REPLICAÇÃO DO

DNA

Prof. Lenaldo Muniz

Propriedades do Material
Genético

1. Armazenar a informação

2. Permitir a replicação fiel

3. Ser capaz de mudar

Watson e Crick (1953)
Watson e Crick (1953)

34
 Ácidos Nucléicos
No DNA encontram-se as bases
nitrogenadas adenina, guanina, timina e
citosina.

Adenina (A) Guanina (G) Timina (T) Citosina Uracila (U)

(C)

Purinas Pirimidinas
Compactação do DNA

Vary in length between 20 to 100 bp,

depending on species and cell type
Diameter of the
nucleosome
Play a role in the
organization and compaction
of the chromosome
Euchromatin
 Cromatina

DNA + Proteínas histonas e não-histonas

• Eucromatina
cromatina menos condensada. Geralmente contém a maior parte
dos genes ativos.

• Heterocromatina
Cromatina bastante condensada. Geralmente ocorre em regiões
pouco ativas do genoma, como centrômeros e telômeros

1. Constitutiva
2. Facultativa
Replicação
do DNA
O mecanismo de
replicação está
baseado no
pareamento das
bases da dupla
hélice do DNA.
A estrutura do
DNA contém a
informação
necessária para
perpetuar sua
seqüência de
bases
Meselson e Stahl (1958)
A replicação do DNA é semi-conservativa

Cultivo em meio Experimento realizado

15
NH4Cl
por Meselson & Stahl
em 1958

Cultivo em meio
NH4Cl
14

Purificação do DNA
seguida de
centrifugação em
gradiente de CsCl
A replicação e E. coli tem uma origem apenas

 Autoradiografias feitas por J. Cairns

(1963) em DNA de E. coli tratadas com
meio contendo Trimidina comprovaram
que a replicação é semi-conservativa,
bidirecional e que o DNA e circular
Nos eucariotos são abertos várias "bolhas de replicação" ou replicons

06_09_Replic.forks.jpg
 PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS COM A
REPLICAÇÃO DO DNA)

1. DNA Polimerases
2. Endonucleases
3. Helicases
4. Topoisomerases
5. Primases
6. Telomerases
 DNA polimerase I = Replicação e reparo
 DNA polimerase II = Reparo
 DNA polimerase III = REPLICAÇÃO
 DNA polimerase IV = Reparo
 DNA polimerase V = Reparo
 DNA POLIMERASE

• São incapazes de quebrar as pontes de

hidrogênio que ligam as duas fitas do DNA

• Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-

existente

• Catalisam a adição de um nucleotídeo no

radical hidroxil da extremidade 3’ da cadeia
que está se formando. Desta forma, as fitas só
podem crescer no sentido 5’ 3’
Schematic 1
MECANISMO DA REPLICAÇÃO
Adição de nucleotídeos pela DNA
polimerase
1

3
 Adição de nucleotídeos pela DNA
polimerase

Primer ou iniciador

Molde
 OUTRAS ENZIMAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE
REPLICAÇÃO

HELICASES – constituem uma classe de enzimas que podem

se mover ao longo da fita dupla de DNA utilizando a energia
da hidrólise de ATP para separar as duas fitas da molécula.

SSB (“single-strand-binding”) – ligam-se a cada uma das fitas

impedindo o reanelamento das mesmas.

PRIMASE – RNA polimerase que sintetiza pequenas moléculas

de RNA utilizadas como iniciadores durante o processo de
replicação do DNA.

TOPOISOMERASES – Responsáveis por aliviar a torção na

parte da fita que não está sendo replicada.
 PROCESSO DE REPLICAÇÃO

O movimento da forquilha de replicação revela uma

fita molde no sentido 3’ 5’ e outra no sentido
oposto 5’ 3’

Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em

sentidos opostos

FITA LIDER – crescimento segue

a direção do movimento da
forquilha de replicação
FITA RETARDADA – crescimento
no sentido oposto ao movimento
da forquilha de replicação
 PROCESSO DE REPLICAÇÃO

FITA LIDER – sintetizada continuadamente a partir de um

iniciador na fita molde 3’ 5’
FITA RETARDADA – sintetizada descontinuamente a partir
de múltiplos iniciadores
• Sítios descobertos no molde da fita retardada são
copiados em pequenos iniciadores de RNA pela primase.
• Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando
na formação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI.
•DNA polimerase remove o primer do RNA do fragmento
adjacente e preenche os “gaps” entre os fragmentos que,
então, são unidos pela DNA ligase.
O PROCESSO DE REPLICAÇÃO
Detalhes da forquilha de replicação
Passo a passo da replicação
DNA polimerase I:
exonuclease 5’3’ e polimerase
5’3’
Uma visão geral da enzimologia
do processo
 A fidelidade da replicação

Em E. coli:

1 erro a cada 109 ou 1010 nucleotídeos adicionados

cromossomo ~ 4,6 x 106 pb  1 erro a cada 1.000

ou 10.000 replicações

atividade exonuclease 5’3’ das DNA polimerases

 TELOMERASE

• Os cromossomos de eucariotos são lineares e

apresentam seqüências repetitivas em suas extremidades
denominadas telômeros

• A síntese da fita “leading” continua até o término da fita

molde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade
feita pela primase na fita “lagging” não é digerida.

• Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempo

diminuindo, assim, o tamanho do cromossomo.

• Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.

TELOMERASE
 PCR

PCR=Polymerase Chain Reaction

OU
Reação em cadeia da Polimerase

Técnica de biologia molecular empregada

para obter-se amplificação exponencial de
pequenas quantidades de DNA in vitro,
empregando
elementos do processo natural de replicação
do DNA.
Princípio
 Os primers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por
complementaridade ao início da seqüência de DNA que se quer multiplicar.
 Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas
diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de
dois tipos de primers diferentes.
 ETAPAS
O processo exige a utilização de "primers“, que isolam o segmento a ser
amplificado e da enzima DNA Polimerase.
Ocorre em 3 etapas:

 A desnaturação da dupla fita do DNA, em alta temperatura – 94°C a 96°C.

 O pareamento dos "primers", a baixa temperatura – 37ºC – 65ºC.

 A duplicação do segmento isolado através da reação da DNA polimerase -

72°C.
Esquema demonstrando as etapas do PCR
 Podemos ver inicialmente a dupla-fita de DNA, e as três etapas envolvidas
desnaturação (1°), anelamento (2°) e síntese (3°).
Conseqüências

 Estas etapas correspondem a um ciclo. Em um processo de amplificação são

necessários diversos ciclos, que resultam num aumento exponencial do
número de segmentos replicados.

 Na prática, 20 a 30 ciclos são requeridos para uma amplificação, com os

produtos de cada ciclo servindo como molde para o próximo.

 Um ciclo requer algo em torno de 5 minutos, e o procedimento inteiro pode

ser facilmente automatizado.

 Com a PCR, uma única cópia de um gene pode ser detectada após a
amplificação, desde que os primers possam ser sintetizados
correspondentemente a seqüências conhecidas do gene.
Esquema demonstrando o aumento exponencial do nº
de moléculas durante a PCR
 Aplicações da técnica
 É importante para o dianóstico de doenças hereditárias e
doenças infecciosas.
 Utilização na Medicina Forense.

 Detecção de polimorfismos e mutações patológicas.

 Tem grande aplicação em estudos de evolução

 É muito utilizada para estudos na área de sistemática de

plantas.