Hibridização de ácidos nucléicos

•A técnica conhecida como hibridação de Southern, como qualquer outra técnica

de hibridação de ácidos nucleicos baseia-se na capacidade destas moléculas,
quando em cadeias simples, se associarem formando cadeias duplas, estáveis, como
resultado do estabelecimento de ligações de hidrogénio entre duas cadeias simples
que apresentam sequências de nucleótidos com bases complementares.
• Quando as duas cadeias simples, que se associam, são de procedência diferente,
forma-se uma cadeia híbrida e daí o nome hibridação.
•A hibridação DNA-DNA permite detectar, especificamente, a presença de
sequências de DNA que sejam complementares de uma sonda (probe), um
fragmento, também de DNA, selecionado de modo a permitir essa detecção
específica.
•Conforme as exigências do protocolo, a sonda pode ser curta ou longa (com
menos de 50 ou mais de 100 nucleotídeos).

Southern EM (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel
electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503-517.
ALVO: molécula a ser identificada ou estudada - seqüência
de RNA ou DNA.

SONDA: se liga à seqüência alvo específica - seqüência de

DNA (RNA, seqüências específicas de DNA, DNA genômico
total).

MARCADOR: molécula detectável que se liga à sonda

(material radioativo, produto enzimático ou composto
fluorescente)
- marcadores radioativos: H3, P32, P33, S35
- marcadores enzimáticos: fosfatase alcalina, peroxidase
-marcadores fluorescentes: FITC (Fluoresceína
Isotilcianato), AMCA (Amino Metil Cumarina Ácido
Acético), Texas Red
Digestão enzimática
 Tratamento do Gel

1- Depurinação-
tratamento com HCl;
2- Desnaturação-
tratamento com NaCl e
NaOH;
3- Neutralização-
tratamento com Tris e
NaCl;
 Southern Blot- transferência por capilaridade

Tipos de membrana: nitrocelulose e naylon

Transferência a vácuo
 Fixação do DNA à membrana

•Incubação a 80C
•Tratamento alcalino
•UV cross-linking
Marcação da sonda
 Hibridização
A membrana é colocada em contato com a solução de hibridização-
solução salina+ solução de bloqueio+ sonda desnaturada
Função- hibridização da sonda ao segmento de ácido nucléico
complementar presente na membrana
Desnaturação da sonda- quebra das pontes de H: alta temperatura
(95C); agentes denaturantes e condições alcalinas (alto pH)
 Lavagens
A membrana é colocada em contato com condições
contendo detergente e agentes desnaturantes.
Função: remoção da sonda marcada em excesso; ligada
não especificamente; ligada a regiões de pouca
complementariedade de bases.
Estringência = especificidade

Menor quantidade de sal

Aumento da temperatura
Uso de desnaturantes
Visualização
Hibridização de DNA imobilizado em
membrana

Filme de Raio X
 Variações da Hibridação
- Northern Blot – hibridação de RNA
- Colony Blot – colônias de bactérias
- Dot Blot – amostras de DNA/RNA
- Microarray – amostras de DNA/oligos
O Northern Blot é uma técnica usada na pesquisa em
biologia molecular para estudar a expressão gênica, ou seja,
verificar se um determinado gene de um genoma é ou não
transcrito em RNA e quantificar isso.
Essa técnica tem tal nome devido à similaridade de seu
procedimento com o Southern blot (batizada pelo biólogo britânico
Edwin Southern; com a diferença chave de que, em vez de DNA, a
substância analisada por eletroforese com uma sonda hibridizadora
é a molécula de RNA).
 Northern Blot

1 2 3 4

Padrão de expressão diferencial de genes

 Colony Blot

Na técnica de colony-blot faz-se o rastreamento de uma série de

colônias transformadas com bibliotecas de cDNA ou de DNA
genômico de um certo organismo.
Estas colônias depois de crescidas são transferidas para uma
membrana de nylon e após lise celular e fixação do DNA na
membrana, esta é hibridada com uma sonda (cDNA ou DNA
genômico) para o gene que se pretende estudar.
Por auto-radiografia visualiza-se qual a colônia que contém o DNA
que hibridizou com a sonda e isola-se o plasmideo correspondente.
Colony Blot
 Dot Blot
Uma variante da técnica do Southern Blot consiste no dot-blot. Trata-se também
de uma técnica em que o DNA é covalentemente ligado a uma membrana, sendo
posteriormente hibridizado com uma sonda. A diferença fundamental entre o dot-
blot e o Southern-Blot consiste na separação eletroforetica que ocorre no
Southern, mas que não existe no dot-blot.
 Dot blot

Permite a quantificação das amostras

Fluorescence in situ
Hybridization (FISH)
FISH- Sonda -Sequência telômero
 DNA microarray
Um DNA microarray, ou DNA-chip, consiste num arranjo pré-definido de
moléculas de DNA (fragmentos de DNA genômico, cDNAs ou oligonucleotídeos)
quimicamente ligadas à uma superfície sólida, usualmente lâminas de
microscópio revestidas com compostos que conferem carga positiva.

Os microarrays também podem ser preparados em membranas de nylon

positivamente carregadas.

Os microarrays são utilizados na detecção e quantificação de ácidos nucleicos

(RNAm na forma de cDNA ou DNA genômico) provenientes de amostras
biológicas, as quais são postas para hibridar com o DNA fixado no array
(hibridação por complementariedade de bases).
A detecção é possível pois as amostras são
"marcadas" com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou
cianina 5 (Cy5) quando utiliza-se microarrays em vidro
ou com o isótopo 33-P quando os arrays são
preparados em membranas de nylon.

Para ambos os casos se faz necessário a geração de

uma imagem de hibridação, que é obtida por meio de
leitores (scanners) a laser (para os fluorocromos) ou
leitores de fósforo (para o isótopo 33-P). O uso mais
freqüente dos microarrays é na determinação da
expressão gênica (perfil do transcriptoma).
A alta performance desta técnica é que
pode-se determinar a expressão
diferencial de milhares de genes num
único experimento.

Para a preparação dos microarrays,

utilizam-se robôs altamente precisos
que aplicam as diferentes amostras de
DNA em diminutos pontos (spots) no
centro de uma lâmina de microscópio
com a superfície quimicamente
preparada (densidade aproximada de
10.000 pontos/cm2).