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NORMA ABNT NBR


BRASILEIRA 14029

Terceira edição
12.09.2016

Versão corrigida
15.08.2017
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Agrotóxicos e afins — Validação de métodos


analíticos
Pesticides — Validation of analytical methods

ICS 65.100 ISBN 978-85-07-06526-5

Número de referência
ABNT NBR 14029:2016
12 páginas

© ABNT 2016
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Sumário Página

Prefácio................................................................................................................................................iv
1 Escopo.................................................................................................................................1
2 Referências normativas......................................................................................................1
3 Termos e definições............................................................................................................1
4 Requisitos............................................................................................................................3
5 Procedimento......................................................................................................................3
5.1 Seletividade.........................................................................................................................3
5.2 Linearidade..........................................................................................................................3
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5.2.1 Ingrediente ativo em produtos técnicos e ingrediente ativo em formulação................3


5.2.2 Impureza...............................................................................................................................4
5.3 Limite de detecção (LD)......................................................................................................4
5.4 Limite de quantificação (LQ)..............................................................................................4
5.5 Recuperação........................................................................................................................5
5.5.1 Impurezas e analitos em baixas concentrações..............................................................5
5.5.2 Ingrediente ativo em produto formulado..........................................................................5
5.5.3 Ingrediente ativo em produto técnico...............................................................................5
5.6 Precisão...............................................................................................................................5
5.6.1 Repetitividade......................................................................................................................5
5.6.2 Precisão Intermediária........................................................................................................6
6 Critérios de aceitação.........................................................................................................6
7 Aplicabilidade......................................................................................................................7
8 Resultados da validação....................................................................................................8
9 Cálculos...............................................................................................................................9
9.1 Média aritmética..................................................................................................................9
9.2 Estimativa do desvio-padrão.............................................................................................9
9.3 Coeficiente de variação (CV) = desvio-padrão relativo (DPR)........................................9
9.4 Teste de Grubbs................................................................................................................10
Bibliografia..........................................................................................................................................12

Tabelas
Tabela 1 – Critérios de aceitação........................................................................................................7
Tabela 2 – Parâmetros de validação...................................................................................................7
Tabela 3 – Resultados de validação...................................................................................................8
Tabela 4 – Valores críticos (Gc).........................................................................................................10

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Prefácio

A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Foro Nacional de Normalização. As Normas


Brasileiras, cujo conteúdo é de responsabilidade dos Comitês Brasileiros (ABNT/CB), dos Organismos
de Normalização Setorial (ABNT/ONS) e das Comissões de Estudo Especiais (ABNT/CEE),
são elaboradas por Comissões de Estudo (CE), formadas pelas partes interessadas no tema objeto
da normalização.

Os Documentos Técnicos ABNT são elaborados conforme as regras da ABNT Diretiva 2.

A ABNT chama a atenção para que, apesar de ter sido solicitada manifestação sobre eventuais direitos
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de patentes durante a Consulta Nacional, estes podem ocorrer e devem ser comunicados à ABNT
a qualquer momento (Lei nº 9.279, de 14 de maio de 1996).

Ressalta-se que Normas Brasileiras podem ser objeto de citação em Regulamentos Técnicos. Nestes
casos, os Órgãos responsáveis pelos Regulamentos Técnicos podem determinar outras datas para
exigência dos requisitos desta Norma.

A ABNT NBR 14029 foi elaborada pela Comissão de Estudo de Especial de Agrotóxicos e Afins
(ABNT/CEE-171). O Projeto circulou em Consulta Nacional conforme Edital nº 05, de 16.05.2016
a 14.07.2016.

Esta terceira edição cancela e substitui a edição anterior (ABNT NBR 14029:2005), a qual foi tecnica-
mente revisada.

Esta versão corrigida da ABNT NBR 14029:2016 incorpora a Errata 1, de 15.08.2017.

O Escopo em inglês desta Norma Brasileira é o seguinte:

Scope
This Standard establishes the procedure for method validation for active ingredient assay in technical
product, active ingredient assay in formulations and content of impurity in pesticides.

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Agrotóxicos e afins — Validação de métodos analíticos

1 Escopo
Esta Norma estabelece o procedimento para validação de métodos para determinação do teor de
ingrediente ativo em produto técnico, teor de ingrediente ativo em formulação e teor de impureza em
produtos agrotóxicos e afins.
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2 Referências normativas
Os documentos relacionados a seguir são indispensáveis à aplicação deste documento. Para refe-
rências datadas, aplicam-se somente as edições citadas. Para referências não datadas, aplicam-se
as edições mais recentes do referido documento (incluindo emendas).

