Técnicas Aplicadas a

Genética Forense

Alípio dos Santos Rocha

Bioforense Projetos Educacionais
Técnicas:
• Extração de DNA;

• Quantificação;

• Amplificação;

• Hibridização;

• Eletroforese.
 PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
• Técnica utilizada para multiplicar milhões de vezes regiões específicas do
DNA;

• Marco na biologia molecular e fundamental para a genética forense:

• Permite o uso de amostras com muito pouca quantidade de DNA;

• Possibilita a análise simultânea de múltiplos marcadores moleculares,
aumentando o poder de análise e reduzindo a quantidade de amostra
necessária.

O que é necessário?
1. DNA molde.
2. Oligonucleotídeos específicos ou
iniciadores (primers).
3. Enzima Taq polimerase e tampão.
4. Desoxinucleotídeos (dNTPs) e Mg2+.
 A
Etapas básicas:

B
(A) Desnaturação (separação das
fitas).

C
(B) Anelamento (ligação
complementar dos iniciadores ou
primers).

(C) Polimerização (síntese da fita nova

de DNA).

Número de cópias: 2nº de ciclos+1

Vídeo PCR
Características dos primers:

• Complementares somente às regiões alvo;

• Entre 15 e 30 nts;

• Conteúdo de G+C entre 40 a 60%, com distribuição homogênea, para aumentar

a estabilidade da ligação à região alvo;

• Presença de um ou dois resíduos de GC na extremidade 3` para aumentar a

estabilidade da extremidade de polimerização;

• Não possuir sequências autocomplementares e invertidas – evitar a formação de

dímeros de primer;

• Temperaturas de anelamento próximas para cada primer e entre 52 e 65 oC.

• As sequências dos primers são dadas sempre no sentido 5` => 3`. Atenção ao
primer complementar à fita senso do DNA.
Hot Start impede a amplificação inespecífica
 Alvo 1 Alvo 2 Alvo 3 Alvo 4

PCR Multiplex:
• Utilização de primers para dois ou mais alvos
numa mesma reação;

• Necessário que todos os Primers tenham

temperaturas de anelamento próximas;

• Geralmente conta com uma estratégia de

marcação para diferenciar os produtos de cada
primer;
Multiplex na Genética Forense:

• Mais de 23 marcadores amplificados na mesma reação;

• Sensibilidade de menos de 1 ng de DNA;

• Possibilidade de análise de misturas e amostras

degradadas;

• Diferentes corantes fluorescentes utilizados para

distinguir alelos com comprimentos sobrepostos.
 Quantificação do DNA
• PCR em Tempo Real (qPCR):
• Técnica que permite a detecção de produtos durante a progressão
de reações de amplificação de DNA.

Na eletroforese em gel os produtos são

observados após o término da ciclagem,
quando ocorre a saturação da reação de
PCR.
 Princípio da qPCR

• Threshold: sinal basal de fluorescência emitido pelas amostras.

• CT: ciclo da PCR correspondente ao limiar de detecção de fluorescência.

 Opções de Químicas para Amplificação Real-Time

Corantes intercalantes de dsDNA

Brometo de Etídio (1ª Geração)
SYBR Green (2ª Geração)
EvaGreen (3ª Geração) Hibridização
MGB Quantiprobe/Eclipse
Adjacent probes/ HybProbes
Primer Molecular beacons
LUX Scorpions
AmpliFluor Uniprimer

Probes Hidrólise
TaqMan (5' nuclease assay)
TaqMan MGB

Mais usados
• Corantes Intercalantes de dsDNA:
• Moléculas que se ligam especificamente a DNA fita dupla;
• O primeiro utilizado foi o brometo de etídio. Devido a seu potencial
carcinogênico agora é muito pouco utilizado.
• SYBR® Green é excitado a 497 nm e emite a 520 nm.
dsDNA + corante livre
(fluoróforo fraco)

Ligado a dupla fita

(fluorescencia 1.000x)

→Detecção de todas moléculas dupla fita DNA

→Detecção de produtos de PCR específicos e não-específicos
 Sybr Green
• Incorporado logo após a formação da
dupla fita;

• A fluorescência é computada ao final da

etapa de extensão.

• Menos custoso e de simples manuseio;

• Corante brilhante — resultados melhores que
EtBr;
• Amplamente usado;
• Permite análise de dissociação (melt) +
eletroforese em gel usada para confirmar os
resultados.
 Análise de Dissociação
• Permite verificar a especificidade da amplificação, através da análise da
variação de fluorescência emitida durante a dissociação do DNA. Essa análise
se dá acompanhando a fluorescência durante acréscimos de 0,1 a 1 oC.

