RELATÓRIO DAS AULAS PRÁTICAS

BIOTECNOLOGIA MOLECULAR

Aluno: Emmanuelle G. David

Cartão: 00335135
Professor: Fabiana Quoos Mayer

INTRODUÇÃO:

As aulas práticas realizadas nessa disciplina foram baseadas no método de PCR,

que consiste na replicação de um ou mais genes de interesse, para então determinar a
presença significativa ou não do gene na amostra em questão. Esse é um método
extremamente importante pois permite que identifiquemos o causador de diversas doenças,
podendo fazer um acompanhamento mais preciso com os pacientes sobre seu estado.
O método de PCR utilizado em nossas aulas foi o qualitativo, onde avaliamos a
presença ou não de uma bactéria bovina em amostras de DNA. O método consiste na
preparação das amostras, feita com a pipetagem de quantidades específicas calculadas
previamente; a etapa de replicação, onde foi utilizado um termociclador; e a etapa de
eletroforese, onde foi feita a avaliação do resultado.
Também realizamos uma simulação de PCR em tempo real quantitativo, o qual é um
método que permite que quantifiquemos o DNA replicado a cada ciclo, através da utilização
de um corante fluorescente específico para esse método. O termociclador, nesse caso, tem
que ser específico também, pois deve ser capaz de ler a fluorescência emitida pelo corante.

MÉTODOS:

Para a PCR foram utilizados os reagentes descritos na tabela 1. Os primers

utilizados foram: 5’CCTTCCGCACACCGTTCAG3’ e 5’CATCAGTGGGGACGCTACTACG3’,
onde foi considerada a amplificação das duas fitas de DNA. Utilizamos dois controles para
essa amostra, um negativo e um positivo. O termociclador foi disponibilizado pelo Instituto
de Biociências e foram realizados 35 ciclos para a replicação.

Tabela 1 - Reagentes utilizados

Reagente Concentração

Tampão 1x

dNTP 0,1 mM

MgCl2 1,5 mM
 Primer foward 0,4 mcM

Primer reverse 0,4 mcM

Taq DNA polimerase 1 un

DNA 100 ng

Na eletroforese utilizamos um gel de agarose de 1,5% (m/v). Todo o equipamento foi

disponibilizado pelo Instituto de Biociências. O corante utilizado foi o GelRed, que é
fluorescente, para podermos analisar o resultado. No equipamento foi utilizado 100 V e 90
mA por 15 minutos.
Na simulação de PCR em tempo real quantitativa nós utilizamos uma planilha com
os dados das amostras e do controle, onde executamos diversos cálculos para então
analisar o resultado.

RESULTADOS:

Os resultados analisados através da eletroforese mostraram negativo para os

controles negativos, positivo para os controles positivos e negativos para as amostras, de
modo que é possível afirmar que não há quantidade suficiente do gene da bactéria na
amostra para ser significativa.
Os dados calculados para a PCR em tempo real quantitativa estão descritos na
tabela 2.

Grupo Média do gene de Média do gene ΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt

interesse housekeeping

Controle 30,55 17,175 13,38 -0,18 1,13

Controle 30,55 16,955 13,60 0,04 0,97

Controle 30,79 17,11 13,68 0,13 0,91

Tratado 25,825 18,00 7,83 -5,72 52,71

Tratado 25,63 17,95 7,68 -5,87 58,49

Tratado 25,69 17,88 7,81 -5,74 53,45

Com esses dados pudemos obter o resultado de que a expressão no gene tratado
foi de cerca de 55 vezes maior em relação ao grupo controle, no método de quantificação
relativa.
Também realizamos o método de quantificação absoluta, onde usamos uma curva
de calibração para determinar o resultado de um outro conjunto de amostras.