ABNT NBR 13073, Limpeza de vidraria para uso em ensaios de produtos agrotóxicos e afins

ABNT NBR 13075, Manipulação de produtos agrotóxicos em laboratório – Requisitos de segurança

3 Termos e definições
Para os efeitos deste documento, aplicam-se os seguintes termos e definições.

3.1
amostra
substância-teste
objeto sob investigação em um estudo

3.2
analito
grandeza específica submetida à medição

3.3
branco amostra
matriz do produto contendo todos os componentes da formulação, exceto o ingrediente ativo

3.4
branco reagente
reagentes e solventes utilizados em etapas de preparação e diluição de amostra e substâncias de
referências, que são analisados isoladamente para verificar se eles apresentam sinal analítico que
possa interferir na resposta do analito de interesse

3.5
exatidão
recuperação
relação entre a quantidade do componente de interesse analisado e a quantidade teórica na amostra,
expressa em porcentagem

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3.6
impureza
substância diferente do ingrediente ativo, derivada de seu processo de produção e proveniente de
matérias-primas remanescentes, subprodutos provenientes de reações secundárias, sais inorgânicos,
produtos de degradação e solventes residuais

3.7
ingrediente ativo
agente químico, físico ou biológico que confere eficácia aos agrotóxicos e afins

3.8
limite de detecção
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LD
menor concentração ou quantidade de um analito que pode ser detectada com segurança

3.9
limite de quantificação
LQ
menor concentração ou quantidade de um analito que pode ser determinada com precisão e veracidade

3.10
linearidade
habilidade de um método analítico de produzir resultados que sejam diretamente proporcionais à con-
centração do analito, em uma dada faixa de concentração

3.11
padrão analítico
material de referência com concentração definida

3.12
precisão
termo geral para avaliar a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma
mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões (materiais de referência), em condições definidas

3.13
precisão intermediária
grau de concordância entre os resultados das medições de um mesmo mensurando, efetuadas no
mesmo laboratório e sob condições variadas de medição

3.14
produto formulado
formulação
agrotóxico ou afim obtido a partir de produto técnico ou de pré-mistura, por intermédio de processo
físico, ou diretamente de matérias-primas, por meio de processos físicos, químicos ou biológicos.
É constituído do ingrediente ativo e impurezas provenientes de seu processo de fabricação, além dos
componentes utilizados para compor o produto final

3.15
produto técnico
produto obtido diretamente de matérias-primas por processo químico, físico ou biológico, destinado a
obtenção de produtos formulados ou de pré-misturas e cuja composição contém teor definido de ingre-
diente ativo e impurezas, podendo conter estabilizantes e produtos relacionados, como isômeros

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3.16
repetividade
grau de concordância entre os resultados de medições sucessivas de um mesmo mensurando, efe-
tuadas sob as mesmas condições de medição

3.17
reprodutibilidade
grau de concordância entre os resultados das medições de um mesmo mensurando, efetuadas sob
condições variadas de medição em diferentes laboratórios

3.18
seletividade
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habilidade de um método para determinar acurada e especificamente o analito de interesse na pre-


sença de outros componentes, em uma matriz de amostra, sob as condições estabelecidas no ensaio

3.19
validação
confirmação por exame e fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um
determinado uso pretendido são atendidos

4 Requisitos
4.1 A vidraria utilizada deve estar limpa de acordo com a ABNT NBR 13073.

4.2 Na manipulação de materiais de referência, produtos técnicos e formulações, devem ser tomados
os cuidados prescritos na ABNT NBR 13075.

4.3 Os materiais de referência devem ter rastreabilidade nos seus certificados e prazo de validade
em vigor.

5 Procedimento
5.1 Seletividade
Fazer no mínimo uma leitura de uma solução de branco reagente e branco amostra.

Examinar se há alguma interferência no sinal analítico de interesse.

Caso existam interferentes que não possam ser eliminados durante o desenvolvimento do método,
descrever a forma de eliminar seus efeitos ou justificar que os interferentes não são relevantes.

Caso o branco de amostra não esteja disponível, a seletividade deve ser complementada através
de alguma outra ferramenta analítica, como, por exemplo, a obtenção de pureza de pico, quando
é empregado o detector de arranjo de diodos (DAD) ou detector de massas (EM).

5.2 Linearidade
5.2.1 Ingrediente ativo em produtos técnicos e ingrediente ativo em formulação

Preparar no mínimo cinco soluções de padrão analítico em diferentes níveis de concentração, incluindo
a faixa de concentração nominal de 80 % a 120 % do analito de interesse.

Analisar cada solução no mínimo uma vez (uma leitura).

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5.2.2 Impureza

Preparar no mínimo cinco soluções de padrão analítico em diferentes níveis de concentração.

Analisar cada solução no mínimo uma vez (uma leitura). A solução de calibração mais diluída deve ser
analisada no mínimo cinco vezes (cinco leituras) a fim de determinar o limite de quantificação (LQ),
conforme descrito em 5.4.

