Projeto e verificação de um ensaio altamente confiável Linear após o

Exponencial - PCR (LATE-PCR) para a detecção do vírus da febre suína

Africana

Resumo

O vírus da peste suína africana (VPSA) é um vírus de DNA altamente

patogênico que é o agente causador da peste suína africana (ASF), uma
doença infecciosa de suínos domésticos e selvagens de todas as raças e
idades, causando uma série de síndromes. A doença aguda é caracterizada
por febre alta, hemorragias no sistema reticuloendotelial, e uma alta taxa
de mortalidade. Um poderoso ensaio diagnóstico romance baseado no-
Linear-After The-exponencial-PCR (LATE-PCR) princípio foi desenvolvido
para detectar VPSA. Um novo e poderoso ensaio diagnóstico baseado no
princípio do Linear- After The - exponencial - PCR (LATE -PCR) foi
desenvolvido para detectar VPSA. LATE -PCR é uma forma avançada de
PCR assimétrica, que resulta na amplificação direta de uma grande
quantidade de DNA de cadeia simples. Leituras fluorescentes são
adquiridas através da análise de ponto final após a amplificação PCR.
Amplificação do produto correto é verificada por análise de curva de
fusão. O ensaio foi concebido para amplificar o gene VP72 do genoma do
VPSA. Dezenove linhagens VPSA DNA de vírus de cultura de células e três
amostras de tecido (baço, amígdalas e fígado) de porcos infectados
experimentalmente foram testadas. O vírus foi detectado em todas as
amostras de cultura de células e de tecidos.

Nenhum dos cinco vírus relacionados com o VPSA testados produziu um

sinal positivo, o que demonstra a elevada especificidade do ensaio. A
sensibilidade do ensaio de LATE- PCR foi determinada em duas reações
Monoplex separadas em tempo real que utilizam amostras de VPSA
sintético e metas sintéticas de DNA de controle que foram diluídas em
série 109-1 cópias iniciais por reação. O limite de detecção era de 1 e 10
cópias / reação , respectivamente . A sensibilidade do ensaio também foi
testada em reações de um duplex de ponto final composta por um nível
constante de 150 cópias de DNA- controle sintético e uma amostra clínica
e tecido do baço diluído em série de 10-1 para 10-5. O limite de detecção
foi de 10-5 diluição que corresponde a aproximadamente 1 cópia /
reação . Desde que o ensaio foi concebido para ser utilizado em ambas as
configurações de laboratório ou numa máquina de PCR portátil (Bio –
Seeq Portátil Laboratório de Diagnóstico Veterinário ; Smiths Detection ,
Watford Reino Unido ), o LATE -PCR fornece uma ferramenta robusta e
inovadora para o diagnóstico da PSA , tanto no laboratório e no campo.

Material e Métodos

Ensaio LATE-PCR

O ensaio foi concebido para a amplificação do gene VP72 do VPSA com

base em um alinhamento de 32 sequências de Gen-Banco usando
software de alinhamento ClustalW
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html ) e tira proveito do fato
de que a amplificação de LATE- PCR produz grandes quantidades de DNA
fita simples que pode ser completamente sondado, uma vez que a
amplificação deixando cair a temperatura da reação abaixo da
temperatura de recozimento. As sondas utilizadas neste modo hibridam
com um alvo sequência em uma ampla gama de temperaturas e as
intensidades dos sinais resultantes refletem o número de moléculas alvo
presentes na amostra. O ensaio duplex descrito abaixo inclui um inócuo
Controle - DNA interno, que é um alvo sintético de 85 pb de função não
conhecida . Primer e design sonda tanto para VPSA e o DNA controle
seguiu os critérios de LATE -PCR descritos por Sanchez et al. (2004) , e
Pierce et al . (2005). Fluorescente lê são adquiridos utilizando a análise de
ponto final após a amplificação por PCR. A amplificação do produto
correto foi verificada pela análise da curva de fusão.

