Metabolismo do DNA: Replicação,

reparo e recombinação

 Prof. Dr. Cleverson Diniz

 Metabolismo do DNA
Replicação do DNA

- Ocorre durante a duplicação celular (Crescimento ou renovação);

- Processo de alta fidelidade e velocidade;
-Três etapas: (1) iniciação da cadeia, (2) ampliação, ou alongamento, da
cadeia, (3) término da cadeia;
Reparo
- Manutenção da integridade celular (Câncer?)

- Múltiplos processos - resolução de danos

Recombinação
- Rearranjo da informação genética (aumento da diversidade genética)
 Metabolismo do DNA

Síntese de um novo filamento ocorre em grande velocidade

 Em humanos:
• 3.000 nucleotídeos / minuto

 Em bactérias:
• 30.000 nucleotídeos / minuto

 A síntese tem alta precisão

 1 erro / 1.000.000.000 (bilhão) de nucleotídeos incorporados
Para o cromossomo da E.coli de 4.600.000 pb – um erro para cada 10.000 replicações.

Consequência? Mutações?
Cromossomo de E. coli
 Regras Fundamentais da replicação do DNA
Fitas velhas - molde

1- A replicação do DNA é semiconservativa;

2- A replicação tem uma origem (procarioto) ou

várias origens (eucarioto) e procede
bidirecionalmente;

3- A síntese de DNA ocorre na direção 5’ → 3’ e

é semidescontínua;

Fitas novas
Como o DNA é replicado?
 Meselson e Stahl (1958)

Centrifugação em gradiente
E. coli
de densidade de CsCl
meio com N pesado meio com N natural
(15N) “leve” (14N)

DNA pesado
(15N) Molécula mãe
original
DNA híbrido (15N/
14
N)
Primeira geração
de moléculas
filhas

DNA leve (14N)

DNA híbrido
Segunda geração
de moléculas
filhas
 Regras Fundamentais

A replicação começa na origem e prossegue bidirecionalmente

 Sentido da duplicação
John Cairns, 1963 Bidirecional
Forquilha de
replicação

Unidirecional
Forquilha de
replicação

Pulsos de timidina H3 (radiotiva)

antes do término da duplicação:
marcação radioativa visualizada nas A duplicação é bidirecional
duas forquilhas de duplicação

Em procariotos, existe uma única origem de duplicação

Em eucariotos: várias origens de replicação
 Em eucariotos: várias origens de replicação

Genoma humano – ~ 10 mil locais de origem (maior velocidade de replicação)

A síntese é contínua numa fita e descontínua na outra...
3’
5’

Direção em que as fitas 3’ 5’

se estendem 5’ 3’

DNA pol só age no sentido 5’- 3’ !!!

3’
5’
3’
5’ Fita líder (contínua)

Direção em que as fitas 3’ 5’

se estendem 5’ 3’

3’ Fita descontínua
5’
 Onde a síntese de DNA é iniciada?

Origem de replicação:
- Sequência específica para ligação de proteínas iniciadoras (promovem abertura
da dupla hélice)
E. coli: região de 245 pb

Sítios de ligação da proteína DnaA

(proteína de iniciação)
Sequências de 13 pb Sequências de 9 pb

Ricas em T

Menor gasto de energia para separar as fitas

 Modelo para a iniciação da replicação na
origem da E. coli

 DnaA (proteína de ligação): liga-se às quatro

regiões de 9 pb;

 HU reconhece e desnatura o DNA na região de

13pb;

 DnaC posiciona DnaB dentro da região

desenovelada;

 Dois hexâmeros de DnaB (helicases) ligam-se

as fitas de DNA preparando a fita para a
síntese do DNA.
Abertura e desenrolamento do DNA

Helicase Topoisomerase

SSBs (single strand

binding proteins)

DNA pré-replicativo
unifilamentar sem
proteína SSB

estruturas
em grampo

DNA pré-replicativo
unifilamentar com
proteína SSB
 Abertura e desenrolamento do DNA

