ISO 7932 Método Horizontal para A Enumeração Presuntiva de Bcillus Cereus - Técnica de Contagem de Colônias A 30ºC

NORMA ABNT NBR
BRASILEIRA ISO
7932
Primeira edição
12.01.2016
Microbiologia de alimentos para consumo

humano e animal — Método horizontal para a
enumeração presuntiva de Bacillus cereus —
Técnica de contagem de colônias a 30 °C
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Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the
enumeration of presumptive Bacillus cereus — Colony-count technique at
30 °C
ICS 07.100.30 ISBN 978-85-07-06015-4
Número de referência
ABNT NBR ISO 7932:2016
14 páginas
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‌ 016
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Sumário Página
Prefácio Nacional.................................................................................................................................v
0 Introdução...........................................................................................................................vi
1 Escopo.................................................................................................................................1
2 Referências normativas......................................................................................................1
3 Termo e definição................................................................................................................2
4 Princípio...............................................................................................................................2
5 Diluente, meios de cultura e reagentes.............................................................................2
5.1 Diluentes..............................................................................................................................2
5.2 Meio ágar (ver [1])................................................................................................................2
5.2.1 Meio base.............................................................................................................................2
5.2.2 Solução de polimixina B.....................................................................................................3
5.2.3 Emulsão de gema de ovo...................................................................................................3
5.2.4 Meio completo (ágar MYP).................................................................................................3
5.2.5 Preparação das placas de ágar..........................................................................................4

5.2.6 Testes de desempenho.......................................................................................................4
5.3 Ágar sangue de carneiro....................................................................................................4
5.3.1 Meio Base: base de ágar sangue No. 2.............................................................................4
5.3.2 Sangue de carneiro desfibrinado......................................................................................4
6 Aparelhagem e vidrarias.....................................................................................................5
7 Amostragem........................................................................................................................5
8 Preparação da amostra de ensaio.....................................................................................5
9 Procedimento......................................................................................................................6
9.1 Alíquota de ensaio, suspensão inicial e diluições...........................................................6
9.2 Inoculação e incubação......................................................................................................6
9.3 Contagem das colônias......................................................................................................6
9.4 Confirmação........................................................................................................................7
9.4.1 Seleção e isolamento de colônias para confirmação......................................................7
9.4.2 Teste de hemólise em ágar sangue de carneiro...............................................................7
9.4.3 Interpretação bioquímica....................................................................................................7
10 Expressão dos resultados..................................................................................................7
10.1 Contagem de colônias presuntivas de B. cereus............................................................7
10.2 Ausência de colônias..........................................................................................................7
10.3 Precisão...............................................................................................................................8
10.3.1 Ensaio interlaboratorial......................................................................................................8
10.3.2 Limite de repetibilidade......................................................................................................8
10.3.3 Limite de reprodutibilidade................................................................................................8
11 Relatório de ensaio.............................................................................................................9
Anexo A (normativo) Limites de confiança para estimar baixas contagens de colônias............10
Anexo B (informativo) Resultados dos ensaios interlaboratoriais................................................. 11
Bibliografia..........................................................................................................................................14
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Tabelas
Tabela 1 – Resultado de ensaios........................................................................................................7
Tabela A.1............................................................................................................................................10
Tabela B.1 – Resultados da análise dos dados obtidos com amostras de batata desidratada.. 11
Tabela B.2 – Resultados de análise dos dados obtidos com amostras de carne moída............12
Tabela B.3 – Resultados de análise dos dados obtidos com amostras de queijo fresco...........12
Tabela B.4 – Resultado de análise dos dados obtidos com material de referência....................13
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Prefácio Nacional
A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Foro Nacional de Normalização.

