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BRASILEIRA ISO
7932
Primeira edição
12.01.2016
30 °C
Número de referência
ABNT NBR ISO 7932:2016
14 páginas
© ISO 2004
Todos os direitos reservados. A menos que especificado de outro modo, nenhuma parte desta publicação pode ser
reproduzida ou utilizada por qualquer meio, eletrônico ou mecânico, incluindo fotocópia e microfilme, sem permissão por
escrito da ABNT, único representante da ISO no território brasileiro.
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Sumário Página
Prefácio Nacional.................................................................................................................................v
0 Introdução...........................................................................................................................vi
1 Escopo.................................................................................................................................1
2 Referências normativas......................................................................................................1
3 Termo e definição................................................................................................................2
4 Princípio...............................................................................................................................2
5 Diluente, meios de cultura e reagentes.............................................................................2
5.1 Diluentes..............................................................................................................................2
5.2 Meio ágar (ver [1])................................................................................................................2
5.2.1 Meio base.............................................................................................................................2
5.2.2 Solução de polimixina B.....................................................................................................3
5.2.3 Emulsão de gema de ovo...................................................................................................3
5.2.4 Meio completo (ágar MYP).................................................................................................3
5.2.5 Preparação das placas de ágar..........................................................................................4
5.2.6 Testes de desempenho.......................................................................................................4
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Tabelas
Tabela 1 – Resultado de ensaios........................................................................................................7
Tabela A.1............................................................................................................................................10
Tabela B.1 – Resultados da análise dos dados obtidos com amostras de batata desidratada.. 11
Tabela B.2 – Resultados de análise dos dados obtidos com amostras de carne moída............12
Tabela B.3 – Resultados de análise dos dados obtidos com amostras de queijo fresco...........12
Tabela B.4 – Resultado de análise dos dados obtidos com material de referência....................13
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Prefácio Nacional
Os Documentos Técnicos ABNT são elaborados conforme as regras da Diretiva ABNT, Parte 2.
A ABNT chama a atenção para que, apesar de ter sido solicitada manifestação sobre eventuais
direitos de patentes durante a Consulta Nacional, estes podem ocorrer e devem ser comunicados
à ABNT a qualquer momento (Lei nº 9.279, de 14 de maio de 1996).
Ressalta-se que Normas Brasileiras podem ser objeto de citação em Regulamentos Técnicos.
Nestes casos, os Órgãos responsáveis pelos Regulamentos Técnicos podem determinar outras datas
para exigência dos requisitos desta Norma.
A ABNT NBR ISO 7932 foi elaborada pela Comissão de Estudo Especial de Microbiologia
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Esta Norma é uma adoção idêntica, em conteúdo técnico, estrutura e redação, à ISO 7932:2004,
que foi elaborada pelo Technical Committee Food products (ISO/TC 34), Subcommittee Microbiology
(SC 9), conforme ISO/IEC Guide 21-1:2005.
Scope
This Standard specifies a horizontal method for the enumeration of viable presumptive Bacillus cereus
by means of the colony-count technique at 30 °C. It is applicable to
—— products intended for human consumption and the feeding of animals, and
NOTE In order to have a practicable test method, the confirmatory stage has been restricted to the typical
aspect on MYP agar and the haemolysis test. Thus the term “presumptive” has been introduced in order
to acknowledge the fact that the confirmatory stage does not enable the distinction of B. cereus from other
closely related but less commonly encountered Bacillus species, such as B. anthracis, B. thuringiensis,
B. weihenstephanensis, B. mycoides. An additional motility test may help to differentiate B. cereus from
B. anthracis in cases where the presence of the latter is suspected.
0 Introdução
0.1 Esta Norma destina-se a fornecer orientações gerais para a análise microbiológica de produtos
alimentícios que não sejam tratados pelas normas internacionais existentes e nem levados em conta
pelas organizações que preparam métodos de ensaio microbiológicos para alimentos para consumo
humano e animal. Devido à grande variedade de produtos dentro deste campo de aplicação, estas
orientações podem não ser adequadas em todos os pormenores, para certos produtos e para alguns
dos outros produtos, pode ser necessária a utilização de métodos diferentes. No entanto, espera-se
que em todos os casos sejam realizados esforços para aplicar as orientações fornecidas na medida
do possível e que as alterações a partir delas sejam feitas somente se for absolutamente necessário
por razões técnicas.