Desenho de primers, sondas e alvos

O VPSA Limitando iniciador (LP), excesso de iniciador ( XP ) e as

fluorescentes sonda foram projetados para amplificar e detectar uma
região 247 bp de patogênico E70 isolado ( GenBank AY578692 adesão ),
utilizando Critérios de projeto LATE -PCR. Resumidamente , o PL foi
concebido para ter um temperatura de fusão (Tm ) superior ao XP ,
resultando em eficiente amplificação exponencial de um fragmento
amplificado de cadeia dupla seguido por uma mudança abrupta de
amplificação linear de uma única cadeia , quando o LP se esgote. A sonda
tem uma temperatura de fusão de 55,5 ◦ C garantindo que não interfira
com a ligação do iniciador e extensão durante a 58,0 ◦ C passo de
recozimento do ciclo térmico , mas se liga no ponto final quando a
temperatura caiu abaixo da temperatura de recozimento ( Sanchez et al . ,
2004) . A seqüência da meta - DNA de controle foi uma versão modificada
do gene Xist expressa em embriões de camundongos fêmeas ( Hartshorn
et al. , 2007). Os primers foram modificados para coincidir com os critérios
de primers LATE -PCR com derretendo temperaturas próximas às
seqüências de primers VPSA . A sonda de DNA de controle é uma longa
seqüência de 21 pb , que também é projetado para atender critérios de
sonda LATE –PCR VPSA e -DNA controle sondas são guias moleculares de
baixa temperatura com um pequeno laço e uma haste de dois
nucleotídeos. Fluoróforos estão ligados à extremidade 5 ? fim e Black Hole
Quenchers para o 3 ? acabar . Todas as sequências são mostradas na
Tabela 1. A sonda VPSA foi projetada com uma única incompatibilidade
G / T para o destino original para reduzir os efeitos de um gancho de
cabelo da sonda estrutura . Interações não específicas foram evitadas
baseado em Visual

Software OMP (versão 6.6.0 ) (Software DNA , Inc., Ann Arbor, MI) .

Este programa também foi usado para calcular a temperatura de fusão de

todos iniciadores e sondas nas suas concentrações iniciais. O ensaio foi
inicialmente testado contra uma truncada , alvo sintético de cadeia
simples de DNA . A reação incluído o duplex sintético

DNA fita simples alvo - controle. Todos os objetivos e sintéticas iniciadores

foram encomendados a partir da Sigma- Aldrich ( St. Louis , MO , EUA ) ,
Tecnologia de DNA A / S ( Aarhus , Dinamarca ) ou de CyberGene
(Estocolmo, Suécia). As sequências para os oligonucleótidos sintetizados
alvos listados na Tabela 1.  Seqüências e temperaturas de fusão de VPSA
e Primers DNA-controle, sensores e Alvos de teste sintético.

Composição do ensaio
Cada reação duplex foi executada em um volume final de 25 uL e continha
os seguintes reagentes: 1 × Platinum ® Tfi Tampão de Reação (Invitrogen),
3 mM MgCl2, 250 uM dNTPs, 50nM VPSA Limitando Primer, 1 uM VPSA
excesso de Primer, 50nM Control-DNA Limitando Primer, 1 uM-DNA
Controle excesso de Primer, 100nM VPSA Probe com a 5’ Quasar 670
(QSR670) flúor e um 3’ Black Hole Refrescante 2, Sonda 100 nM Controlo-
DNA com um 5’ Cal Laranja 560 (CO560) fluor e um 3’ Black Hole
Refrescante 1 (Biosearch Technologies, Novato, CA, EUA), 300nM
PrimeSafeTMII (Rice et al., 2007) e 2,5 unidades de (-) platina ® Tfi Exo-
anticorpo complexado DNA polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, Gato.
No: 60684-050).

A reacção Monoplex composta pelos mesmos componentes descritos

acima, exceto que a água foi adicionada à reação mistura em vez do
primers de DNA-controle, sonda (CO560) e alvo correspondente.