Para ambos os casos, construir gráfico de resposta analítica versus concentração e obter a equação
da reta de regressão linear, com seu respectivo coeficiente de correlação (r), o qual deve ser ≥ 0,99.

NOTA Para alguns analitos e/ou técnicos, a proporcionalidade entre concentração e resposta analítica
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pode não ser linear. Nestes casos, aplicar o modelo matemático mais adequado.

5.3 Limite de detecção (LD)

Aplicável somente para análise de analitos em baixas concentrações (impureza e ingrediente ativo
em baixas concentrações).

Calcular o LD conforme a técnica analítica utilizada.

Por exemplo, na técnica de cromatografia, determinar a relação entre sinal/ruído (S/R) na injeção
do padrão analítico de menor concentração da curva analítica. O limite de detecção do método é deter-
minado pela seguinte equação:
3 × (Cstd )
LD = × 100
(S/R) × Cs
onde

LD é o limite de detecção do método expresso pela porcentagem de massa por massa (% m/m);

Cstd é a concentração da solução de calibração mais diluída;

(S/R) é a razão entre a altura do sinal e a altura do ruído para o analito no cromatograma
da solução de calibração mais diluída;

Cs é a concentração nominal teórica da amostra.

5.4 Limite de quantificação (LQ)

Aplicável somente para análise de impurezas.

Calcular o LQ conforme a técnica analítica utilizada.

Por exemplo, na técnica de cromatografia, determinar o limite de quantificação do método através


das cinco determinações feitas para a solução de calibração de menor concentração. O limite de
quantificação é definido como a concentração do primeiro nível da faixa linear, desde que o desvio-
padrão relativo (DPR) entre as cinco medidas seja menor que o DPR calculado pela equação estendida
de Horwitz e que a relação entre sinal/ruído (S/R) seja maior ou igual a 10:

%DPR Horwitz = 2(1− 0,5 log C) × 0, 67

NOTA C = concentração do analito (% m/m) dividido por 100: por exemplo, se a concentração do analito
for 99 % m/m, utilizar C = 0,99 na equação estendida de Horwitz.

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5.5 Recuperação

É o procedimento ou processo que expressa quanto os valores obtidos encontram-se próximo do valor
real, sendo determinada como a recuperação do analito.

5.5.1 Impurezas e analitos em baixas concentrações

Através da adição de padrão analítico do analito de interesse à amostra, preparar no mínimo dois
níveis de fortificação e analisar no mínimo uma vez cada solução (uma leitura).

5.5.2 Ingrediente ativo em produto formulado


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5.5.2.1 Quando o branco de amostra está disponível

Através da adição de material com concentração definida do analito de interesse ao branco de


amostra, preparar três níveis de fortificação (80 %, 100 % e 120 % da concentração nominal do analito)
e analisar no mínimo uma vez cada solução (uma leitura).

Para casos em que for impossível seguir estes níveis, justificar a utilização de níveis mais adequados.

5.5.2.2 Quando o branco de amostra não está disponível

Através da adição de material com concentração definida do analito de interesse à amostra, preparar
três níveis de fortificação (que estejam compreendidos dentro da faixa de concentração da curva
analítica) e analisar no mínimo uma vez cada solução (uma leitura).

5.5.2.3 Cálculo de recuperação

O valor de recuperação para impurezas e ingrediente ativo é determinado pela seguinte equação:
C − C2
Recuperação (%) = 1 × 100
C3
onde

C1 é a concentração encontrada após adição do padrão;

C2 é a concentração encontrada antes da adição do padrão;

C3 é a concentração conhecida adicionada do padrão analítico.

5.5.3 Ingrediente ativo em produto técnico

A recuperação deve ser considerada não aplicável.

5.6 Precisão
A precisão é medida por meio de ensaios de repetitividade e precisão intermediária.

5.6.1 Repetitividade

5.6.1.1 Ensaio de repetitividade 1

Executar o método analítico, sob as seguintes condições:

 a) mesmo equipamento;

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 b) mesmo analista;

 c) mesmo dia (repetição em instantes sucessivos).

Preparar no mínimo cinco soluções independentes de um mesmo lote da amostra, conforme descrito
no procedimento específico.

Fazer no mínimo uma leitura de cada solução.

Fazer o tratamento estatístico, pelos dos cálculos de média, estimativa do desvio-padrão, teste de
Grubbs para verificação de valores dispersos e o desvio-padrão relativo, o qual deve estar em confor-
midade com o valor determinado pela equação estendida de Horwitz (DPR calculado ≤ DPR Horwitz):
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%DPR Horwitz = 2(1− 0,5 log C) × 0, 67

NOTA C = concentração do analito (% m/m) dividido por 100; por exemplo, se a concentração do analito
for 99 % m/m, utilizar C = 0,99 na equação estendida de Horwitz..

