Universidade Federal de Santa Catarina

Centro de Ciências Biológicas

Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia

Diagnóstico molecular em
Parasitologia

Profa. Patricia Hermes Stoco

 Amostra

Processamento

Direto Indireto

Observação a Imunológico Molecular

fresco Métodos de Métodos de
Macroscópica Coloração concentração
Microscópica Busca de
Busca de moléculas
Anticorpos e
DNA, RNA e
Antígenos
proteínas
Diagnóstico molecular: Vantagens

Alta especificidade
Alta sensibilidade
Diagnóstico rápido, abreviando e otimizando o tratamento.

BAIXA CONCENTRAÇÃO DO AGENTE

Identifica, caracteriza e quantifica concentrações extremamente
pequenas de DNA/RNA de organismos patogênicos.

VERSATILIDADE DE AMOSTRAS:
•Sangue periférico
•Fluidos corporais
•Materiais obtidos através de punção (Medula óssea)
•Tecidos frescos
•Tecidos embebidos em parafina.
Diagnóstico molecular: Desvantagens

• Contaminação da amostra

• Presença de inibidores

• Viabilidade dos agentes: RNAse; DNAse; Protease

• Custo

• Padronização

• Algumas técnicas dependentes de equipamentos

Diagnóstico molecular: Ácidos Nucleicos
Extração de ácidos nucleicos

Coleta do material

Conservação
Homogeneização

Extração

Análise quantitativa e qualitativa

Extração de ácidos nucleicos

Os problemas geralmente não ocorrem

durante a extração

ANTES DEPOIS
Método de coleta Estocagem
Método de lise
Diluição
Conservação
Extração de ácidos nucleicos

Extração
1. Qual ácido nucleico? 3. Qual aplicação?
DNA Quantificação absoluta
RNA Quantificação relativa
Ensaios qualitativos
2. Qual material?
Outros
Cultura celular
Sangue 4. Quantas amostras?
Tecidos (animal; vegetal)
Microrganismos
Material forense
Outros
Extração de ácidos nucleicos

Extração
1. Qual ácido nucleico?
DNA
RNA

Orgânica Sílica Beads

magnéticas
Extração orgânica de ácidos nucleicos

DNA e RNA total

Fenol : Clorofórmio : Álcool Isoamílico (25:24:1)

Saturado com 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA
Extração orgânica de ácidos nucleicos
DNA genômico

Fenol : Clorofórmio : Álcool Isoamílico (25:24:1)

Precipitação

Etanol absoluto gelado / Isopropanol/ Acetado de Sódio

Etanol 70%

Tratamento com RNase A

Re-precipitação !!!
amostra
Extração orgânica de ácidos nucleicos

RNA total
Fenol ácido + guanidina

Clorofórmio

Isopropanol

Etanol 70%

Tratamento com DNase I

Re-precipitação !!!

amostra
Extração em coluna de silica de ácidos nucleicos
Extração com beads magnéticas de ácidos nucleicos
Quantificação de ácidos nucleicos

Análise quantitativa e qualitativa

Espectrofotômetro (Absorbância UV)

- Simples (amplamente utilizado)
- Quantificação e pureza

Fluorimetria
- Corante específico
- Maior precisão e sensibilidade

Eletroforese
- Semi-quantificação
- Integridade
Quantificação de ácidos nucleicos

Análise quantitativa e qualitativa

Espectrofotômetro (Absorbância UV)

- 260nm
- Simples (amplamente utilizado)
- Quantificação e pureza
Diagnóstico molecular

Técnicas
• PCR
• qPCR
• LAMP
• Southern blot
• Hibridização in situ
• RFLP
• RAPD
• Microarranjos
• Sequenciamento de DNA
• Proteômica