As Normas Brasileiras, cujo conteúdo é de responsabilidade dos Comitês Brasileiros (ABNT/CB),
dos Organismos de Normalização Setorial (ABNT/ONS) e das Comissões de Estudo Especiais
(ABNT/CEE), são elaboradas por Comissões de Estudo (CE), formadas pelas partes interessadas
no tema objeto da normalização.
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A ABNT chama a atenção para que, apesar de ter sido solicitada manifestação sobre eventuais
direitos de patentes durante a Consulta Nacional, estes podem ocorrer e devem ser comunicados
à ABNT a qualquer momento (Lei nº 9.279, de 14 de maio de 1996).
Ressalta-se que Normas Brasileiras podem ser objeto de citação em Regulamentos Técnicos.
Nestes casos, os Órgãos responsáveis pelos Regulamentos Técnicos podem determinar outras datas
para exigência dos requisitos desta Norma.
A ABNT NBR ISO 7932 foi elaborada pela Comissão de Estudo Especial de Microbiologia
(ABNT/CEE-157). O Projeto circulou em Consulta Nacional conforme Edital nº 11, de 23.11.2015
a 23.12.2015.
Esta Norma é uma adoção idêntica, em conteúdo técnico, estrutura e redação, à ISO 7932:2004,
que foi elaborada pelo Technical Committee Food products (ISO/TC 34), Subcommittee Microbiology
(SC 9), conforme ISO/IEC Guide 21-1:2005.
O Escopo em inglês desta Norma Brasileira é o seguinte:
Scope
This Standard specifies a horizontal method for the enumeration of viable presumptive Bacillus cereus
by means of the colony-count technique at 30 °C. It is applicable to
—— products intended for human consumption and the feeding of animals, and
—— environmental samples in the area of food production and food handling.
NOTE In order to have a practicable test method, the confirmatory stage has been restricted to the typical
aspect on MYP agar and the haemolysis test. Thus the term “presumptive” has been introduced in order
to acknowledge the fact that the confirmatory stage does not enable the distinction of B. cereus from other
closely related but less commonly encountered Bacillus species, such as B. anthracis, B. thuringiensis,
B. weihenstephanensis, B. mycoides. An additional motility test may help to differentiate B. cereus from
B. anthracis in cases where the presence of the latter is suspected.
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0 Introdução
0.1 Esta Norma destina-se a fornecer orientações gerais para a análise microbiológica de produtos
alimentícios que não sejam tratados pelas normas internacionais existentes e nem levados em conta
pelas organizações que preparam métodos de ensaio microbiológicos para alimentos para consumo
humano e animal. Devido à grande variedade de produtos dentro deste campo de aplicação, estas
orientações podem não ser adequadas em todos os pormenores, para certos produtos e para alguns
dos outros produtos, pode ser necessária a utilização de métodos diferentes. No entanto, espera-se
que em todos os casos sejam realizados esforços para aplicar as orientações fornecidas na medida
do possível e que as alterações a partir delas sejam feitas somente se for absolutamente necessário
por razões técnicas.
Quando esta Norma for analisada criticamente, serão consideradas todas as informações disponíveis
em relação a extensão da aplicação destas orientações e as razões para as alterações destas, para
produtos específicos.
Não é possível harmonização de métodos de ensaio imediata e, para certos grupos de produtos,
podem existir normas internacionais e/ou normas nacionais que não atendam a estas orientações.
Nos casos em que já existam normas internacionais para o produto a ser ensaiado, convém que elas
sejam seguidas, mas espera-se que quando essas normas forem analisadas criticamente que sejam
feitas alterações para atender a esta Norma para que, eventualmente, os únicos desvios restantes
destas orientações sejam aqueles necessários por razões técnicas bem estabelecidas.
0.2 Verifica-se que os esporos de muitos, se não da maioria, das cepas de B. cereus germinam
facilmente sobre a superfície dos meios de cultura utilizados para a enumeração. Na maioria dos
casos, não parece ser necessário o tratamento de choque térmico para provocar a germinação.
Às vezes, um procedimento de choque térmico é desejável, por exemplo, para a contagem de esporos
ou para inibir o crescimento de células bacterianas vegetativas. Nestes casos, é recomendado um
tratamento durante 10 min a 80 °C.
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NORMA BRASILEIRA ABNT NBR ISO 7932:2016
Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal —

Método horizontal para a enumeração presuntiva de Bacillus cereus —
Técnica de contagem de colônias a 30 °C
1 Escopo
Esta Norma especifica um método horizontal para a enumeração presuntiva de Bacillus cereus viáveis
por meio da técnica de contagem de colônia a 30 °C. É aplicável a:
—— produtos destinados ao consumo humano e animal, e
—— amostras ambientais na área de produção de alimentos e manipulação de alimentos.
NOTA A fim de ter um método de ensaio executável, a fase de confirmação foi restrita ao aspecto
típico em ágar MYP e ensaio de hemólise. Assim, o termo “presuntivo” foi introduzido, a fim de reconhecer
o fato de que a fase de confirmação não permite a distinção de B. cereus, a partir de outras espécies
estritamente relacionadas, porém menos comumente encontradas, como B. anthracis, B. thuringiensis, B .

