Northern Blot

Conceito de Northern Blot: Northern blot diz respeito a uma técnica utilizada na
Biologia Molecular na qual é estudada a expressão genética através da detecção de…

Conceito de Northern Blot

Northern blot diz respeito a uma técnica utilizada na Biologia Molecular na qual é
estudada a expressão genética através da detecção de RNA mensageiro na amostra em
análise. Esta técnica torna possível averiguar se um gene está a ser transcrito em RNA
e quais os seus níveis de expressão durante as diferentes fases do ciclo celular tanto
em situações normais como em situações anormais de doença.

Procedimento:

1. Extração do RNA de uma amostra biológica (células ou tecido);

2. Desnaturação das moléculas de RNA para se tornarem moléculas de estrutura
primária, recorrendo-se à adição de formaldeído no gel da electroforese;
3. Separação das moléculas de RNA presentes na amostra de acordo com o seu
peso molecular, através de uma electroforese em gel (aparecerá um smear no
gel devido ao elevado número de moléculas de RNA presentes em cada
amostra);
4. Transferência para membrana de nitrocelulose ou de nylon, carregada
positivamente, através de ação capilar ou outros sistemas. Seguidamente, a
membrana é aquecida (no caso da utilização de uma membrana de
nitrocelulose) ou exposta a radiação UV (no caso da utilização de uma
membrana de nylon) para fixar permanentemente o RNA à membrana;
5. Tratamento da membrana com a sonda, que se define como uma molécula de
DNA ou RNA de cadeia simples cuja sequência é conhecida e complementar à
sequência (total ou parcial) de RNA mensageiro que se quer estudar, tornando
possível a hibridação por complementaridade entre a sonda e a sequência de
interesse. A sonda é marcada com átomos radioativos, corante fluorescente ou
uma enzima que gera sinal quando entra em contato com um substrato, de
forma a tornar possível a detecção dos locais de hibridação;
6. Lavagem da membrana com o objetivo de retirar toda a sonda que não
hibridou, permanecendo na membrana apenas a sonda que hibridou por
complementaridade de bases com a sequência de interesse;

SILVA. I. Northern blot. Disponível em:

<http://knoow.net/ciencterravida/biologia/northern-blot/>. Acesso em: 18 dez. 2017.
http://enfo.agt.bme.hu/drupal/en/gallery/8930

A northern blot is very similar to a Southern blot except that it is RNA rather than DNA
which is extracted, run on a gel and transferred to a filter membrane. It is mRNA which
is isolated and hybridized in northern blots.

Method:

- mRNA is extracted from the cells and purified.

- The mRNA is loaded onto a gel for electrophoresis.

- An electric current is passed through the gel and the RNA moves away from the
negative electrode. The distance moved depends on the size of the RNA fragment.
Since genes are different sizes the size of the mRNAs varies also. This results in a
smear on a gel. Standards are used to quantitate the size. The RNA can be visualized
by staining first with a fluorescent dye and then lighting with UV.

- RNA is single-stranded, so it can be transferred out of the gel and onto a membrane
without any further treatment. The transfer can be done electrically or by capillary
action with a high salt solution.

- A labelled probe specific for the RNA fragment in question is incubated with the blot.
The blot is washed to remove non-specifically bount probe and then a development
step allows visualization of the probe that is bound. See Northern-Up Close for a
detailed description of this process.

Northern Blot

Essa técnica surgiu alguns anos após o desenvolvimento da técnica de Southern Blot
e, de forma similar, tem a finalidade de detectar moléculas de RNA separadas por
eletroforese e imobilizados em um suporte.

Essa metodologia permite, a análise da expressão de genes em diferentes estágios de

desenvolvimento, ou de diferentes tipos celulares, uma vez que nesse tipo de técnica
são imobilizadas moléculas de RNA, incluindo o mRNA.
Assim, tal técnica apresenta grande importância nos estudos envolvendo a expressão
gênica. Enquanto no Southern Blot a hibrização ocorre com moléculas de fita dupla
(DNA), no Northern Blot ocorre com polímeros de fita simples (RNA).

Dessa forma, é frequente o pareamento intramolecular de bases, promovendo um

dobramento da molécula ou pareamento de bases presentes em moléculas distintas,
levando à formação de regiões de híbridos de RNA-RNA. Assim, a migração do RNA
em géis de agarose depende do seu tamanho e do seu estado conformacional.

A realização dessa técnica implica, obrigatoriamente, a utilização de géis de agarose

adicionados de agentes desnaturantes. Geralmente, emprega-se o formaldeído para
tal finalidade, uma vez que este reage covalentemente com os grupamentos amina de
adenina, guanina e citosina, evitando a formação de pareamento envolvendo essas
bases. Como esse fenômeno pode também ocorrer em relação à sonda no momento
da hibridação, tal atividade deve ser revertida antes da etapa de hibridação com a
sonda, pela desnaturação térmica seguida de resfriamento.

RNAses são enzimas, presentes nas células, nos tecidos, alguns fluídos biológicos, e
degradam as moléculas de RNA. A técnica em questão, deve ocorrer em condições
RNAse free, ou seja, livre de RNAses, até a transferência para as membranas, quando
então tal precaução não é mais necessária.

Para obtenção das condições RNAse free é necessário alguns cuidados como:

- uso de luvas novas, sem talco;

- reagentes e materiais plásticos, como ponteiras e tubos tipo Eppendorf, devem ser
novos;

- a vidraria e os instrumentos metálicos devem ser limpos, envolvidos em papel

alumínio e submetidos a 180 ºC por dezesseis a dezoito horas;

- os equipamentos, como cubas de eletroforese e pentes, devem ser tratados com

0,1% de dietil pirocarbonato (DEOC), um potente inibidor de RNAse;

- a água deve ser bidestilada ou Milli-Q.

Cuidados Importantes na Utilização da Técnica

- condições RNAse free durante a preparação e a execução das etapas da técnica;

- usar luvas ao manipular as membranas e o gel;

- manusear o formaldeído sempre em capela de exaustão, evitando aspirar seus
vapores, que são tóxicos;

https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/biologia/southern-blot-e-northern-
blot/23354

Este tipo de análise é importante para verificar a expressão de certo gene,

o tecido ou tipo celular onde ocorre e os fatores que a regulam.

https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/dna-rna-
purification-analysis/nucleic-acid-gel-electrophoresis/northern-
blotting.html