Técnicas de Biologia Digestão de DNA com enzimas

Molecular de restrição e eletroforese em

gel de agarose

Enzimas de restrição: origem Enzimas de Restrição

•Endonucleases sítio-específicas isoladas de EcoRI metilase
procariotos
•Protegem a bactéria do ataque de vírus
•Protegem seu próprio DNA metilando-o no
sítio de restrição
•Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em
Biologia Molecular

Werner Arber (Nobel de 1978)

descobriu as enzimas de
restrição em 1971

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 Características dos sítios de restrição
Extremidades Geradas
• Tipicamente, são sequências 5’-salientes
palindrômicas de 4-8 bp
Bam HI

3’-salientes
Kpn I
• Algumas enzimas toleram alguma
degeneração no sítio

• Clivagem produz extremidades Abruptas (cegas)

5’-PO4 e 3’-OH
Sma I

Frequência de corte no sítio

de restrição
• Sítios estão espalhados randomicamente no genoma

• Número estimado depende da composição de bases:

• Para genoma com conteúdo de 50% GC: Eletroforese

G A A T T C
(¼) (¼) (¼) (¼) (¼) (¼) = 1/4096

• Se o genoma tiver 4 x 106 pb, então haverá 1000 sítios

• Distribuição randômica implica na geração de fragmentos de diversos

tamanhos

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 Eletroforese em gel
• Ácidos nucleicos têm carga global
negativa (PO4-)

• Separação em géis de agarose ou

poliacrilamida

• Migração inversamente proporcional ao

tamanho

• Influência da topologia
• linear vs. circular acrilamida
• Fita dupla vs. fita simples

Eletroforese de gel de agarose

• Aplicar voltagem constante

• Detectar com corante fluorescente
(brometo de etídeo, SYBR, etc)

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 Cálculo do tamanho
de fragmentos
• Plotar mobilidade relativa vs log [tamanho] em pb
• Melhor usar dsDNA linear

4.5

4.0

log(bp)
3.5

3.0

2.5
0.2 0.4 0.6 0.8 1
Mobilidade (cm)

Digestão DNA Linear X DNA Circular Digestão de DNAs com

múltiplos sítios de restrição

Digestão (2 sítios de restrição)

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 Mapas de restrição Mapas de restrição

Pulse Field Gel

Electrophoresis (PFGE)

Técnicas de Hibridização

Configuração de eletrodos do aparato CHEF

(contoured-clamp homogeneous electric field)

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• As fitas de DNA podem ser separadas em condições que rompem
as ligações de hidrogênio
Técnicas
• Fitas duplas (duplexes) podem se formar in vitro
• Formação dos duplexes depende da complementaridade das 1) Southern Blot: deteção de DNA: sonda é DNA ou
sequências RNA marcado.
• Sondas homólogas (fita simples) podem ser usadas para detectar
ácidos nucleicos específicos 2) Northern Blot: deteção de RNA: sonda é DNA ou
RNA marcado.

calor

Hibridização de ácidos nucleicos Northern e Southern Blot

Southern Blot Northern blot
• Descrito pelo Dr. Southern (1975)
• Digestão do DNA seguido de eletroforese
• Transferência para membrana (imobilização)
• Detecção com sonda (radioativa ou não)

Northern Blot
Southern blot
• Eletroforese de RNA
Exemplos de sondas
• Fragmentos de DNA clonados
• Oligonucleotídeos sintéticos
• RNA (riboprobes)

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 Transferência do DNA/RNA para
membrana Hibridização
• A sonda (DNA) é desnaturada por calor,
• Ação capilar adicionada à membrana e incuba-se o sistema
por um tempo suficiente para permitir a
interação

• No caso do Southern e Northern Blot, a

temperatura de incubação é um parâmetro
essencial

“Melting Temperature” (Tm) e Estringência Detecção dos híbridos

sonda-molécula alvo
Melting Temperature (Tm)
• temperatura em que 50% das fitas estão separadas
• Autorradiografia: exposição da membrana a um
Estringência filme de raios X (se a sonda for radioativa)
• Refere-se às condições experimentais que favorecem a
hibridização (temperatura de incubação e concentração de
sais) • Detecção de atividade enzimática: sondas não-
radioativas marcadas com enzimas. Incubação com
• Reflete a homologia entre a sonda e o alvo substrato que pode gerar luz ou um preciptado
colorido
alta Tm-15ºC
moderada Tm-25ºC
baixa Tm-35ºC

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 Autorradiografia: exposição da membrana a Resumo
um filme de raios X

Marcação radioativa de sondas de DNA Nick translation

Targe t dsDNA

ADigestão branda
nick with a 3Õ-OH com
terminus has been
DNAseI produz cortes
introduced by Dnase I into the DNA duplex
The first nucleotide on the 5Õ-P side
of(nicks)
nick has been removed
•Nick translation
Ação Exo 5´→3´ e Polimerásica
•Random priming The 5-3 exonuclease and the A5´→3´da
nucleotide has DNA Pol toI replace
been inserted na
5-3 polymerase plus presença
the one removed. deThedNTP
nick has sendo um
been translated
dNTP's one of which is labelled deles
one radioativo
position along the chain in a 5Õ to 3Õ direction.