weihenstephanensis, B. mycoides. Um ensaio de motilidade adicional pode ajudar a diferenciar B. cereus
do B. anthracis nos casos em que se suspeite da presença deste último.
2 Referências normativas
Os documentos relacionados a seguir são indispensáveis à aplicação deste documento.
Para referências datadas, aplicam-se somente as edições citadas. Para referências não datadas,
aplicam-se as edições mais recentes do referido documento (incluindo emendas).
ABNT NBR ISO 6887-1:2011, Microbiologia de alimentos e de alimentação animal – Preparo de

amostras, da suspensão inicial e das diluições decimais para análise microbiológica – Parte 1: Regras
gerais para preparo da suspensão inicial e das diluições decimais
ISO 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs – General rules for microbiological
examinations, and Amd.1:2001
NOTA BRASILEIRA Esta Norma foi revisada e uma nova edição publicada em 2007. Esta edição foi
alterada pela Emenda 1:2013.
ISO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and
production of culture media – Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
NOTA BRASILEIRA Esta Norma foi revisada e uma nova edição publicada como ISO 11133:2014,
Microbiology of food, animal feed and water – Preparation, production, storage and performance testing of
culture media.
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3 Termo e definição
Para os efeitos deste documento, aplica-se o seguinte termo e definição.
3.1
Bacillus cereus presuntivo
microrganismo que forma colônias típicas na superfície de um meio de cultura seletivo e que dá uma
reação positiva confirmatória nas condições especificadas nesta Norma
NOTA Ver Nota na Seção 1.
4 Princípio
4.1 Uma quantidade especificada da amostra de ensaio se o produto inicial for um líquido, ou uma
quantidade especificada de uma suspensão inicial no caso de outros produtos, é plaqueada em super-
fície em meio de cultura sólido seletivo contido em placas de Petri.
Outras placas são preparadas sob as mesmas condições, usando diluições decimais da amostra
de ensaio ou da suspensão inicial.
4.2 As placas são incubadas sob condições aeróbicas a 30 °C durante 18 h a 48 h
4.3 O número de B. cereus por grama ou por mililitro de amostra é calculado a partir do número
de colônias em placas confirmadas obtido na diluição escolhida de modo a dar um resultado signifi-
cativo, e confirmado de acordo com o ensaio especificado.
5 Diluente, meios de cultura e reagentes

Para práticas de laboratório atual, ver ISO 7218.
NOTA Reagentes comercialmente preparados prontos para uso podem ser utilizados.
5.1 Diluentes
Ver ABNT NBR ISO 6887-1 e qualquer norma específica sobre o produto a ser analisado.
5.2 Meio ágar (ver [1])
5.2.1 Meio base
5.2.1.1 Composição
Extrato de carne bovina 1,0 g

Digestão enzimática de caseína 10,0 g
D-manitol 10,0 g
Cloreto de sódio (NaCl) 10,0 g
Vermelho de fenol 0,025 g
Ágar 12 g a 18 g a
Água 900 mL
a Dependendo da força de gelificação do ágar.
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5.2.1.2 Preparação
Dissolver os componentes ou o meio completo desidratado na água, por aquecimento, se necessário.
Ajustar o pH, se necessário, de modo a que o pH do meio completo (5.2.4), depois da esterilização,
seja 7,2 ± 0,2 a 25 °C.
Dispensar o meio em quantidades de 90 mL em frascos de capacidade apropriada.
Esterilizar durante 15 min em uma autoclave (6.1) ajustada a 121 °C.
5.2.2 Solução de polimixina B
Sulfato de polimixina B 106 UI

Água 100 mL
Dissolver o sulfato de polimixina B em água. Esterilizar por filtração.
5.2.3 Emulsão de gema de ovo
Usar ovos de galinha frescos com suas cascas intactas. Lavar os ovos com detergente líquido
utilizando uma escova. Enxaguar com água corrente, mergulhar em etanol 95 % (por volume) durante
30 s e secar. Utilizando procedimentos assépticos, quebrar cada ovo e separar a gema da clara,
transferindo a gema repetidamente de uma metade da casca do ovo para a outra. Colocar as gemas
em uma proveta graduada estéril e adicionar quatro partes em volume de água estéril. Transferir
assepticamente em um frasco estéril e misturar vigorosamente.
Aquecer a mistura durante 2 h em um banho-maria (6.4) fixado em 44 °C a 47 °C. Em seguida, deixar

em repouso 18 h a 24 h a 5 °C ± 3 °C para permitir que se forme um precipitado.
Recolher assepticamente o sobrenadante da emulsão.
A emulsão pode ser armazenada a 5 °C ± 3 °C, durante não mais do que 72 h.
5.2.4 Meio completo (ágar MYP)
Meio base (5.2.1) 90 mL

Solução de polimixina B (5.2.2) 1,0 mL
Emulsão de gema de ovo (5.2.3) 10,0 mL
Fundir o meio base e resfriar em um banho-maria (6.4) fixado em 44 °C a 47 °C.
Adicionar os outros líquidos, misturando bem após cada adição.
Resfriar o meio completo em um banho-maria (6.4) fixado em 44 °C a 47 °C.