Amplificação específica =>

apenas um fragmento
multiplicado

Amplificação inespecífica
=> dois fragmentos
multiplicados
SYBR™ Green I é tóxico para a PCR,
assim utilizado em baixas concentrações.
Some dye can relocate
as melting begins

Nova tecnologia de corante para HRM SYBR® Green I

Corantes saturantes

• Ligam-se a todos os sítios

possíveis do DNA;

• Aumentam a sensibilidade da
técnica. Dye saturation leaves no room for
relocation events during melting LC Green™ I
• Sondas de hidrólise:
• Utiliza um oligonucleotídeo complementar ao 95°C 95°C

amplicon, ligado a um fluoróforo e um ou dois

inibidores (quencher). 60°C

R Q

Sem fluorescência
R Q

3` 5`

Tamanho do alvo: 100–150 bp

 95°C 95°C

60°C

Taq Pol
R Q

3` 5`
 95°C 95°C

60°C

Aumento da
fluorescência
Taq Pol
R Q

3` 5`
 Princípio: atividade exonuclease 5` => 3`

1. 2.

3. 4.

(Sondas de Hidrólise/ Sondas TaqMan)

Aplicação Forense

Kits comerciais que utilizam sondas de hibridização com alvos diversos:

1- Sequências do DNA autossômico conservadas entre indivíduos. Uma

sequência curta (< 100pb) e uma longa ( em torno de 200 pb) dão
estimativa do nível de degradação da amostra pela relação [curta]/[longa].

2- Sequência presente no cromossomo Y conservada.

3- Sequência de um fragmento de DNA contido no reagente de preparo

(controle interno). Útil para observar a presença de inibidores de PCR nas
amostras.

20
 Métodos de Quantificação em qPCR

• Comparação de expressão gênica diferencial em diferentes amostras :

Quantificação

Quantificação Relativa Quantificação Absoluta

Cópias de mRNA alvos relativos a um Cópias de mRNA alvos relativos a um

RNA interno, ex. GAPDH ou rRNA padrão externo e por numero de cópias
ou unidade de massa
 Quantificação Relativa
• Feita a partir da comparação do nível de sinal obtido do gene alvo em relação
ao de um gene de expressão constante, dito como endógeno, referência ou
padrão.
• A emissão do gene padrão tem a finalidade de normalizar variações
experimentais entre as amostras.
• A quantificação se dá através de várias formas. A mais usadas é a análise do
ΔΔCt.

mais cDNA menos cDNA

EC EC
fluorescence

(housekeeper) GOI GOI

(gene of interest)
relative

threshold threshold

10 15 25 30
CT=5 Nº ciclo CT=5
• Necessário preparar duas curvas padrão no início do experimento para mostras que as
eficiências das amplificações dos genes alvo e de referência não variam mais que 0,1.

• Uma amostra não tratada será usada como padrão para comparar as variações entre as
amostras tratadas.

Gene de Gene Alvo

Referência
1. Calcular o valor do Ct do gene alvo (GA) e do gene de referência (GR).
2. Calcular a diferença de Cts entre o gene alvo e o endógeno : Ct = Ct GA - Ct GR.
3. Calcular a diferença entre Ct da amostra e o Ct do padrão:
Ct=Ct amostra-Ct padrão
4. Normalizar a expressão do gene alvo = 2-Ct

Amostras Ct GA Ct GR DCT DDCT 2-DDCT

Padrão
22.8 32 -9.2 0 1

Amostra 1
18 31 -13 -3.8 13.93

A confiabilidade da análise da quantificação relativa depende fortemente da

estabilidade do Gene Referência.
 Quantificação Absoluta

• Determina número de cópias absoluto de uma amostra;

• Valor de CT de amostras desconhecidas comparadas a curva padrão de padrões
conhecidos ;
• Importante: Eficiência de Amplificação dos padrões e dos alvos são equivalentes.