Amostras

Estirpes Dezenove de vírus VPSA de DNA de células cultivadas e três

amostras de tecidos do baço , amígdalas , fígado e de um porco infectado
deliberadamente foram gentilmente cedidas pelo Dr. Carmina Gallardo e
Dr. Jovita Fernandez Pinero da Comunidade Europeia Laboratório de
Referência (LCR) para ASF, CISA - INIA (Centro de Investigação en Sanidad
Animal, del Instituto Nacional de Investigacióny Tecnología Agraria y
Alimentaria ) , Valdeolmos , Madrid, Espanha ( Tabelas 2 e 3 ) . Catorze das
19 amostras foram utilizadas em o desenvolvimento e avaliação do ensaio
de VPSA LATE - PCR , enquanto seis amostras foram utilizadas numa
experiência comparando o Ensaio LATE -PCR para a CRL recomendado PCR
rotineiramente empregados no Instituto Nacional de Veterinária ( SVA )
(King et al. , 2003) . VPSA estirpe E70 ( Espanha ) foi usado em ambos os
avaliação e experiências de comparação . O DNA a partir de estirpes
(linhagem, raça) de vírus Extraiu-se diretamente a partir de culturas de
células primárias (leucócitos e / ou macrófagos alveolares), utilizando um
estojo de extração de ácido nucleico ( NucleoSpin / Machery -Nagel -
Cultek ), após a fabricante de procedimentos . O DNA foi , em seguida,
concentrou-se por precipitação com etanol : 1/10 do volume de NaOAc
3M e 3 volumes de etanol foram adicionados à solução de DNA , em
seguida deixada durante a noite a -70 ◦ C. A solução foi centrifugada numa
microcentrífuga durante 10 min para sedimentar o DNA , em seguida,
lavou-se com etanol a 70 % e centrifugou-se durante mais 10 min . O DNA
foi seco ao ar e ressuspenso num volume final de 100 ? De l água destilada
livre de RNAse . Cada amostra foi diluída a 1:10 em água antes do teste.
Os ensaios em amostras de DNA viral foi realizado em SVA e da
Universidade Sueca de Ciências Agrícolas ( SLU ), em Uppsala , na Suécia.
O DNA foi isolado a partir das amostras de tecidos (Tabela 3 ) por um
Magnatrix 8000 robô extracção e MagAttract Vírus protocolo Mini Kit
( Qiagen ) , de acordo com as instruções do fabricante . o ácido nucleico a
partir de cada amostra foi eluida em 100 ul de tampão de eluição e foi
armazenado a -20 ◦ C. As amostras, juntamente com dois VPSA amostras
de controlo positivas e uma amostra de controle negativo VPSA DNA de
porcino, foram testados no formato Monoplex, no Rotor Gene 3000
(Qiagen / Corbett Research, Austrália). O perfil térmico é dado abaixo.

Condições usando Stratagene Mx3005P Sequence detector

LATE-PCR de alvos sintéticos foi inicialmente levada a cabo num

Stratagene Mx3005P Sequence Detector (Stratagene, La Jolla, CA) com o
seguinte perfil térmico: 1 ciclo a 95 ◦ C durante 3 min, 50 ciclos de 95 ◦ C
por 10 s, 58 ◦ C por 15 s, e 72 ◦ C por 30 s, e um ciclo de a 70 ◦ C por 3min,
50 ◦ C por 3min e 35 ◦ C por 3min com fluorescência aquisição durante o
último ciclo a 70 ◦ C, 50 ◦ C e 35 ◦ C nos canais QSR670 e CO560. Os
experimentos foram executados usando ponto final, em vez de análise em
tempo real para reduzir a amplificação de produtos não específicos. A
análise dos dados foi realizada utilizando o Microsoft Software Excel.