5.2.5 Preparação das placas de ágar
Verter porções de 15 mL a 20 mL de meio completo (5.2.4) em placas de Petri estéreis (6.6) e deixar
solidificar.
As placas podem ser armazenadas antes da secagem entre 5 °C ± 3 °C durante até 4 dias.
Imediatamente antes da utilização, secar as placas, preferencialmente retirando as tampas e mantendo

estas juntamente com a superfície do ágar viradas para baixo, em uma estufa de secagem ou em uma
incubadora (6.2) regulada entre 37 °C e 55 °C até que a superfície de ágar esteja seco.
5.2.6 Testes de desempenho
Ver ISO/TS 11133-2: 2003, Anexo B.
5.3 Ágar sangue de carneiro
5.3.1 Meio Base: base de ágar sangue No. 2

Proteose peptona ou peptona equivalente 15 g

Hidrolisado de fígado 2,5 g
Extrato de levedura 5g
Cloreto de sódio (NaCl) 5g
Ágar 12 g a 18 g a
Água 1 000 mL
a Dependendo da força de gelificação do àgar.
Dissolver os componentes ou o meio completo desidratado em água por ebulição.
Ajustar o pH, se necessário, de modo que após a esterilização, seja 7,0 ± 0,2 a 25 °C.
Distribuir em frascos e esterilizar durante 15 min a 121 °C.
5.3.2 Sangue de carneiro desfibrinado
5.3.2.1 Meio completo
5.3.2.1.1 Composição
Meio base (5.3.1) 100 mL

Sangue de carneiro desfibrinado 5 mL a 7 mL
5.3.2.1.2 Preparação
Após resfriamento a 44 °C a 47 °C, adicionar ao meio base (5.3.1) o sangue de carneiro desfibrinado.
Misturar.

Verter pelo menos porções de 12 mL do meio completo em placas de Petri estéreis (6.6) e deixar
solidificar.
6 Aparelhagem e vidrarias
NOTA Aparelhos descartáveis são uma alternativa aceitável para vidrarias reutilizáveis, se tiverem
especificações semelhantes.
Equipamento usual de laboratório de microbiologia e em particular o seguinte.
6.1 Equipamento de esterilização a seco (forno) ou esterilização úmida (autoclave)
Ver ISO 7218.
6.2 Cabine de secagem ou incubadora, ventilada por convecção, para secar as placas de ágar,
capazes de operar entre 37 °C ± 1 °C e 55 °C ± 1 °C.
6.3 Incubadora, capaz de operar a 30 °C ± 1 °C.

6.4 Banhos-maria, que possam ser mantidos a 44 °C a 47 °C.
6.5 pHmetro, com uma precisão de ± 0,1 unidade de pH a 25 °C.
6.6 Placas de Petri, de vidro ou de plástico de diâmetro de 90 mm a 100 mm, ou, se necessário,
de 140 mm.
6.7 Pipetas graduadas, calibradas para uso bacteriológico somente, de capacidades nominais
de 10 mL e 1 mL, respectivamente graduadas em divisões de 0,5 mL e 0,1 mL, e com uma abertura
de escoamento de diâmetro nominal de 2 mm a 3 mm.
6.8 Alças (tipo bastão de hóquei), de vidro ou de plástico, haste de diâmetro de aproximadamente
3,5 mm e comprimento de 20 cm, dobrado em ângulos retos cerca de 3 cm de uma ponta; o corte final
deve ser feito delicadamente por aquecimento.
7 Amostragem
É importante que o laboratório receba uma amostra verdadeiramente representativa e que não tenha
sido danificada ou alterada durante o transporte ou armazenamento.
A amostragem não é parte do método especificado nesta Norma. Se não houver nenhuma norma
internacional específica para tratar a amostragem do produto em questão, recomenda-se que as
partes envolvidas entrem em acordo sobre este assunto.
8 Preparação da amostra de ensaio

Preparar a amostra de ensaio em conformidade com as normas internacionais específicas e adequadas
ao produto em questão.
Se não houver nenhuma norma internacional específica, recomenda-se que as partes envolvidas
entrem em acordo sobre este assunto.