Log quantidade de padrão

Conc. inicial da amostra desconhecida

Kubista et al, Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 95–125

 Análise de corridas de real-time PCR
Quantificação Absoluta com uma curva padrão

Fluorescência Exemplo com 4 padrões

de concentrações conhecidas

Ciclo
 Análise de corridas de real-time PCR
Quantificação Absoluta com uma curva padrão

Fluorescência Cálculo de limiar de ciclagem

(cycle thresholds)

Ciclo
Ct1 Ct2 Ct3 Ct4

27
 Análise de corridas de real-time PCR
Quantificação Absoluta com uma curva padrão

Concentração Linha de
original regressão
(log-scale) y = a + bx

Ciclo
Ct1 Ct2 Ct3 Ct4

28
 Análise de corridas de real-time PCR
Quantificação Absoluta com uma curva padrão

• Linha de regressão de acordo com y = a + bx

• a: Intercepção com o eixo y;
• b: constante: coeficiente de regressão, slope;
• y : variável dependente;
• x : variável independente.

• Considerações para a montagem da curva padrão:

• DNA deve ser de uma única espécie e puro;
• Pipetagem precisa;
• Estabilidade de padrões de diluição.

29
 Análise de corridas de real-time PCR
Quantificação Absoluta com uma curva padrão

• Considerações para a montagem da curva padrão:

• Gerada usando diluições seriadas de 5 ou mais concentrações;

• Cada reação é tipicamente realizada em triplicatas e 10 vezes diluídas

(esperado uma diferença de Ct de 3,32 entre cada diluição - log210; 100;
etc…);

• A quantidade de alvo desconhecido deve estar dentro do alcance da curva,

nunca extrapolar a curva.

A precisão do ensaio de quantificação absoluta depende completamente da

precisão dos padrões
 Análise de corridas de real-time PCR
Quantificação Absoluta com uma curva padrão

Concentração
original
(log-scale)

Ciclo
Ct1 Ct2 Ct3 Ct4
Amostra desconhecida
31
 Análise de corridas de real-time PCR
Quantificação Absoluta com uma curva padrão

Concentração
original
(log-scale)

Ciclo
Ct1 Ct2 Ct3 Ct4
Amostra desconhecida
32
 Hibridização
• Princípio utilizados em várias técnicas;
• Consiste em utilizar um fragmento de
DNA/RNA complementar a o alvo de
interesse como uma sonda marcada;
• A marcação se dá de diferentes maneiras:
• Fluoróforo.
• Substrato para uma reação indicadora.
• Anticorpo.
• Muito importante nas primeiras técnicas
de VNTRs.
 Micro Arranjo
• Técnica baseada em hibridização
que permite analisar diferenças
entre os elementos do DNA/RNA
• Inibido
entre dois indivíduos ou grupos
• Não regulado
distintos; • Estimulado

• As regiões de interesse são fixadas

em micro poços de uma placa.
Ambos os grupos são incubados
com a placa para permitir as
hibridizações específicas;

• Os resultados são captados e

analisados por computador;

• Existem estratégias para identificar

alelos de STRs em
desenvolvimento.
Sequenciamento
• Técnicas que permitem determinar a ordem dos
nucleotídeos de fragmentos de DNA;

• Na genética forense é utilizada na análise do DNA

mitocondrial;

• Duas gerações:
• Sequenciamento de Sanger
Ion Torrent
• Sequenciamento de nova geração
Illumina
Sequenciamento de Sanger:

• Utiliza reações de PCR com um primer (senso ou anti-senso) e

didesoxinucleotídeos para provocar paradas na reação de polimerização;

• Os fragmentos são analisados

em ordem de tamanho,
possibilitando montar a
ordem dos nucleotídeos
incorporados;

• As primeiras versões usavam

gel de poliacrilamida para a
separação. Atualmente usa-se
eletroforese capilar e ddNTPs
marcados diferencialmente
para determinar a sequência.
 Duas versões da Técnica de Sanger

Gel de Poliacrilamida Automatizado com Eletroforese Capilar

 Eletroforese de DNA

• Técnica de análise de ácidos nucleicos baseada na migração diferencial através de

um material poroso sob uma diferença de potencial elétrica (voltagem)
constante.

