UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

LABORATÓRIO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS

EXTRAÇÃO DE DNA E RNA

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Coleta de material biológico:

Quando?
De quem?
Como?
Tratamentos?
Quanto mais fresco melhor!
Quantidade aceitável EPI!
Boa conservação Contenção!
Extração
de DNA
1. Extração de DNA

De onde podemos extrair DNA?

• Sangue
• Tecidos
• Células de cultura
• Extração plasmídeos de células bacterianas
• Purificação de DNA de gel
• ...
1. Extração de DNA

Material de pacientes e controles - Lapoge

Sangue total

Buffy coats

Amostras de tecido
1. Extração de DNA

Objetivos?
Objetivos

PCR – tamanho?

Integridade
Genotipagem? Pureza
Quantidade
Sequenciamento?

Quantificação de RNA - Expressão?

1. Extração de DNA

Fundamentos

1. Lisar eritrócitos (choque osmótico)

2. Lisar leucócitos (detergentes)

3. Inativar DNAse (quelante -EDTA)

4. Precipitar/degradar proteínas (sais/proteinase)

5. Precipitar DNA (etanol)

6. Reidratação do DNA em água ou tampão

1. Extração de DNA

Principais Métodos

1.Fenol-Cloróformio
2.Salting-out
3. Kits com colunas
1. Extração de DNA

Fenol-Cloróformio

1. Lise I: eritrócitos

2. Lise II: leucócitos

3. Fenol-clorofórmio

4. Precipitação etanol
1. Extração de DNA

• Contaminação da amostra
• Barato por fenol
• Simples • Reagentes tóxicos!
• Boa quantidade
• Boa qualidade
• Estabilidade do DNA
1. Extração de DNA
Salting-out

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid
=S0365-05962008000300002
1. Extração de DNA

Barato Estabilidade do DNA?

Simples Sais contaminantes
Boa quantidade
Boa qualidade
Não tóxico
1. Extração de DNA Kits
1. Extração de DNA

MUITO Simples Caro

Boa quantidade Estabilidade do DNA
Boa qualidade
Não tóxico
2. Extração de RNA

Extração de RNA: Análises de expressão

• Similar a extração de DNA

• Protocolo bem mais cuidadoso
• Molécula muito mais instável
• Amostra pode ser bem conservado em TRIzol,
RNAlater, etc.) - snapshot
• É preciso separá-la do DNA

• TRIzol
• RNAlater
• Kit com colunas
2. Extração de RNA

TRIzol

1. Lise I: eritrócitos

Pode ser usado para extração

2. TRIzol (fenol-guanidina)
de RNA, DNA e Proteínas!

3. Clorofórmio

4. Precipitação etanol
Kit com colunas
Transcrição reversa
(Nanodrop)

(Quebit)
Espectrofotômetro - Nanodrop

260/230 ~1,8
260/230 ~2,0

260nm – DNA/RNA
280nm – proteína, fenol,..
230nm – contaminantes (carboidratos, fenol,..)
Armazenar?

Estoque
DNA: -20◦C

Uso (diluído)

RNA: -80◦C
Enzimas
de
restrição
Enzima de restrição:

• Endonucleases produzidas por bactérias para se

defender de vírus.
• Quebram o DNA em fragmentos menores, não
infecciosos.
• Reconhecem sítios específicos (sítios de restrição)
no genoma e a corta.
• São conhecidos mais de 3000 enzimas
Enzima de restrição: tipos de clivagem

Fragmentação DNA!
Clonagem!
Genotipagem!
...
Enzima de restrição: Detecção de SNPs

RFPL: Polimorfismos de comprimento do

fragmento de restrição

Detecção dos polimorfismos de nucleotídeos únicos

(SNPs – single nucleotide polymorphisms).
Os primers utilizados na PCR flanqueiam a região
que contém, ou não, o sítio de clivagem
reconhecido pela enzima de restrição utilizada.
O produto da PCR é posteriormente submetido à
ação da enzima de restrição.
Enzima de restrição: como ocorre a clivagem
Enzima de restrição: resultado da restrição

3´ CGTAAATCTATACGAGAATTCACGTACGTA5´
2
5´ GCATTTAGATATGCTCTTAAGTGCATGCAT3´

3´ CGTAAATCTATACGAGTATTCACGTACGTA5´
1
5´ GCATTTAGATATGCTCATAAGTGCATGCAT3´

2/2 1/2 1/1

2/2 1/2 2/2 2/2 1/1 1/2 1/1