9 Procedimento
9.1 Alíquota de ensaio, suspensão inicial e diluições
Ver ABNT NBR ISO 6887-1 e a norma internacional específica adequada ao produto em questão.
9.2 Inoculação e incubação
9.2.1 Transferir, por meio de uma pipeta esterilizada (6,7), 0,1 mL da amostra de ensaio, se o produto
for um líquido, ou da suspensão inicial, no caso de outros produtos, para cada uma das duas placas
de ágar (5,2.5). Repetir o procedimento usando outras diluições decimais, se necessário.
9.2.2 Quando, para certos produtos, for desejável para estimar baixos números de B. cereus,
os limites de detecção podem ser aumentados por um fator de 10 por análise de 1,0 mL da amostra
de ensaio, se o produto inicial for líquido, ou 1,0 mL da suspensão inicial para outros produtos. Distribuir
1 mL de inóculo ou na superfície de uma placa de Petri grande (140 mm) ou sobre a superfície de três
placas pequenas (90 mm), utilizando uma alça estéril (6.8). Em ambos os casos, preparar duplicatas,
utilizando duas placas grandes ou seis placas pequenas.
9.2.3 Espalhar cuidadosamente o inóculo tão rapidamente quanto possível ao longo da superfície
da placa de ágar sem tocar os lados da placa com a alça (6,8). Usar uma alça recém-esterilizada
para cada placa. Deixar as placas tampadas por cerca de 15 min à temperatura ambiente para que o
inóculo seja absorvido no ágar.
9.2.4 Inverter as placas preparadas (9.2.3) e incubar durante 18 h a 24 h em uma incubadora (6.3)
regulada a 30 °C. Se colônias não estiverem claramente visíveis, incubar as placas durante mais 24 h
antes da contagem.
9.3 Contagem das colônias
Após o período de incubação (9.2.4), selecionar placas, preferencialmente de duas diluições suces-
sivas, contendo menos de 150 colônias.
Contar as colônias presuntivas de B. cereus em cada placa. As colônias presuntivas são grandes,
rosas (indicando que a fermentação de manitol não ocorreu, ver Nota 1) e, geralmente rodeadas por
uma zona de precipitação (indicando a produção de lecitinase, ver Nota 2)
Se houver menos de 15 colônias típicas nas placas inoculadas com produto líquido ou na menor
diluição para outros produtos, é possível fazer uma estimativa da contagem como descrito na
Seção 10.
NOTA 1 Se as placas contiverem um número elevado de microrganismos fermentadores de manitol que

produzem ácido, então a cor rosa característica das colônias de B. cereus pode sofrer redução ou desaparecer
completamente.
NOTA 2 Algumas cepas de B. cereus produzem pouca ou nenhuma lecitinase. Colônias destas cepas
não serão rodeadas por uma zona de precipitação. Convém que estas colônias sejam também submetidas
a testes de confirmação.
Se o 1 mL de inóculo for espalhado em três placas (ver 9.2.2), tratar estas placas como uma em todos
os procedimentos posteriores de contagem e confirmação.

9.4 Confirmação
9.4.1 Seleção e isolamento de colônias para confirmação
Escolher cinco colônias presuntivas de cada placa selecionada como descrito em 9.3. Se houver
menos de cinco colônias na placa, usar todas as colônias presuntivas presentes. Confirmar estas
colônias, conforme especificado em 9.4.2 e 9.4.3.
Se as placas apresentarem um número excessivo de colônias e não for possível selecionar colônias
bem isoladas, estriar cinco colônias presuntivas em placas contendo meio completo (5.2.4). Incubar
(6.3) a 30 °C por 18 h a 24 h.
Selecionar de cada placa pelo menos uma colônia rosa bem isolada. Confirmar esta colônia, conforme
especificado em 9.4.2 e 9.4.3.
9.4.2 Teste de hemólise em ágar sangue de carneiro
Estriar, inocular em picada ou na superfície do ágar sangue de carneiro (5.3) as colônias selecio-
nadas (9.4.1) de forma que permita uma boa interpretação da reação de hemólise.
Incubar a 30 °C durante 24 h ± 2 h e interpretar a reação de hemólise.
9.4.3 Interpretação bioquímica
Ver Tabela 1.
Tabela 1 – Resultado de ensaios
Resultado de confirmação de
Ensaio
Bacillus cereus presuntivo
Formação de colônias rosas rodeadas por um halo
Ágar MYP (9.4.1)
opaco de precipitação (ver Nota 1 em 9.3)
Hemólise (9.4.2) Reação positiva a
a O diâmetro da zona de hemólise pode variar.
10 Expressão dos resultados

10.1 Contagem de colônias presuntivas de B. cereus
Ver ISO 7218:1996 / Amd.1:2001 para o cálculo.
10.2 Ausência de colônias

Se as duas placas correspondentes à amostra de ensaio (produtos líquidos) ou à suspensão inicial
(outros produtos) não contiverem colônias presuntivas de B. cereus, expressar o resultado como
a seguir:
—— menor que 1 microrganismo por mililitro (produtos líquidos);
—— menor que 1/d microrganismo por grama (outros produtos), em que d representa o fator
de diluição da suspensão inicial.