Quando esta Norma for analisada criticamente, serão consideradas todas as informações disponíveis
em relação a extensão da aplicação destas orientações e as razões para as alterações destas, para
produtos específicos.
Não é possível harmonização de métodos de ensaio imediata e, para certos grupos de produtos,
podem existir normas internacionais e/ou normas nacionais que não atendam a estas orientações.
Nos casos em que já existam normas internacionais para o produto a ser ensaiado, convém que elas
sejam seguidas, mas espera-se que quando essas normas forem analisadas criticamente que sejam
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feitas alterações para atender a esta Norma para que, eventualmente, os únicos desvios restantes
destas orientações sejam aqueles necessários por razões técnicas bem estabelecidas.
0.2 Verifica-se que os esporos de muitos, se não da maioria, das cepas de B. cereus germinam
facilmente sobre a superfície dos meios de cultura utilizados para a enumeração. Na maioria dos
casos, não parece ser necessário o tratamento de choque térmico para provocar a germinação.
Às vezes, um procedimento de choque térmico é desejável, por exemplo, para a contagem de esporos
ou para inibir o crescimento de células bacterianas vegetativas. Nestes casos, é recomendado um
tratamento durante 10 min a 80 °C.
1 Escopo
Esta Norma especifica um método horizontal para a enumeração presuntiva de Bacillus cereus viáveis
por meio da técnica de contagem de colônia a 30 °C. É aplicável a:
NOTA A fim de ter um método de ensaio executável, a fase de confirmação foi restrita ao aspecto
típico em ágar MYP e ensaio de hemólise. Assim, o termo “presuntivo” foi introduzido, a fim de reconhecer
o fato de que a fase de confirmação não permite a distinção de B. cereus, a partir de outras espécies
estritamente relacionadas, porém menos comumente encontradas, como B. anthracis, B. thuringiensis, B .
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2 Referências normativas
Os documentos relacionados a seguir são indispensáveis à aplicação deste documento.
Para referências datadas, aplicam-se somente as edições citadas. Para referências não datadas,
aplicam-se as edições mais recentes do referido documento (incluindo emendas).
ISO 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs – General rules for microbiological
examinations, and Amd.1:2001
NOTA BRASILEIRA Esta Norma foi revisada e uma nova edição publicada em 2007. Esta edição foi
alterada pela Emenda 1:2013.
ISO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and
production of culture media – Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
NOTA BRASILEIRA Esta Norma foi revisada e uma nova edição publicada como ISO 11133:2014,
Microbiology of food, animal feed and water – Preparation, production, storage and performance testing of
culture media.
3 Termo e definição
Para os efeitos deste documento, aplica-se o seguinte termo e definição.
3.1
Bacillus cereus presuntivo
microrganismo que forma colônias típicas na superfície de um meio de cultura seletivo e que dá uma
reação positiva confirmatória nas condições especificadas nesta Norma
4 Princípio
4.1 Uma quantidade especificada da amostra de ensaio se o produto inicial for um líquido, ou uma
quantidade especificada de uma suspensão inicial no caso de outros produtos, é plaqueada em super-
fície em meio de cultura sólido seletivo contido em placas de Petri.
Outras placas são preparadas sob as mesmas condições, usando diluições decimais da amostra
de ensaio ou da suspensão inicial.
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4.3 O número de B. cereus por grama ou por mililitro de amostra é calculado a partir do número
de colônias em placas confirmadas obtido na diluição escolhida de modo a dar um resultado signifi-
cativo, e confirmado de acordo com o ensaio especificado.