Condições usando Corbett Rotor-Gene 3000

Amplificação de LATE-PCR de alvos sintéticos e o DNA viral (célula cultura

e amostras clínicas) foi realizada num Rotor Gene 3000 (Qiagen / Corbett
Research, Austrália) com o seguinte programa perfil térmico: 1 ciclo a 95 ◦
C por 3min, 50 ciclos de 95 ◦ C por 10 s, 58 ◦ C por 15 s, e 72 ◦ C por 30 s, e
um ciclo de 70 ◦ C por 3min, 50 ◦ C por 3min, 40 ◦ C por 3min, com
fluorescência aquisição durante o último ciclo a 70 ◦ C, 50 ◦ C e 40 ◦ C no
canal Cy5 (fonte de 625 nm, detector 660 filtro de alta freqüência nm, o
ganho de 5) e canal JOE (fonte 530 nm, detector 555 nm, ganho 10). A
temperatura mais baixa de detecção é de 40 ◦ C devido à limitações de
temperatura do termociclador Rotor Gene. ou Cy5 (dados de aquisição de
alvo VPSA e DNA viral) ou JOE (dados aquisição de DNA-controle) canais
com o mesmo termodinâmico perfil como acima foram utilizadas com
amostras testados em Monoplex formato.

Determinação de sensibilidade e eficiência de LATE-PCR

Para determinar a sensibilidade do ensaio, uma série de diluições de

conhecida concentração do VPSA alvo Monoplex sintético foram testados.
As diluições variando de 109 cópias de alvo / reação de cerca 1 cópia /
reação. Amostras alvo foram preparadas em tampão TE (10 mM Tris-HCl,
pH 8,0, EDTA 1 mM) contendo 10 ug / ml de esperma de salmão DNA
(Ambion, Austin, TX, EUA), para assegurar uma quantidade constante de
Os ácidos nucleicos em amostras diluídas. O número de cópias na solução
de estoque foi determinado utilizando a molaridade do molde e a fórmula
de Avogadro. Uma curva padrão foi gerada, e eficiência de LATE-PCR, foi
calculada usando integrado de rotor Gene 3000 software do instrumento.
As diluições foram testadas em tempo real formato com o seguinte perfil
térmico: 1 ciclo a 95 ◦ C durante 3min; 50 ciclos de 95 ◦ C por 10 s, 58 ◦ C
por 15 s, 72 ◦ C por 30 s, e 45 ◦ C por 20 s de leitura a 45 ◦ C. As diluições
foram também testados em ponto final.

Comparação com método estabelecido

A fim de confirmar a eficácia do ensaio de LATE-PCR, seis das amostras

(marcado com asterisco na Tabela 2) e diluições daquelas amostras foram
testadas cegamente em formato Monoplex e comparado com o ensaio
TaqMan ® VPSA PCR utilizado para o diagnóstico de rotina no SVA. Este
último é baseado no método recomendado CRL, King et al. (2003) com
pequenas modificações.

Faixa de testes de detecção e especificidade

Para determinar a gama de detecção do ensaio, diluições 1:10 das 14

amostras de DNA foram testadas VPSA. Para determinar a especificidade
do ensaio, foi também testada contra o vírus com cinco semelhante
sintomas de VPSA (Tabela 5), bem como sangue de porcino VPSA negativo
e baço homogeneizado.