 As topoisomerases causam quebras transitórias no DNA

Desenrolando o
DNA parental

Torção das fitas de DNA a

frente da forquilha de
replicação

Quebra transitória serve como

suporte giratório que permite a livre
Topoisomerase rotação das fitas de DNA
 Abertura e desenrolamento do DNA

 As topoisomerases causam quebras transitórias no DNA

 Topoisomerase I

Quebra

Quebras unifilamentares Antitumorais (agentes alquilantes) – inibem a ação

temporárias da topoisomerase I, ou estabilizam o complexo de
quebra entre enzima-DNA-droga
 Abertura e desenrolamento do DNA

 As topoisomerases causam quebras transitórias no DNA

 Topoisomerase I  Topoisomerase II (DNA girase)

Quebra

Quebras bifilamentares temporárias

O antibiótico coumermicina bloqueia a replicação do DNA em E.

coli, inibindo a atividade da DNA-girase
 Uma vez que a dupla hélice está aberta, como é
feita a síntese da nova fita?

DNA polimerases Prêmio Nobel em 1959

Arthur Kornberg (1957) : DNA polimerase I

Requerimentos da DNA pol I para sintetizar nova fita de DNA :

• Desoxirribonucleosídeos trifosfatados (dNTPs): desoxiadenosina-trifosfato

(dATP), dGTP, dCTP e dTTP
• Íons Mg2+
• DNA unifilamentar pré-existente, para servir como molde
• Uma extremidade 3’-OH de uma cadeia de DNA pré-existente para realizar a
ligação fosfodiéster (3’-OH livre) → iniciador (primer)
 DNA polimerase I

 Atividade polimerase 5’  3’
A síntese ocorre sempre no
 Catalisa o crescimento da cadeia sentido 5’ 3’

Desoxinucleotídeo
incorporado

Cadeia de DNA
crescente

Cadeia de DNA
molde

Desoxirribose
A replicação do DNA é muito precisa

Ocorre um erro a cada bilhões de

nucleotídeos adicionados, ou seja,
ocorre um erro a cada 10.000
replicações do DNA de uma
bactéria.
Contribuição geométrica dos pares de bases para a
fidelidade da replicação do DNA

Pareamento incorreto :

• Geometria diferente

• Não acomoda-se no sítio

ativo da DNA polimerase
O problema da iniciação

Primase (iniciase): sintetiza oligonucleotídeo

(primers de 10 a 60 nt) de RNA, fornecendo a
extremidade 3’-OH livre para a DNA pol I.
 DNA polimerase I – outras atividades

 Atividade exonuclease 5’  3’  Atividade exonuclease 3’  5’

 Degrada a fita DNA  Remove bases mal pareadas
 remove blocos de nucleotídeos (~ 20 nt)  extremidade 3’OH da fita nova

Substituição dos primer de RNA por DNA

Reparo do DNA
 Atividade exonuclease 3’  5’
Sítio ativo da atividade polimerase
Sítio ativo da atividade
resente nas DNAs polimerases exonucleásica 3’5’

Forma rara da C
pareia-se com A

C na forma rara volta para a forma

normal – pareamento inadequado

Bloqueio da duplicação
Pareamento errôneo localizado no
sítio da atividade exonucleásica

O nucleotídeo mal
pareado é removido

DNA pol reassume a

atividade polimerase
 A atividade exonucleásica (5’3’) da DNA polimerase I é
responsável pela eliminação de fragmentos de RNA e no reparo de
DNA
A estrutura da DNA polimerase III
 A replicação do DNA requer muitas
enzimas e fatores protéicos

• Helicases;
• Topoisomerases;
• Proteínas de ligação ao DNA (SSB);
• Iniciases;
• DNA Polimerases;
• DNA Ligases;

O complexo inteiro é denominado de sistema da DNA replicase

ou replissomo.
A replicação do DNA prossegue em etapas

• Iniciação

• Alongamento

• Terminação
 Iniciação

O Início da replicação ocorre em regiões

conservadas do DNA
Iniciação
Iniciação
Alongamento
 Término da replicação do DNA
Procariotos – DNA circular