NOTA Reagentes comercialmente preparados prontos para uso podem ser utilizados.
5.1 Diluentes
Ver ABNT NBR ISO 6887-1 e qualquer norma específica sobre o produto a ser analisado.
5.2.1.1 Composição
5.2.1.2 Preparação
Ajustar o pH, se necessário, de modo a que o pH do meio completo (5.2.4), depois da esterilização,
seja 7,2 ± 0,2 a 25 °C.
5.2.2.1 Composição
5.2.2.2 Preparação
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Usar ovos de galinha frescos com suas cascas intactas. Lavar os ovos com detergente líquido
utilizando uma escova. Enxaguar com água corrente, mergulhar em etanol 95 % (por volume) durante
30 s e secar. Utilizando procedimentos assépticos, quebrar cada ovo e separar a gema da clara,
transferindo a gema repetidamente de uma metade da casca do ovo para a outra. Colocar as gemas
em uma proveta graduada estéril e adicionar quatro partes em volume de água estéril. Transferir
assepticamente em um frasco estéril e misturar vigorosamente.
5.2.4.1 Composição
5.2.4.2 Preparação
Verter porções de 15 mL a 20 mL de meio completo (5.2.4) em placas de Petri estéreis (6.6) e deixar
solidificar.
As placas podem ser armazenadas antes da secagem entre 5 °C ± 3 °C durante até 4 dias.
5.3.1.1 Composição
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5.3.1.2 Preparação
Ajustar o pH, se necessário, de modo que após a esterilização, seja 7,0 ± 0,2 a 25 °C.
5.3.2.1.1 Composição
5.3.2.1.2 Preparação
Após resfriamento a 44 °C a 47 °C, adicionar ao meio base (5.3.1) o sangue de carneiro desfibrinado.
Misturar.
Verter pelo menos porções de 12 mL do meio completo em placas de Petri estéreis (6.6) e deixar
solidificar.
6 Aparelhagem e vidrarias
NOTA Aparelhos descartáveis são uma alternativa aceitável para vidrarias reutilizáveis, se tiverem
especificações semelhantes.
6.2 Cabine de secagem ou incubadora, ventilada por convecção, para secar as placas de ágar,
capazes de operar entre 37 °C ± 1 °C e 55 °C ± 1 °C.
6.6 Placas de Petri, de vidro ou de plástico de diâmetro de 90 mm a 100 mm, ou, se necessário,
de 140 mm.
6.7 Pipetas graduadas, calibradas para uso bacteriológico somente, de capacidades nominais
de 10 mL e 1 mL, respectivamente graduadas em divisões de 0,5 mL e 0,1 mL, e com uma abertura
de escoamento de diâmetro nominal de 2 mm a 3 mm.
6.8 Alças (tipo bastão de hóquei), de vidro ou de plástico, haste de diâmetro de aproximadamente
3,5 mm e comprimento de 20 cm, dobrado em ângulos retos cerca de 3 cm de uma ponta; o corte final
deve ser feito delicadamente por aquecimento.
7 Amostragem
É importante que o laboratório receba uma amostra verdadeiramente representativa e que não tenha
sido danificada ou alterada durante o transporte ou armazenamento.
A amostragem não é parte do método especificado nesta Norma. Se não houver nenhuma norma
internacional específica para tratar a amostragem do produto em questão, recomenda-se que as
partes envolvidas entrem em acordo sobre este assunto.
Se não houver nenhuma norma internacional específica, recomenda-se que as partes envolvidas
entrem em acordo sobre este assunto.
9 Procedimento
9.1 Alíquota de ensaio, suspensão inicial e diluições
Ver ABNT NBR ISO 6887-1 e a norma internacional específica adequada ao produto em questão.
9.2.1 Transferir, por meio de uma pipeta esterilizada (6,7), 0,1 mL da amostra de ensaio, se o produto
for um líquido, ou da suspensão inicial, no caso de outros produtos, para cada uma das duas placas
de ágar (5,2.5). Repetir o procedimento usando outras diluições decimais, se necessário.