The nick has now translated 4 positions along

the DNA chain. The process continues

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 Random Priming

• usar [32P]dNTP Aplicações das Técnicas de

Hibridização

Klenow = DNA Pol. I sem atividade

Exo 5´→3´

Aplicações “Fingerprinting” genético

• Teste de paternidade/maternidade • Uso de sonda de DNA repetitivo

produz uma padrão complexo de
bandas no Southern Blot
• Identificação criminal (forense)
• Distinção de espécies, cepas,
indivíduos, etc.
• Diagnóstico de doenças genéticas
• Pode ser usado no diagnóstico,
taxonomia e análises forenses

Isolados de M. tuberculosis

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 Identificação forense: o caso da
família Romanov
Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis.
Nature Genetics 6, 130 - 135 (1994)

Teste de Paternidade Teste de Paternidade

MOM = Mãe
DAD = Pai
D1 e S1 = Filha e Filho de MOM e DAD
D2 = Filha do primeiro casamento de MOM
S2 = Filho adotivo

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 RFLP Diagnóstico de anemia falciforme por RFLP
Restriction
Fragment
Length
Polymorphisms

• Ganho ou perda de sítios de restrição

produzem fragmentos de DNA de
diferentes tamanhos para análise por
Southern blot
• Também é sensível a eventos de
inserção e deleção
• Polimorfismos não precisam estar
relacionados com o lócus genético da
sonda

Sequenciamento de DNA

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 Estratégias de Sequenciamento Reação da DNA Polimerase
Dois métodos clássicos:

1) Método de Maxim & Gilbert: técnica química (em desuso)

2) Método de Sanger (1977): Reação de Terminação de Cadeia

(técnica enzimática)

Pré-requisitos:
DNA polimerase, magnésio
primer
dNTPs (substrato)
ddNTPs (análogos dos dNTPs)

Dideoxirribonucleotídeo O
| 5’
O = P - CH2 o BASE
|
O
3’ 2’ H
H

O H
BASE
| 5’
O = P - CH2
o
|
3’ 2’
O H H

H H

Fim de Cadeia

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 A Reação de Sequenciamento
+ 1 dNTP radioativo
template
3´ 5´
primer
5´ 3´
DNA pol
dNTP

Principais aperfeiçoamentos
da técnica
AUTOMAÇÃO

• Introdução de instrumentos
de sequenciamento baseados
em capilares e leitura ótica a
laser da fluorescência gerada

96 amostras em paralelo

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 Sequenciamento
automático de DNA

• ddNTPs ligados a uma molécula

fluorescente → todos os fragmentos
terminando em um ddNTP específico
apresentam uma cor particular
• todos os 4 ddNTPs marcados em um
único tubo
• separação dos fragmentos em capilar
• feixe de luz lazer
• sequência de DNA → sequência de
cores

Principais aperfeiçoamentos
da técnica Pirosequenciamento
• Desenvolvimento da bioinformática,
com sistemas de softwares para
interpretação dos dados gerados e
montagem das sequências.

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 Pirosequenciamento Sequenciamento de DNA em
nanoporos

Técnicas de Hibridização: Limitações

• requerem muito DNA (ordem de microgramas)

Reação em Cadeia da Polimerase
Polymerase Chain Reaction • DNA tem que estar bem puro
(PCR)
• tempo do ensaio: até uma semana

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 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Kary Mullis (1985)

• Fragmentos específicos de DNA são

enzimaticamente amplificados

- Amplificação de até 106 X é possível!

- Pode detectar até 1 molécula de DNA!

•Tolera DNA relativamente impuro

•Tempo: menos de 1 dia !

PCR Taq Polimerase

O que é necessário?? • DNA polimerase de Thermus aquaticus:

organismo termofílico
Termociclador
• Enzima resiste a altas temperaturas
DNA Molde (template)
Primers • Temp. ótima: 72-74°C
dNTPs
DNA Polimerase
Mg2+

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 Desnaturação do template
95°C
Princípio da Técnica Anelamento dos primers
45-65°C

Reação de Replicação in vitro Extensão pela polimerase

72°C
1. Desnaturação: 94°C

2. Anelamento (Tm)*: 45°C - 60°C

3. Polimerização: 72°C

*Tm = 4(G+C) + 2(A+T) (para primers pequenos) =

2(A + T) + 4(G + C)

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Algumas aplicações clínicas do PCR

• Clonagem de genes
• Screening (triagem) de genes mutantes
• Determinação de sexo pré-natal
• Diagnóstico de doenças genéticas
• Detecção de infecções
• Monitoração de terapia contra o câncer

Identificação

Três regiões
amplificadas para
gerar um “DNA
fingerprint”

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 Aplicações não-clínicas

• Sequenciamento de DNA
• Screening de clones
• Estudos de ecologia e evolução molecular
• Identificação de organismos transgênicos
• Fingerprinting forense

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