• Duas versões:
Gel de agarose
• Em placa
Gel de poliacrilamida

• Capilar
Componentes:

• Catodo: eletrodo de carga negativa;

• Anodo: eletrodo de carga positiva;
• Tampão de corrida: manutenção do pH e da estrutura linear das moléculas de DNA. O TAE
(Tris/Acetato/EDTA) é mais indicado para separação de moléculas grandes de DNA. Já o
TBE (Tris/Borato/EDTA) é mais indicado para análises rápidas de fragmentos menores de
DNA;
• Tampão de amostra: acrescido às amostras antes da aplicação no gel para conferir peso
(sacarose ou glicerol) e evitar a dissolução no tampão de corrida. Também contém
indicadores (azul de bromofenol e/ou xileno cianol), substâncias coloridas que indicam
o progresso da corrida eletroforética;

• Gel: matriz porosa responsável pela migração diferencial dos fragmentos de DNA em
razão de seus tamanhos. A formação da malha se dá através do processo de
gelificação. Duas constituições:

• Agarose: polissacarídeo extraído de algas. Manuseio mais simples. Usada para

separação de fragmentos maiores de DNA (> 100pb);

• Poliacrilamida: gel formado pela polimerização de acrilamida e bis-acrilamida,

catalisada por persulfato de amônio e β-mercaptoetanol. Forma poros menores,
indicada para separação de fragmentos menores de DNA (< 100pb).
 Sistema de
Eletroforese Vertical

• Utilizado para eletroforese

em gel de poliacrilamida.

• Montagem mais complexa

em relação ao sistema
horizontal.
• Ao final da corrida eletroforética, os resultados podem ser visualizados com o uso de
corantes intercalantes de DNA (brometo de etídio, SYBR Green, Gel Red), sais de prata
ou com marcação por sondas de hibridização.

Brometo
Prata

Northern Blot
Padrões de Tamanho:
• São conjuntos de fragmentos de DNA de
tamanho conhecidos aplicados em paralelo às
amostras;

• Indicam o tamanho dos fragmentos das

amostras por comparação de posição;

• Também podem ser utilizados para uma

estimativa da quantidade/concentração dos
fragmentos de DNA na amostra.
 Eletroforese Capilar
ABI Prism 3500
 Eletroforese Capilar

• Resultados precisos (análise computacional);

• Utiliza kits padronizados e otimizados para a genética forense:
• Garantia da qualidade da análise;
• Permite a análise de perfis genéticos obtidos em qualquer laboratório;

• Preparo das amostras:

• Adição do produto de PCR (1 µL) e padrão interno de tamanho a formamida ultrapura (função
de manter os DNAs simples fita na conformação estendida).

• Desnaturação a 95 oC seguido de choque térmico com gelo ou a 4 oC para impedir a formação

de duplas fitas e estruturas secundárias.
• Kits de PCR multiplex para STRs com primers
marcados com fluoróforos de diferentes cores.
Análise Dupla – Separação por Tamanho e Cor da Marcação
Determinação do Tamanho dos Amplicons:

• Comparação do tempo de passagem pelo laser entre os fragmentos amplificados e os

fragmentos de um padrão interno adicionado na amostra;

• O padrão interno possui moléculas de DNA de tamanho conhecido marcadas com

fluoróforo diferente dos usados nos primers na PCR multiplex;
Determinação dos Alelos:
• Necessário um outro padrão de comparação, a escada alélica (ladder):
• Fornecida junto ao kit de PCR multiplex;
• Composta por todos os alelos de todos os marcadores STRs do kit, marcados com
os mesmos fluoróforos;
• Necessária em toda corrida eletroforética. Requer mesmo preparo das amostras.
• Para cada local STR é feita a comparação da posição dos fragmentos da amostra com os
alelos conhecidos da ladder.
Escada Alélica
Eletroferograma
 Picos Stutter:

• Subprodutos da amplificação de STRs com uma ou mais unidades de

repetição a mais ou a menos que o alelo amplificado corretamente;
• Surgem quando a polimerase adiciona erros, causados pela estrutura
repetitiva dos STRs.

Alça formada no amplicon =>

stutter +1

Alça formada no DNA

molde=> stutter -1
• Deve-se atentar para não confundir o stutter com um alelo real. Trabalhos de
validação dos kits e equipamentos de eletroforese capilar são necessários.
Drop Out:
• Perda de um alelo no heterozigoto. Pode ser causado por:
1. Pouca quantidade de DNA na PCR gerando uma amplificação
preferencial;
2. Mutação no sítio de anelamento de primer, impedindo a amplificação do alelo.
Caso haja suspeita, usa-se outro kit de PCR com primers diferentes para o local em
questão;

Mutação

3. Muitos STRs tem sítios de ligação de primers polimórficos. Para contornar o

problema são adicionados primers com sequências para cada polimórfico ou usa-
se primers para outras regiões, conservadas.
Onde Estudar:
• Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology,
John M. Butler - 2012.

alipiobqi@yahoo.com.br