9.2.2 Quando, para certos produtos, for desejável para estimar baixos números de B. cereus,
os limites de detecção podem ser aumentados por um fator de 10 por análise de 1,0 mL da amostra
de ensaio, se o produto inicial for líquido, ou 1,0 mL da suspensão inicial para outros produtos. Distribuir
1 mL de inóculo ou na superfície de uma placa de Petri grande (140 mm) ou sobre a superfície de três
placas pequenas (90 mm), utilizando uma alça estéril (6.8). Em ambos os casos, preparar duplicatas,
utilizando duas placas grandes ou seis placas pequenas.
9.2.3 Espalhar cuidadosamente o inóculo tão rapidamente quanto possível ao longo da superfície
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da placa de ágar sem tocar os lados da placa com a alça (6,8). Usar uma alça recém-esterilizada
para cada placa. Deixar as placas tampadas por cerca de 15 min à temperatura ambiente para que o
inóculo seja absorvido no ágar.
9.2.4 Inverter as placas preparadas (9.2.3) e incubar durante 18 h a 24 h em uma incubadora (6.3)
regulada a 30 °C. Se colônias não estiverem claramente visíveis, incubar as placas durante mais 24 h
antes da contagem.
Após o período de incubação (9.2.4), selecionar placas, preferencialmente de duas diluições suces-
sivas, contendo menos de 150 colônias.
Contar as colônias presuntivas de B. cereus em cada placa. As colônias presuntivas são grandes,
rosas (indicando que a fermentação de manitol não ocorreu, ver Nota 1) e, geralmente rodeadas por
uma zona de precipitação (indicando a produção de lecitinase, ver Nota 2)
Se houver menos de 15 colônias típicas nas placas inoculadas com produto líquido ou na menor
diluição para outros produtos, é possível fazer uma estimativa da contagem como descrito na
Seção 10.
NOTA 2 Algumas cepas de B. cereus produzem pouca ou nenhuma lecitinase. Colônias destas cepas
não serão rodeadas por uma zona de precipitação. Convém que estas colônias sejam também submetidas
a testes de confirmação.
Se o 1 mL de inóculo for espalhado em três placas (ver 9.2.2), tratar estas placas como uma em todos
os procedimentos posteriores de contagem e confirmação.
9.4 Confirmação
Escolher cinco colônias presuntivas de cada placa selecionada como descrito em 9.3. Se houver
menos de cinco colônias na placa, usar todas as colônias presuntivas presentes. Confirmar estas
colônias, conforme especificado em 9.4.2 e 9.4.3.
Se as placas apresentarem um número excessivo de colônias e não for possível selecionar colônias
bem isoladas, estriar cinco colônias presuntivas em placas contendo meio completo (5.2.4). Incubar
(6.3) a 30 °C por 18 h a 24 h.
Selecionar de cada placa pelo menos uma colônia rosa bem isolada. Confirmar esta colônia, conforme
especificado em 9.4.2 e 9.4.3.
Estriar, inocular em picada ou na superfície do ágar sangue de carneiro (5.3) as colônias selecio-
nadas (9.4.1) de forma que permita uma boa interpretação da reação de hemólise.
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Ver Tabela 1.
Resultado de confirmação de
Ensaio
Bacillus cereus presuntivo
Formação de colônias rosas rodeadas por um halo
Ágar MYP (9.4.1)
opaco de precipitação (ver Nota 1 em 9.3)
Hemólise (9.4.2) Reação positiva a
a O diâmetro da zona de hemólise pode variar.
—— menor que 1/d microrganismo por grama (outros produtos), em que d representa o fator
de diluição da suspensão inicial.
