando um perfil de
restrição (SNUSTAD; SIMMONS, 2018). Com o conhecimento da sequência de
nucleotídeos que compõe o sítio de restrição específico de cada enzima e a comparação
dos perfis de restrição de diferentes amostras, torna-se possível caracterizar
polimorfismos, detectar mutações pontuais e realizar a identificação de indivíduos, por
exemplo.
SEPARAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO POR

ELETROFORESE EM GEL
Após realizar a reação de digestão por enzima de restrição, os diferentes

fragmentos de DNA produzidos precisam ser separados para que o perfil de restrição
obtido possa ser identificado. Para isso, o método mais utilizado é a eletroforese em gel
(de agarose ou poliacrilamida). Nessa técnica, cada amostra da reação de restrição será
aplicada em um poço na extremidade do gel que, suspenso em solução tamponante,
será submetido a um campo elétrico. Para a correta identificação dos diferentes
tamanhos produzidos pela clivagem, um marcador molecular contendo fragmentos de
DNA de tamanhos conhecidos também é adicionado ao gel. Como o DNA é
negativamente carregado devido à presença de agrupamentos fosfato, ao aplicar o
campo elétrico, os fragmentos irão migrar em direção à extremidade positiva do campo.
Nesse processo, o gel funciona como uma barreira física por meio da qual os fragmentos
de DNA maiores migram mais lentamente que os menores. Ao fim do processo, os
fragmentos de restrição de cada amostra estarão separados, formando bandas de
diferentes tamanhos, que poderão ser visualizadas sob luz ultravioleta (Figura 2). Isso é
possível porque após a corrida da eletroforese, o gel utilizado é submerso em uma
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solução contendo um agente intercalante denominado brometo de etídio. Essa

substância tem capacidade de se intercalar entre os pares de base do DNA e emitir
fluorescência quando exposto à luz ultravioleta, evidenciando, assim, as bandas
formadas. Devido ao potencial mutagênico, ambos os reagentes — brometo de etídio e
luz ultravioleta — devem ser manipulados com especial atenção para o uso correto dos
equipamentos de proteção (EPIs).
Como resultado, são obtidos os perfis de restrição de cada amostra, de forma a

tornar possível identificar a presença e/ou ausência de sítios de restrição, bem como
comparar e identificar amostras específicas.

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Figura 2 – Separação dos fragmentos de restrição por eletroforese em gel de agarose.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
KLUG, W. S. et al. Conceitos de genética. 9. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.
SADAVA, D. et al. Vida: a ciência da biologia. 11. ed. Porto Alegre: Artmed, 2020. v. 1.
SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de genética. 7. ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2018.

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