Otimização do Ensaio

O ensaio de LATE- PCR foi otimizado inicialmente construídas em duas

reações Monoplex separados usando VPSA e sintético controle -Alvos de
DNA (Figura 1A e C, respectivamente). Otimização incluído ajuste de
temperatura de recozimento, a escolha de fluoróforos para o VPSA e -
DNA de controlo sondas, tempo e temperatura para dados coleta no
ponto final e PrimeSafeTMII titulação. A otimização e testes de alvos
sintéticos foi realizado em ambos um rotor -Gene 3000 termociclador e
uma seqüência Stratagene Mx3005P Detector . A fim de determinar a
eficiência e sensibilidade de cada Monoplex , diluições em série 109-1
cópias / reação inicial foram realizadas em triplicata e detectado em
tempo real usando uma sonda que hibridado com o produto acumulado
durante um passo 45 ◦ C inserido depois do passo de extensão de cada
ciclo térmico . Os resultados mostram que os produtos foram detectados
em ambos os conjuntos de reações em cada diluição e replicar as reações
foram altamente reprodutível (Fig. 1a e c ) . A curva de fusão sonda - alvo
foi construída no ponto final para os amplicons única vertente gerado , e o
primeiro derivado foi feita para determinar a Tm de todos VPSA e todas as
reações de DNA de controle ( Fig. 1b e d , respectivamente ) . Fig . 1b
mostra que todos Monoplex VPSA reações gerar produtos muito
semelhantes com uma fusão dominante pico em 52,5 ◦ C. Fig . 1d mostra o
pico de fusão do derivado o DNA de controle, que os picos em
aproximadamente 55,5 ◦ C. reação eficiências de alvos VPSA e - DNA de
controlo com base na sintéticos de uma curva padrão e calculado Rotor
Gene 3000 instrumento software foram de 93 % e 96 % , respectivamente
(não apresentado ). Após a otimização do VPSA e reações de controle de
DNA Monoplex , a reação completa de duplex foi testada no final do
estudo (Fig. 2 ) . Esta reação foi composto por dois primers VPSA , dois
controle - Primers de DNA , uma sonda VPSA , sonda de DNA controle um
e 300nM PrimeSafeTMII , para evitar interacções não específicas durante
a amplificação. A diluição em série do alvo sintético VPSA foi testado em
ponto final após 50 ciclos de amplificação, a leitura no QSR670 canal (Fig.
2a ) . Cada reação continha 150 cópias do alvo Controle - DNA. Dados do
sinal de fluorescência foram normalizados dividindo todos os valores de
fluorescência a cada temperatura pela fluorescência a 70 ◦ C , uma
temperatura à qual as sondas não estão ligados aos alvos . O nível de
fundo de fluorescência antes do ciclo de qual o produto que aparece
primeiro foi então subtraído do normalizada dados . A quantidade de
VPSA numa amostra foi julgada pela sinal normalizado / fundo corrigida a
35 ◦ C. Na ausência de um modelo , acrescentou o sinal normalizado /
correção de fundo é 0 . Com base nessas observações empíricas um sinal
de maior do que 0,2 unidades foi considerado positivo . Este limiar foi
consistente com a observação empírica de que amostras possuindo um
número conhecido de cópias VPSA , entre um alvo / reação a 107 alvos /
reação, apresentada normalizado - fundo subtrair fluorescente / sinais na
faixa de 0,6-4,2 unidades fluorescentes . Como esperado , as amostras que
contêm apenas o ADN de controlo fizeram não gerar um sinal no canal
QSR670 , mas o fez no Canal CO560 (Fig. 2b). Os dados de ponto de
extremidade resultantes são relatados como um valor normalizado , a 35 ◦
C. O valor limite para o controle O DNA foi escolhido como 0,2 para um
sinal positivo . Todo o - ADN de controlo As amostras foram detectadas no
canal CO560 com sinais que variam, 7-0,88 unidades fluorescentes
normalizadas .