10.3 Precisão
Detalhes do ensaio interlaboratorial de precisão do método são publicados (ver [7] e [8]) e são resu-
midos no Anexo B. Limites de repetibilidade e reprodutibilidade foram determinados usando três tipos
de alimentos com níveis de contaminação diversos e materiais de referência. Os valores resultantes
dos ensaios interlaboratoriais podem não ser aplicáveis às faixas de concentração e outras matrizes
que não sejam as estabelecidas.
Como uma indicação geral de limite de repetibilidade (r), os seguintes valores podem ser utilizados
quando se analisa amostras de alimentos em geral:
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Para materiais de referência (ver [4]), podem ser utilizados os seguintes valores:
EXEMPLO Foi observado um primeiro resultado de ensaio de 10 000 ou 1,0 × 104 B. cereus por grama
de alimento. Sob condições de repetibilidade, convém que a proporção entre o primeiro e o segundo resultado
do ensaio não seja maior que 2,0. Assim, convém que o segundo resultado esteja entre 5 000 (= 10 000 / 2,0)
e 20 000 (10 000 × 2,0) B. cereus por grama.
A diferença absoluta entre dois resultados individuais (transformados em log10) de ensaio (número
de B. cereus por grama ou por mililitro) ou a razão entre o maior e o menor resultado de dois ensaios
em uma escala normal, obtidos usando o mesmo método em materiais de ensaio idênticos, em dife-
rentes laboratórios e diferentes analistas, utilizando diferentes equipamentos, não vai exceder o limite
de reprodutibilidade R em mais de 5 % dos casos.
Como uma indicação geral de limite de reprodutibilidade (R), os seguintes valores podem ser utilizados
quando se analisa amostras de alimentos em geral:
Para materiais de referência (ver [4]), podem ser utilizados os seguintes valores:
EXEMPLO 1 Foi observado um primeiro resultado de ensaio de 10 000 ou 1,0 × 104 B. cereus por grama
de alimento a partir do primeiro laboratório. Sob condições de reprodutibilidade, convém que a proporção
entre o primeiro e segundo resultado do ensaio não seja maior que 2,6. Assim, convém que o segundo
resultado esteja entre 3 800 (= 10 000 / 2,6) e 26 000 (10 000 × 2,6) B. cereus por grama.
EXEMPLO 2 Um laboratório deseja saber o nível máximo que ainda está em conformidade com um limite
preestabelecido (por exemplo, um limite de 100 000 ou log10 5). Para isso, o valor de R (na escala log) tem
de ser multiplicado pelo fator 0,59. Este valor é de 0,25 (0,42 × 0,59) como a diferença entre os resultados
do ensaio transformados em log10 ou 1,78 (100,25) como a razão entre os resultados do ensaio. Assim,
resultados até log10 5,25 (log10 5 + log10 0,25) ou 178 000 (100 000 × 1,78) não indicam o não cumprimento
do limite. O fator 0,59 equivale a um teste unilateral com um intervalo de 95 % de confiança que é utilizado
para verificar se o limite foi excedido. O fator 0,59 é obtido a partir da seguinte fórmula:
1, 64
0, 59 =
1, 96 × 2
11 Relatório de ensaio
O relatório de ensaio deve especificar:
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e) todas as condições operacionais não especificadas nesta Norma, ou consideradas opcionais,
juntamente com detalhes de quaisquer incidentes que possam ter influenciado o(s) resultado(s)
de ensaio;
f) o(s) resultado(s) do ensaio obtido, ou, se a repetibilidade foi verificada, o resultado final citado
obtido.
Anexo A
(normativo)
Os limites de confiança com o nível de 95 % para estimar baixas contagens, quando o número de colô-
nias em placas selecionadas for menor que 15, são dadas na Tabela A.1.
Tabela A.1
3 <1 5
4 1 6
5 2 9
6 2 10
7 2 12
8 3 13
9 4 14
10 4 16
11 5 18
12 6 19
13 7 20
14 7 21
15 8 23
Anexo B
(informativo)
Em conformidade com a ISO 5725-1:1994[5], os seguintes parâmetros foram calculados para se obter
os dados relativos à precisão mostrados nas Tabelas B1 a B4.
