Replicação do DNA

Prof. Dr. Nicolau Brito da Cunha

•Brasília
•2014
Complexidade do Processo
Replicação no ciclo celular de E. coli

Em condições ótimas:

• Replicação: ~ 40 min
• Divisão: ~20 min
A síntese de DNA é catalisada pela DNA
polimerase
Requerimentos essenciais para todas as DNA
polimerases

1. DNA Molde 2. Iniciador (primer)

Atividade de Exonuclease 3’  5’
(correção) Bases não-
pareadas
Atividade de Exonuclease 5’  3’
(correção)

Sítio de hidrólise 5’  3’

Quebra de uma fita

 Fragmento Klenow (grande)
Deslocamento de corte: ‘nick translation’
Características do Processo

Regras fundamentais
1) A Replicação é semi-conservativa

Nova Nova

Fita Fitas Fita

original fihas original
Possíveis modelos de replicação do DNA

Conservativo Dispersivo Semi-Conservativo

 Experimento de Meselson e Stahl (1958)

DNA extraído e
centrifugado em
gradiente de
cloreto de césio
2) A replicação começa em uma
origem e usualmente prossegue
bidirecionalmente
Direcionalidade da Replicação
Bidirecional

origem

Unidirecional
origem
Direcionalidade da Replicação

Regiões nascentes

Ponto de crescimento
origem
unidirecional

Ponto de crescimento Ponto de crescimento

bidirecional
3) A síntese segue na orientação
5’ 3’e é semidescontínua

Reiji e Tsuneko
Okazaki, 1968

Frag. Okazaki
E.coli = 1.000 a 2.000 n
Eucariotos = 150 a 200 n
 Polimerização – 5’  3’

Desoxirribonucleosídeo
trifosfato

Iniciador
ou
Primer

Molde ou
template

Desoxirribose
Polimerização – 5’  3’
 Enzimas envolvidas no
processo
1. Helicase
2. Topoisomerase II
3. SSBs
4. DNA Iniciase ou primase
5. DNA Polimerase III Holoenzima
6. DNA Polimerase I
7. DNA ligase
 Comparação entre DNA polimerases de E. coli

DNA polimerase

• Gene estrutural pol A pol B pol C

• Subunidades (número de diferentes tipos) 1 ≥4 ≥ 10

• Mr 103.000 88.000 830.000

• Exonuclease 3’  5’ (correção) sim sim sim

• Exonuclease 5’  3’ sim não não

• Velocidade de polimerização (nt/s) 10 – 20 40 250 – 1.000

• Processividade (nt adicionados antes que a 3 – 200 1.500 ≥ 500.000

polimerase se dissocie)
DNA Polimerase I de E. coli

Nick ampliado

Domínio: Pol Exo 3’- 5’ Exo 5’ – 3’

Fragmento: Grande Pequeno

(Klenow)

•Mr = 130 kDa

DNA polimerase III de E. coli
 DNA polimerase III de E. coli
Complexo único de
‘agarrar’
c y d'
b b d b b
g
e e
pol e revisão

a q q a
Núcleo

t t
Dímero de ligação

•DNA Pol III Holoenzima: Processividade > 500.000 n

 Subunidade β da Pol III de E. coli
“Braçadeira”

•DNA Pol III Holoenzima: Processividade > 500.000 n

 Principais subunidades da DNA pol III e suas funções

“Complexo de
´ carregamento
do grampo”

(Grampo)
Replicação: DNApoI IIl + 20 enzimas e
proteínas estabilizadoras/moduladoras

Replissomo
Processo geral da
replicação de DNA

(etapas gerais e
mecanismos enzimáticos)
a) Abertura das duas
fitas. Modo de ação da
DNA helicase
Superenovelamento
DNA relaxado e superenovelado
DNA superenovelado
b) Estabilização das duas fitas.