Sensibilidade e especificidade usando amostras de DNA virais

Para determinar a sensibilidade e especificidade do Monoplex e ensaios

duplex, ambos foram testados em amostras clínicas. Três amostras, Ben97
/ 1 a partir de tecido do baço, Ken06 de tecido tonsilar, e E75 a partir de
tecido do fígado, foram testados em format.TwoknownASFV Monoplex
normas e DNA de porco sem VPSA serviu com controles positivo e
negativo respectivamente. Todos os dados resultantes foram normalizada
e fundo subtraído. Um limite máximo de 0,2 normalizada unidades
fluorescentes acima do controle negativo ( normalizados para 0 ), foi
escolhido para estabelecer um sinal positivo . Todas as três amostras
clínicas deu sinais claros e positivos. Uma amostra , Ben97 / 1 foi testada
ainda mais em uma diluição em série no ensaio duplex usando ponto final
fluorescente sinais (Fig. 3b ) . Um limite de detecção foi de diluição 10-5
vezes , o que corresponde a aproximadamente 1 cópia / ? l . A última
conclusão baseia-se em duas experiências de diluições em série de 10
vezes de Ben97 / 1 em formato de PCR em tempo real , em conjunto com
os padrões positivos que permitiu a quantificação do número de cópias no
desconhecido testado amostra clínica ( dados não mostrados ) .

A fim de determinar o seu âmbito do ensaio duplex foi testada contra um

total de 14 estirpes virais diferentes (Tabela 2 ) de SVA / SLU . os dados
foram coletados no ponto final e foram normalizados a 70 ◦ C e fundo
subtraído (Fig. 4 ) . Os dados mostram um forte ponto de extremidade
sinal positivo acima do limiar ( 0,2 fluorescente normalizado unidades )
para todas as 14 das cepas de vírus. O normalizada , fundo Os valores
fluorescentes subtraídas variou 3,8-15,1 , com a controle positivo perto de
15 unidades .

Todas as estirpes virais foram então utilizados para comparar o ensaio de

LATE- PCR e o ensaio de diagnóstico SVA rotina . A Tabela 4 mostra que
82,6 % (19 /23) dos resultados obtidos usando o LATE -PCR
correlacionados com os do método DVA . Entre as quatro amostras
restantes Tog09 tensão diluída 10.000 vezes foi detectada usando o SVA
do método, mas não detectar , utilizando o ensaio de LATE- PCR . Em
contraste, em os outros três casos, o método de SVA foi negativa em uma
duas repetições , enquanto o ensaio de LATE- PCR foi positivo em ambos
replica .

A especificidade do ensaio de VPSA LATE - PCR foi determinada pelo teste

contra cinco vírus relacionados com VPSA que causam sintomas
semelhantes a ASF e requerem o uso de testes de laboratório para
diferenciar los ( Tabela 5 ) . Nenhum destes vírus gerado um sinal
positivo,nem soros suínos negativo ou baço homogeneizado , indicando
que o teste é altamente específico para o VPSA .

Discussão

Este artigo descreve o projeto e verificação de um novo ensaio para a

detecção do vírus da peste suína Africano (VPSA) com base em Linear-
After-A-exponencial PCR (LATE-PCR). Devido à propriedades da LATE-PCR,
cada reação produz grande quantidade de , de cadeia simples de DNA
específico, que pode ser então sondada com um sonda de sequencia
específica. Quando testados contra alvos sintéticos, o ensaio mostrou ser
eficaz, mesmo em números alvo baixos. Com efeito, este ensaio gerados
sinais positivos fortes até cerca de 1 / molécula de reacção. O novo ensaio
duplex também é sensível em baixos números de cópias de DNA de
controlo adicionaram--se à reação e os sinais de controle de DNA
resultantes são apenas observados em o canal CO560. Isto indica que não
há interações inespecíficas ou sinal de falsos positivos são gerados
durante o fim-PCR amplificação.

O ensaio corrente utilizado para a detecção de VPSA é simétrica PCR

TaqMan ® desenvolvido por King et al. (2003) com uma sensibilidade
analítica entre 100 e 10 cópias por reacção . No entanto , a intensidade do
sinal de PCR simétrica diminui drasticamente com a diminuição do
número de alvos . Esta diminuição da robustez é mais provável devido aos
baixos níveis de mis- priming que são típicos PCR de simétricas e também
são responsáveis pela dispersão entre replicar ensaios que entram na fase
de platô da reação. LATE- PCR , em contraste , produz um grande excesso
de fita simples amplicon sobre amplicon de cadeia dupla e de fita simples
moléculas não interferir com a actividade de polimerase . Além disso ,
PrimeSafeTMII atua para reduzir erros de priming ao longo da reacção ,
não apenas antes do primeiro ciclo térmico . LATE- PCR também permite a
utilização de sondas que têm temperaturas de fusão abaixo do
recozimento temperatura de amplificação . Como consequência , a
amplificação durante os rendimentos de reação sob condições ideais , sem
interferência de sondas e com o mínimo de mis- priming . produto
detecção de ponto final pode ser qualitativa ou quantitativa e separação
de amplificação e detecção reduz o tempo total de execução do ensaio .