10.3 Precisão
10.3.1 Ensaio interlaboratorial
Detalhes do ensaio interlaboratorial de precisão do método são publicados (ver [7] e [8]) e são resu-
midos no Anexo B. Limites de repetibilidade e reprodutibilidade foram determinados usando três tipos
de alimentos com níveis de contaminação diversos e materiais de referência. Os valores resultantes
dos ensaios interlaboratoriais podem não ser aplicáveis às faixas de concentração e outras matrizes
que não sejam as estabelecidas.
10.3.2 Limite de repetibilidade
A diferença absoluta entre dois resultados individuais independentes (transformados em log10)

de ensaio (número de B. cereus por grama ou por mililitro) ou a razão entre o maior e o menor resultado
de dois ensaios em uma escala normal, obtidos usando o mesmo método em materiais de ensaio
idênticos, no mesmo laboratório, pelo mesmo analista, utilizando o mesmo equipamento com o menor
intervalo de tempo possível, não vai exceder o limite de repetibilidade r em mais de 5 % dos casos.
Como uma indicação geral de limite de repetibilidade (r), os seguintes valores podem ser utilizados
quando se analisa amostras de alimentos em geral:
r = 0,29 (expresso como a diferença entre os resultados do ensaio transformados em log10), ou
r = 2,0 (expresso como uma razão entre os resultados do ensaio).
Para materiais de referência (ver [4]), podem ser utilizados os seguintes valores:
r = 0,12 (expresso como a diferença entre os resultados do ensaio transformados em log10), ou
r = 1,3 (expresso como uma razão entre os resultados do ensaio).
EXEMPLO Foi observado um primeiro resultado de ensaio de 10 000 ou 1,0 × 104 B. cereus por grama
de alimento. Sob condições de repetibilidade, convém que a proporção entre o primeiro e o segundo resultado
do ensaio não seja maior que 2,0. Assim, convém que o segundo resultado esteja entre 5 000 (= 10 000 / 2,0)
e 20 000 (10 000 × 2,0) B. cereus por grama.
10.3.3 Limite de reprodutibilidade
A diferença absoluta entre dois resultados individuais (transformados em log10) de ensaio (número
de B. cereus por grama ou por mililitro) ou a razão entre o maior e o menor resultado de dois ensaios
em uma escala normal, obtidos usando o mesmo método em materiais de ensaio idênticos, em dife-
rentes laboratórios e diferentes analistas, utilizando diferentes equipamentos, não vai exceder o limite
de reprodutibilidade R em mais de 5 % dos casos.
Como uma indicação geral de limite de reprodutibilidade (R), os seguintes valores podem ser utilizados
quando se analisa amostras de alimentos em geral:
R = 0,42 (expresso como a diferença entre os resultados do ensaio transformados em log10), ou
R = 2,6 (expresso como uma razão entre os resultados do ensaio).
Para materiais de referência (ver [4]), podem ser utilizados os seguintes valores:
R = 0,23 (expresso como a diferença entre os resultados do ensaio transformados em log10), ou

R = 1,7 (expresso como uma razão entre os resultados do ensaio).
EXEMPLO 1 Foi observado um primeiro resultado de ensaio de 10 000 ou 1,0 × 104 B. cereus por grama
de alimento a partir do primeiro laboratório. Sob condições de reprodutibilidade, convém que a proporção
entre o primeiro e segundo resultado do ensaio não seja maior que 2,6. Assim, convém que o segundo
resultado esteja entre 3 800 (= 10 000 / 2,6) e 26 000 (10 000 × 2,6) B. cereus por grama.
EXEMPLO 2 Um laboratório deseja saber o nível máximo que ainda está em conformidade com um limite
preestabelecido (por exemplo, um limite de 100 000 ou log10 5). Para isso, o valor de R (na escala log) tem
de ser multiplicado pelo fator 0,59. Este valor é de 0,25 (0,42 × 0,59) como a diferença entre os resultados
do ensaio transformados em log10 ou 1,78 (100,25) como a razão entre os resultados do ensaio. Assim,
resultados até log10 5,25 (log10 5 + log10 0,25) ou 178 000 (100 000 × 1,78) não indicam o não cumprimento
do limite. O fator 0,59 equivale a um teste unilateral com um intervalo de 95 % de confiança que é utilizado
para verificar se o limite foi excedido. O fator 0,59 é obtido a partir da seguinte fórmula:
1, 64
0, 59 =
1, 96 × 2
11 Relatório de ensaio
O relatório de ensaio deve especificar:
a) todas as informações necessárias à completa identificação da amostra;
b) o método de amostragem utilizado, se conhecido;
c) o método de ensaio utilizado, com referência a esta Norma;
d) a temperatura de incubação;
e) todas as condições operacionais não especificadas nesta Norma, ou consideradas opcionais,
juntamente com detalhes de quaisquer incidentes que possam ter influenciado o(s) resultado(s)
de ensaio;
f) o(s) resultado(s) do ensaio obtido, ou, se a repetibilidade foi verificada, o resultado final citado
obtido.