Topoisomerase II

Proteínas de ligação ao DNA (SSB)

 Mecanismo de ação da topoisomerase II
Uma quebra da dupla fita é introduzida
em uma porção do DNA (segmento G) e
uma outra porção do mesmo DNA
(segmento T) é passado através dessa
quebra. Desse modo, superhélices
negativas são introduzidas, removendo
Domínio
DNA hélice 1 torções no DNA.
ATPase
DNA
hélice 2

Religação da
Ligação de ATP, Hélice 1 passa hélice 2 e
dimerização dos através da hélice 2 liberação da DNA hélice 1
domínios ATPase, rompida hélice 1
quebra da fita
dupla hélice 2
 Proteínas SSB
DNA
polimerase

Região de fita simples

do DNA molde, com
segmentos curtos
pareados

Monômeros
de SSB

Ligação cooperativa dos monômeros SSB

 5' 3'

helicase

SSB
SSB

3'
5'

3' SSB

3' 5'
5'
síntese da síntese da fita
fita contínua descontínua
c) Síntese dos iniciadores de RNA.

DNA Iniciase ou primase

d) Polimerização.
DNA Pol III Holoenzima
e) Remoção dos iniciadores de RNA e substituição por fragmentos
de DNA
DNA Pol I

f) Remoção dos cortes e preenchimento de espaçõs (gaps)

DNA ligase
 DNA ligase
Enzima

DNA ligase
Ribose Adenina ATP ou NAD+

1. Adenilação da
DNA ligase

PPi ou NMN

3. Deslocamento do AMP sela o nick

Enzima Ribose Adenina
Ribose Adenina
2. Ativação do 5’ Enzima
fosfato no nick AMP

DNA ligase

DNA selado
Nick no DNA Ribose Adenina
A DNA polimerase I não é a verdadeira replicase
1. Ela é muito lenta: 20 nt/s, isto é, 5,3 dias para replicar o
cromossomo de E. coli

2. Ela é muito abundante: ~ 400 moléculas por célula de E.

coli

3. Ela é pouco processiva: se dissocia do molde depois de

incorporar 20-50 nt

4. Ela não consegue iniciar a síntese do DNA de novo

5. Células que contém a mutação polA1 (sem atividade de

pol I) são viáveis
Processo detalhado de replicação do
DNA

Etapas
Iniciação da Replicação
 Proteínas e genes envolvidos na
íniciação da replicação em E. coli
Origens de replicação - procariotos

245 bp
 Iniciação da Replicação
Molde
superenovelado

Repetições
Repetições 9 bp
13 bp

Ligação de primers
e replicação
Alongamento
 Forquilha de Replicação
Molde da fita líder

Grampo deslizante

DNA polimerase na fita líder

Fita recém-sintetizada

Dupla hélice de
DNA parental
O próximo fragmento
Okazaki começa aqui

Fragmento Okazaki primossomo

Proteínas SSB
Molde da fita atrasada

Carregador do grampo

DNA polimerase na fita atrasada

Fita molde

Fita recém-sintetizada

DNA polimerase III

DNA polimerase I
Helicase

Fita recém-sintetizada

Fita molde

www.stanford.edu/.../causes/mutation/q5.html
Modelo da Síntese Simultânea das duas fitas
 Complexo Carregador
do Grampo Grampo
d'
c y
d b b
g
b b

e e

q q a
a

t t
Modelo da Síntese Simultânea das duas fitas
 Síntese da fita atrasada
grampo deslizante
fragmento Okazaki sintetizado
primer DNA polimerase previamente

molde da fita atrasada

carregador do
grampo SÍNTESE DO FRAGMENTO OKAZAKI

Parada da DNA pol desencadeia a sua

liberação do grampo

Novo grampo é montado com a

DNA pol no próximo primer
Terminação
 Terminação da Replicação
Origem

Forquilha Forquilha
anti-horária horária

Armadilha
da forquilha
Armadilha anti-horária
da forquilha
horária
Sequência consenso dos sítios Ter

Cromossomo
de E. coli
Proteína Tus ligada às sequências Ter
Terminação da Replicação