Fita líder

 Eucariotos – DNA linear

 Seqüências de nucleotídeos específicas no final dos cromossomos

(telômeros)

 Encurtamento do telômero a cada divisão?? humanos de 50 – 150

pb por divisão
 O problema da duplicação no final da fita do DNA

Problema da duplicação no final da fita do DNA: Complexo 36

chamado de telomerase
 Telomerase
•Tamanho do telômero e
envelhecimento em humanos:
distúrbios chamados progerias
(envelhecimento prematuro),
como Síndrome de Werner e
Síndrome Hutchinson-Gilford
(HGPS)
Células somáticas
com telômero curto •Estimativa de vida: 14 –
16 anos

•Incidência: 1 em
8.000.000
37
 Reparo do DNA
 As Mutações são induzidas por diferentes agentes (agentes
químicos/Físicos);

 As mutações estão ligadas ao câncer e ao envelhecimento;

 Mutação pode ser definida como qualquer alteração

permanente na sequencia de nucleotídeos do DNA;

Mutações: inserção, deleção, substituição;

 Por que é tão importante para a célula corrigir qualquer erro no

DNA?

 Se o mesmo erro fosse em uma molécula de RNA haveria o

mesmo problema?
Mutações
Conceito:

•Mudanças permanentes na sequência de nucleotídeos do DNA.

PODENDO OCASIONAR

MUDANÇA DA FUNÇÃO DO PRODUTO PERDA DA FUNÇÃO DO

GÊNICO (Perda de atividade) PRODUTO GÊNICO
(Inibição da síntese)
Mutações: somáticas X germinativas ou gaméticas

MUTAÇÃO

EM CÉLULAS REPRODUTIVAS (ÓVULOS OU EM CÉLULAS NÃO REPRODUTIVAS (CÉLULAS

ESPERMATOZÓIDE) SOMÁTICAS – PELE OU ORGÃOS )

DEFEITOS AO NASCIMENTO MORTE CELULAR OUTRAS ENFERMIDADES

DOENÇAS GENÉTICAS, ABORTO CÂNCER

Podem ser transmitidas à prole Não são transmitidas à prole

40
Mutações: tipos

Tipos diferentes de mutação

Mutações gênicas ou de ponto – alteração de uma ou poucas bases;

alteram a função de um gene isolado

41
• Adição ou Inserção
• Perda ou Deleção
Distúrbios monogênicos
• Troca ou Substituição

Mutações cromossômicas - envolvem alterações de grandes trechos de

DNA

Numéricas: Variações do número de cromossomos – aneuploidias

Aberrações ou anomalias cromossômicas

O Código Genético é Degenerado

42
Mutações: significado
Anemia falciforme

Mutações em um gene
Mutação de sentido trocado (missense): quando
a substituição de base ocasiona a troca de um
aminoácido

• Mutação ocorre em apenas um nucleotídeo do códon (GAG GTG, ácido

glutâmico  Valina);

• Causa deficiência no transporte de gases pelas hemácias;

• Hemácias têm o tempo de vida menor, causando assim anemia;

• Sintomas: fadiga, fraqueza, palidez, etc;

• Tratamento: transfusões, transplante de medula óssea; 43

Mutações: etiologia

• Espontâneas

• Induzidas

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- Exposição a fatores ambientais

Agentes físicos: radiações ionizantes

Agentes químico: carcinógenos químicos (Cigarro)

Mutações espontâneas
a) Lesões Espontânea
Depurinação espontânea do DNA

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Mutações espontâneas
Desaminação espontânea da citosina e 5-metilcitosina

46
 Mutação Induzida: luz ultravioleta (UV)

Dímeros de Timina Fotoproduto 6-4

•Principal efeito mutagênico: formação de ligações entre duas moléculas adjacentes
47
de timina
• Principal causador de câncer de pele
Mecanismos de Reparo do DNA