A análise da curva de fusão do ensaio em ambos sintético e alvos virais

revelou uma Tm da sonda que é uns graus abaixo a temperatura teórica
calculada pelo software OMP visual . Esta diferença é provavelmente
devido à reação Platinum ® Tfi tampão , o que reduz a temperatura de
fusão prevista por 1-3 ◦ C.
Ensaios de viralDNAfrom três amostras de tecido de porcos infectados
deliberadamente , bem como 19 cepas de VPSA extraído de infectados
culturas de células , foi realizada no SVA / SLU , em Uppsala , na Suécia.
Tudo três amostras de tecido produzido um sinal positivo muito forte em
tanto o Monoplex LATE- PCR e ensaios duplex . testes adicionais com vírus
heterólogos mostrou que o ensaio de LATE- PCR é específico para VPSA .
Em comparação com o método atualmente usado no LCR SVA , o ensaio
de LATE- PCR realizada , bem como, exibindo comparável capacidade de
detecção .

De acordo com King et al. (2003 ) A detecção de VPSA por meio do Ensaio
TaqMan ® requer 24 horas a partir do momento em que a amostra é
recebido . Todos os processos requerem o uso de caras , de laboratório
não portátil Equipamento . A devastação causada por um surto de PSA
facilita a detecção precoce de uma necessidade para a prevenção de mais
perda . A combinação de um ensaio sensível e confiável de LATE- PCR com
um sistema de diagnóstico concebido para ser utilizado no campo por
veterinários Seria ideal . Smiths Detection Diagnostics está actualmente a
desenvolver o Bio- Seeq portátil Diagnóstico Laboratório Veterinário , um
campo instrumento que visa trazer o ensaio LATE -PCR para VPSA para o
local do surto , assim reduzir significativamente o tempo necessário para
identificar patógeno ( Belák et al . , 2009) . O Bio- Seeq inclui cinco
termocicladores independentes , cada qual acomoda um Universal
Dispositivo Preparação de Amostras ( USPD ) que processa uma biópsia
provar todo o caminho através de homogeneização de tecidos , o ácido
nucleico comunicação de extracção e purificação , amplificação por PCR , e
os dados com um centro de comando global. Os reagentes requeridos são
armazenadas liofilizadas na embalagem do reagente de USPD que é
rotulado com um código de barras que instrui o termociclador o protocolo
de aquecimento e arrefecimento de usar. O Bio-Seeq é projetado para
realizar análise de endpoint, que permite que o instrumento para fazer o
melhor uso das características únicas de LATE-PCR, como temperatura
estendida espaços e detecção multiplexado que não estão disponíveis em
outras químicas de PCR.

Conclusões
Os resultados mostram que o ensaio de LATE-PCR, descrito acima, é um
teste eficiente, específico e sensível. O uso deste novo ensaio permite a
análise de ponto de extremidade, que fornece um teste rápido com a
sensibilidade abaixo de 10 cópias do genoma viral. O ensaio LATE-PCR tem
foi otimizado para gerar resultados confiáveis e reprodutíveis em tanto
instrumentos de diagnóstico laboratorial padrão ou configurações ou em
um instrumento portátil agora em desenvolvimento. Uma vez que, no
local ou diagnóstico da linha de frente da ASF é muito importante, LATE-
PCR fornece uma poderosa nova ferramenta para os programas de
erradicação da ASF.