Anexo A
(normativo)
Limites de confiança para estimar baixas contagens de colônias
Os limites de confiança com o nível de 95 % para estimar baixas contagens, quando o número de colô-
nias em placas selecionadas for menor que 15, são dadas na Tabela A.1.
Tabela A.1
Os limites de confiança ao nível de 95 %

Número de colônias
inferior superior
1 <1 2
2 <1 4
3 <1 5
4 1 6
5 2 9
6 2 10
7 2 12
8 3 13
9 4 14
10 4 16
11 5 18
12 6 19
13 7 20
14 7 21
15 8 23

Anexo B
(informativo)
Resultados dos ensaios interlaboratoriais
Um ensaio colaborativo internacional envolvendo 20 laboratórios em 17 países foi realizado em queijo,

carne, batata desidratada em pó e um material de referência. As amostras de alimentos foram cada uma
analisadas em três diferentes níveis de contaminação. O ensaio foi organizado em outubro de 1997
pelo National Institute of Public Health (RIVM), como parte do projeto europeu SMT4 CT-96 2098
financiado pela Comissão Europeia.
O método apresentado ao ensaio interlaboratorial foi o da ISO 7932:1993, incluindo os seguintes

ensaios confirmatórios: meio ágar MYP, meio ágar glicose, meio VP e meio nitrato.
Em conformidade com a ISO 5725-1:1994[5], os seguintes parâmetros foram calculados para se obter
os dados relativos à precisão mostrados nas Tabelas B1 a B4.
Tabela B.1 – Resultados da análise dos dados obtidos com amostras de batata desidratada
Amostra (nível de contaminação)

Batata Batata Batata
Parâmetros desidratada desidratada desidratada
em pó em pó em pó
(nível baixo) (nível médio) (nível alto)
Número de amostras 2 2 2
Número de laboratórios remanescentes após a 18 18 18
eliminação dos valores aberrantes (outliers)
Número de valores aberrantes (outliers) 0 0 0
Número de amostras aceitas 36 35 36
Valor médio ∑a (log10 ufc/g) 3,3 4,7 6,1
Desvio-padrão da repetibilidade sr (log10 ufc/g) 0,09 0,05 0,10
Desvio-padrão relativo da repetibilidade (%) 2,63 1,16 1,60
Limite de repetibilidade r:
como diferença na escala log10 (log10 ufc/g) 0,24 0,15 0,27
como razão na escala normal (ufc/g) 1,7 1,4 1,9
Desvio-padrão da reprodutibilidade sR (log10 ufc/g) 0,11 0,09 0,10
Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (%) 3,24 1,98 1,71
Limite da reprodutibilidade R:

Tabela B.2 – Resultados de análise dos dados obtidos com amostras de carne moída

Parâmetros Carne moída Carne moída Carne moída
Valores médios ∑a (log10 ufc/g) 3,1 3,9 4,9
Limite da repetibilidade r:
como diferença em escala log10 (log10 ufc/g) 0,36 0,38 0,21

Tabela B.3 – Resultados de análise dos dados obtidos com amostras de queijo fresco
Parâmetros Queijo fresco Queijo fresco Queijo fresco
Valores médios ∑a (log10 ufc/g) 3,4 4,1 6,2
como diferença em escala log10 (log10 ufc/g) 0,14 0,18 0,33

Tabela B.4 – Resultado de análise dos dados obtidos com material de referência
Parâmetros Material de referência

Número de amostras 2
Número de laboratórios remanescentes após a eliminação dos valores 18
aberrantes (outliers)
Número de valores aberrantes (outliers) 0
Número de amostras aceitas 36
Valores médios ∑a (log10 ufc/g) 3,9
Desvio-padrão da repetibilidade sr (log10 ufc/g) 0,04
Desvio-padrão relativo da repetibilidade (%) 1,12
como diferença em escala log10 (log10 ufc/g) 0,12
como razão na escala normal (ufc/g) 1,3
Desvio-padrão da reprodutibilidade sR (log10 ufc/g) 0,08
Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (%) 2,16

como diferença na escala log10 (log10 ufc/g) 0,23
como razão na escala normal (ufc/g) 1,7

Bibliografia
[1] MOSSEL, D.A.A., KOOPMAN, M.J. and JONGERIUS, E. Appl. Microbiol., 15, 1967, pp. 650-653
[2] CMSF. Microorganisms in foods, Vol. 1, 2nd edn., University of Toronto Press, 1978
[3] COWELL and MORISETTI J. Sci. Fd. Agric., 20, 1969, p. 573
[4] N ‘T VELD, P.H., SOENTORO, P.S.S. and NOTERMANS, S.H.W. I. J. Food Microbiol., 20, 1993,
pp. 23-36
[5] ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 1:
General principles and definitions
[6] ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results –
Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard
measurement method
[7] SCHULTEN, S.M., VAN de LUSTGRAAF, B.E.B., NAGELKERKE, N.J.D. and IN ‘T VELD, P.H.
Report No. 286555001, National Institute of Public Health and the Environment, Bilthoven,
The Netherlands, 1998
[8] SCHULTEN, S.M., IN ‘T VELD, P.H., NAGELKERKE, N.J.D., SCOTTER, S., DE BUYSER, M.L.,
ROLLIER, P. and LAHELLEC, C. I. J. Food Microbiology, 57, 2000, pp. 53-61