Objetivo: Manter a integridade do DNA

48
Resposta envolve uma variedade de proteínas e complexos enzimáticos
– percorrem o DNA à procura de danos;

Estima-se
que menos de 1 em um milhão de lesões no DNA torna-se
uma mutação;
 Mecanismos de Reparo do DNA

 Reparo por despareamento

 Reparo por excisão de bases

 Reparo por excisão de nucleotídeos

49  Reparo direto
Reparo por despareamento

Sítio ativo da atividade polimerase

Sítio ativo da atividade exonucleásica 3’5’

50
Dam metilase – adenina (5’)GATC

51
 Reparo por excisão de bases
- Lesões causadas por desaminação
da citosina;

52
 Reparo por excisão de nucleotídeos
- Remove lesões maiores, como dímeros de timina, que distorcem a dupla
hélice;

53
Agentes físicos : luz ultravioleta (UV) e radiação ionizante

 Xerodermia pigmentosa: falta da endonuclease que remove os

dímeros de timina.

 Exposição ao sol: aparecimento anormal de mortes celulares e

aumento de câncer de pele.

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 Reparo Direto
 Corrigem os nucleotídeos alterados no local, sem a necessidade de troca.
Exemplo: DNA fotoliase

55
Recombinação Genética

57
Mecanismos de reparo do DNA
RECOMBINAÇÃO GENÉTICA

 Rearranjo da informação genética dentro ou entre moléculas de DNA diferentes.

Funções:
 Sistemas de reparo especializados do DNA;

58
 Regulação da expressão de certos genes;
 Variabilidade Genética.

TRÊS CLASSES DE RECOMBINAÇÃO

Homóloga ou geral – troca entre qualquer par de sequências homólogas.

Sítio-específicas – troca de 2 sequências específicas, mas não homólogas.
Transposição – realizada por elementos móveis (transposons).
 RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA
Meiose
Formação dos gametas

59
PROFASE I
Alinhamento dos cromossomos homólogos

Principal Função: Aumentar a Variabilidade Genética

 Elementos Transponíveis ou de Transposição

São segmentos de DNA que possuem a notável propriedade de mudar de posição dentro do
genoma, podendo mover-se de um ponto a outro do mesmo cromossomo, mudar de cromossomo
ou, eventualmente, transpor-se do genoma de uma espécie para outra.

- Esse evento é fonte de variabilidade genética;

- Evento raro;

- Inserção em pontos aleatórios (pode modificar a estrutura e a expressão do

gene): câncer, doenças hereditárias

Recombinação entre segmentos gênicos durante a

diferenciação de linfócitos B permite aumentar 60

significativamente a variabilidade
Mutagênese Sítio Dirigida

Definição: Conjunto de técnicas usadas para gerar

mutantes por meio da alteração precisa de determinados
pares de base em uma sequência de DNA;

Principais objetivos:

Realizar o mapeamento detalhado da importância que

cada aminoácido na função de uma proteína;

Alterar
61
as propriedades bioquímicas de uma proteína
com o intuito de usá-la em processos biotecnológicos;
Mutagênese Sítio Dirigida: Técnica

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 Conclusões
 O DNA é responsável por armazenar e transmitir todas as informações
de uma célula;
 ODNA é constituído de 4 nucleotídios (Adenina, Timina, Citosina e
Guanina) unidos através de ligações do tipo fosfodiéster;
 O DNA é uma dupla hélice e as fitas são complementares e
antiparalelas;
 A duplicação do DNA é semiconservativa e semi-descontínua e
dividida em 3 etapas distintas (iniciação, alongamento e terminação);
 As mutações são modificações permanentes no DNA e podem ter
origens espontâneas ou induzidas;
 As células reparam estas mutações através de 4 principais tipos de
mecanismos (Reparo por despareamento, excisão de base ou
nucleotideo e repado direto);
 O DNA pode sofrer diferentes tipos de rearranjos, que são
responsáveis por mecanismos de variabilidade genética entreoutras
funções;
 Com a técnica de Mutagênese sítio dirigida podemos modificar a
função das proteínas.
Teste de Paternidade