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Tabela B.1 – Resultados da análise dos dados obtidos com amostras de batata desidratada
Número de amostras 2 2 2
Número de laboratórios remanescentes após a 18 18 18
eliminação dos valores aberrantes (outliers)
Número de valores aberrantes (outliers) 0 0 0
Número de amostras aceitas 36 35 36
Valor médio ∑a (log10 ufc/g) 3,3 4,7 6,1
Desvio-padrão da repetibilidade sr (log10 ufc/g) 0,09 0,05 0,10
Desvio-padrão relativo da repetibilidade (%) 2,63 1,16 1,60
Limite de repetibilidade r:
como diferença na escala log10 (log10 ufc/g) 0,24 0,15 0,27
como razão na escala normal (ufc/g) 1,7 1,4 1,9
Desvio-padrão da reprodutibilidade sR (log10 ufc/g) 0,11 0,09 0,10
Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (%) 3,24 1,98 1,71
Limite da reprodutibilidade R:
como diferença na escala log10 (log10 ufc/g) 0,30 0,26 0,29
como razão na escala normal (ufc/g) 2,0 1,8 2,0
Tabela B.2 – Resultados de análise dos dados obtidos com amostras de carne moída
Tabela B.3 – Resultados de análise dos dados obtidos com amostras de queijo fresco
Amostra (nível de contaminação)
Parâmetros Queijo fresco Queijo fresco Queijo fresco
(nível baixo) (nível médio) (nível alto)
Número de amostras 2 2 2
Número de laboratórios remanescentes após a 12 12 12
eliminação dos valores aberrantes (outliers)
Número de valores aberrantes (outliers) 0 0 0
Número de amostras aceitas 23 23 23
Valores médios ∑a (log10 ufc/g) 3,4 4,1 6,2
Desvio-padrão da repetibilidade sr (log10 ufc/g) 0,05 0,06 0,12
Desvio-padrão relativo da repetibilidade (%) 1,50 1,57 1,95
Limite da repetibilidade r:
como diferença em escala log10 (log10 ufc/g) 0,14 0,18 0,33
como razão na escala normal (ufc/g) 1,4 1,5 2,2
Desvio-padrão da reprodutibilidade sR (log10 ufc/g) 0,08 0,10 0,17
Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (%) 2,28 2,38 2,78
Limite da reprodutibilidade R:
como diferença na escala log10 (log10 ufc/g) 0,22 0,27 0,48
como razão na escala normal (ufc/g) 1,6 1,9 3,0
Tabela B.4 – Resultado de análise dos dados obtidos com material de referência
Limite da reprodutibilidade R:
como diferença na escala log10 (log10 ufc/g) 0,23
como razão na escala normal (ufc/g) 1,7
Bibliografia
[1] MOSSEL, D.A.A., KOOPMAN, M.J. and JONGERIUS, E. Appl. Microbiol., 15, 1967, pp. 650-653
[2] CMSF. Microorganisms in foods, Vol. 1, 2nd edn., University of Toronto Press, 1978
[3] COWELL and MORISETTI J. Sci. Fd. Agric., 20, 1969, p. 573
[4] N ‘T VELD, P.H., SOENTORO, P.S.S. and NOTERMANS, S.H.W. I. J. Food Microbiol., 20, 1993,
pp. 23-36
[5] ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 1:
General principles and definitions
[6] ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results –
Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard
measurement method
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[7] SCHULTEN, S.M., VAN de LUSTGRAAF, B.E.B., NAGELKERKE, N.J.D. and IN ‘T VELD, P.H.
Report No. 286555001, National Institute of Public Health and the Environment, Bilthoven,
The Netherlands, 1998
[8] SCHULTEN, S.M., IN ‘T VELD, P.H., NAGELKERKE, N.J.D., SCOTTER, S., DE BUYSER, M.L.,
ROLLIER, P. and LAHELLEC, C. I. J. Food Microbiology, 57, 2000, pp. 53-61