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NORMA ABNT NBR

Microbiologia de alimentos para consumo

ICS 07.100.30 ISBN 978-85-07-06015-4

© ISO 2004 - © ABNT 2

ii © ISO 2004 - © ABNT ‌2016 - Todos os direitos reservados

5.2.5 Preparação das placas de ágar..........................................................................................4

© ISO 2004 - © ABNT ‌2016 - Todos os direitos reservados iii

iv © ISO 2004 - © ABNT ‌2016 - Todos os direitos reservados

A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Foro Nacional de Normalização.

O Escopo em inglês desta Norma Brasileira é o seguinte:

—— environmental samples in the area of food production and food handling.

© ISO 2004 - © ABNT ‌2016 - Todos os direitos reservados v

vi © ISO 2004 - © ABNT ‌2016 - Todos os direitos reservados

Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal —

—— produtos destinados ao consumo humano e animal, e

—— amostras ambientais na área de produção de alimentos e manipulação de alimentos.

estritamente relacionadas, porém menos comumente encontradas, como B. anthracis, B. thuringiensis, B .

ABNT NBR ISO 6887-1:2011, Microbiologia de alimentos e de alimentação animal – Preparo de

© ISO 2004 - © ABNT ‌2016 - Todos os direitos reservados 1

NOTA Ver Nota na Seção 1.

de ensaio ou da suspensão inicial.

4.2 As placas são incubadas sob condições aeróbicas a 30 °C durante 18 h a 48 h

5 Diluente, meios de cultura e reagentes

5.2 Meio ágar (ver [1])

5.2.1 Meio base

Extrato de carne bovina 1,0 g

2 © ISO 2004 - © ABNT ‌2016 - Todos os direitos reservados

Dissolver os componentes ou o meio completo desidratado na água, por aquecimento, se necessário.

Dispensar o meio em quantidades de 90 mL em frascos de capacidade apropriada.

Esterilizar durante 15 min em uma autoclave (6.1) ajustada a 121 °C.

5.2.2 Solução de polimixina B

Sulfato de polimixina B 106 UI

Dissolver o sulfato de polimixina B em água. Esterilizar por filtração.

5.2.3 Emulsão de gema de ovo

Aquecer a mistura durante 2 h em um banho-maria (6.4) fixado em 44 °C a 47 °C. Em seguida, deixar

Recolher assepticamente o sobrenadante da emulsão.

A emulsão pode ser armazenada a 5 °C ± 3 °C, durante não mais do que 72 h.

5.2.4 Meio completo (ágar MYP)

Meio base (5.2.1) 90 mL

Fundir o meio base e resfriar em um banho-maria (6.4) fixado em 44 °C a 47 °C.

Adicionar os outros líquidos, misturando bem após cada adição.

Resfriar o meio completo em um banho-maria (6.4) fixado em 44 °C a 47 °C.

© ISO 2004 - © ABNT ‌2016 - Todos os direitos reservados 3

5.2.5 Preparação das placas de ágar

Imediatamente antes da utilização, secar as placas, preferencialmente retirando as tampas e mantendo

5.2.6 Testes de desempenho

Ver ISO/TS 11133-2: 2003, Anexo B.

5.3 Ágar sangue de carneiro

5.3.1 Meio Base: base de ágar sangue No. 2

Proteose peptona ou peptona equivalente 15 g

Dissolver os componentes ou o meio completo desidratado em água por ebulição.

Distribuir em frascos e esterilizar durante 15 min a 121 °C.

5.3.2 Sangue de carneiro desfibrinado

5.3.2.1 Meio completo

Meio base (5.3.1) 100 mL

4 © ISO 2004 - © ABNT ‌2016 - Todos os direitos reservados

Equipamento usual de laboratório de microbiologia e em particular o seguinte.

6.1 Equipamento de esterilização a seco (forno) ou esterilização úmida (autoclave)

Ver ISO 7218.

6.3 Incubadora, capaz de operar a 30 °C ± 1 °C.

6.4 Banhos-maria, que possam ser mantidos a 44 °C a 47 °C.

6.5 pHmetro, com uma precisão de ± 0,1 unidade de pH a 25 °C.

8 Preparação da amostra de ensaio