Forquilha Forquilha
anti-horária horária

Término da
replicação

Cromossomos
catenados

Topoisomerase II e IV

Cromossomos
separados
 Erros durante a replicação

Processo Erro por nucleotídeo

polimerizado

Polimerização 5’  3’ 1 x 10-5

+ Atividade exonuclease 3’  5’ 1 x 10-7

+ Reparo (“mismatch repair”) 1 x 10-9

Replicação em eucariotos
 Diferenças quanto à origem de
replicação
Procariotos Eucariotos
oriC 245pb ARS ou replicadores
150pb

5'- T/A T T T A Y R T T T T/A -3

Eucariotos: Múltiplas ARS
Múltiplos replicons no DNA de Drosophila
ORC – Complexo de Reconhecimento da Origem
Genome-wide identification and characterization of replication
origins by deep sequencing
Jia Xu et al. (2012) – Genome Biology - doi:10.1186/gb-2012-13-4-r27

Conclusions
Our comparative analysis of origins in fission yeast has allowed us to identify the
sequence characteristics that define origin function in these species. Our results
are consistent with a general model for eukaryotic origin function in which origins
are simply the nucleosome-free regions in the genome with the highest affinity for
ORC [4]. In metazoans, where ORC appears to have little, if any, sequence
specificity [1], this model suggests that any NFR could act as an origin, consistent
with the distributed initiations seen at some loci [44] and the correlation between
origins and promoters [9,40], which are also nucleosome free. Furthermore, the
model suggests that origins are not well-defined genetic elements, but simply the
highest affinity ORC binding sites available in the genome. As long as there are no
large regions of the genome devoid of ORC binding sites, the particular location or
characteristics of these sites may not be important.
 R = CDC6 A= CDT1

Minichromosome maintenance proteins (MCM2 to MCM7)

 Diferenças quanto a velocidade de
polimerização

Procariotos Eucariotos
800 - 1000 n/s 60 - 90 n/s

Humanos: ARS entre 30.000 a 300.000 pb

Replicação do genoma nuclear: diversas DNA Pol
 •Pol α
•Múltiplas subunidades
•Subunidade iniciadora = iniciadores de RNA e
DNA
•Mr subunidade maior = 180.000 Da
•Atividade polimerase = Sem at. Exo 3’ 5’.
• Fragmentos de Okazaki.

•Pol δ
•Múltiplas subunidades.
•Extensão da fita líder e dos fragmentos de
Okazaki
•Com at. Exo 3’ 5’.

•PCNA (FATOR DE PROCESSIVIDADE )

•PCNA (proliferating cell nuclear antigen; Mr 29.000
•Análoga à sununidade β da DNA pol III de procariotos
 •Pol ε
•Múltiplas subunidades.
• Substitui, ocasionalmente, a DNA pol δ
• Reparo do DNA
•Com at. Exo 3’ 5’.
• Análoga à DNA pol I de procariotos

•RPA
•Similar à SSB de procariotos
• FEN1 - exonuclease 5'-3‘ que degrada
os primers nos fragmentos de Okazaki

•RFC = Carregador de braçadeira

para a PCNA
 Forquilha de replicação de DNA de eucariotos

PCNA – fator de processividade; RPA = SSB; FEN1 - exonuclease 5'-3‘ que degrada
os primers nos fragmentos de Okazaki; MCM - potencial DNA helicase.
Modelo de replicação em eucariotos
Replicação do genoma mitocondrial: DNA Pol Υ
 Estrutura da Telomerase
Restante do RNA
da telomerase Proteína telomerase
“dedos”

Região do RNA da
telomerase usada como
molde

Sítio ativo da proteína

telomerase “palma”

telômero
restante do “polegar”
recém
cromossomo sintetizado
Modo de ação da Telomerase
 Procariotos vs eucariotos
E. coli* Humanos**
Conteúdo de DNA 4,2 x 106 pb 3 x 109 pb

Velocidade da forquilha 30 µm/min 3 µm/min

Velocidade da replicação 850 nt/s 60-90 nt/s

Origens de replicação por célula 1 103 - 104

Tempo para replicar o genoma 40 min 8h

Tempo de divisão da célula 20 min 24 h

* Cultivadas a 37º C ** Células HeLa