5.6.1.2 Ensaio de repetitividade 2

Variar pelo menos uma das condições analíticas (equipamento, analista ou dia de análise) e proceder
conforme o ensaio de repetitividade 1.

5.6.2 Precisão Intermediária

Combinar os dados obtidos nas repetitividades 1 e 2.

Fazer o tratamento estatístico, pelos cálculos de média, estimativa do desvio-padrão, teste de Grubbs
para verificação de valores dispersos e o desvio padrão relativo, o qual deve estar em conformidade
com o valor determinado pela equação de Horwitz (DPR calculdado ≤ DPR Horwitz):

%DPR Horwitz = 2(1− 0,5 log C)

NOTA C = concentração do analito (% m/m) dividido por 100; por exemplo, se a concentração do analito
for 100 % m/m, utilizar C = 1 na equação de Horwitz.

6 Critérios de aceitação
Para o método ser considerado validado e apto a ser utilizado, deve atender aos critérios de aceitação
descritos na Tabela 1.

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Tabela 1 – Critérios de aceitação


Parâmetro Determinação de impureza ou ingrediente ativo
Ausência de interferentes. Mas caso existam interferentes que
Seletividade não possam ser eliminados durante o desenvolvimento do método,
descrever a forma de eliminar seus efeitos
Linearidade Coeficiente de correlação (r) ≥ 0,99
Repetitividade DPR calculado ≤ DPR calculado pela equação estendida de Horwitz
Precisão intermediária DPR calculado ≤ DPR calculado pela equação de Horwitz
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Limite de detecção Relação (sinal/ruído) ≥ 3


Relação (sinal/ruído) ≥ 10
Limite de quantificação
DPR calculado ≤ DPR calculado pela equação estendida de Horwitz

Concentração nominal
Recuperação tolerável
do ingrediente ativo
(%)
(% m/m)
> 10 98 – 102
1 – 10 97 – 103
<1 95 – 105
0,01-0,1 90 – 110
Recuperação/exatidão
< 0,01 80 – 120
Concentração nominal
Recuperação tolerável
das impurezas
(%)
(% m/m)
>1 90 – 110
0,1 – 1 80 – 120
< 0,1 75 – 125

7 Aplicabilidade
Os parâmetros de validação são requeridos conforme cada tipo de aplicação, conforme descrito
na Tabela 2.

Tabela 2 – Parâmetros de validação


Determinação de Determinação de
Determinação
Parâmetro ingrediente ativo ingrediente ativo
de impureza
em produto técnico em formulação
Seletividade Sim Sim Sim
Linearidade Sim Sim Sim
Exatidão/recuperação Não Sim Sim
Precisão Sim Sim Sim

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Tabela 2 (continuação)
Determinação de Determinação de
Determinação de
Parâmetro ingrediente ativo ingrediente ativo
impureza
em produto técnico em formulação
Limite de detecção Não Não a Sim
Limite de
Não Não a Sim
quantificação
a Somente aplicável quando tratar-se de formulação com concentração baixa de ingrediente ativo, ou seja,
quando estiver em nível de concentração similar ao de impureza.
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8 Resultados da validação
Todas as informações referentes e pertinentes ao estudo de validação devem ser registradas em um
relatório de validação. Este documento deve apresentar ao menos os seguintes itens:

 a) objetivo e aplicação do método a ser validado;

 b) descrição do método analítico (condições cromatográficas, preparo de amostra e substância-


referência);

 c) descrição dos parâmetros de validação (seletividade, linearidade, limites de detecção e quantifi-
cação, exatidão/recuperação e precisão);

 d) resumo de resultados da validação, conforme descrito na Tabela 3.

Tabela 3 – Resultados de validação

Parâmetro Resultado

Se não houver interferentes, declarar que o método é específico


Seletividade e seletivo. Se houver interferentes, declarar que há interferentes
e qual é a forma de eliminação de seus efeitos
Declarar o valor do coeficiente de correlação juntamente com
a equação da curva analítica
Linearidade
Declarar o limite inferior e superior de concentração no qual
o método pode ser aplicado
Limite de detecção (LD) Declarar quando aplicável
Limite de quantificação (LQ) Declarar quando aplicável
Recuperação Declarar o valor médio de recuperação quando aplicável
Repetitividade Declarar o desvio-padrão relativo
Precisão intermediária Declarar o desvio-padrão relativo
Reprodutibilidade Declarar o desvio-padrão relativo quando aplicável

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9 Cálculos
9.1 Média aritmética

Conforme equação a seguir:


n
∑X
X= 1
n

onde
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X é a média aritmética;

∑ é o somatório;

X é valor de cada medida;

n é o número de medidas.

9.2 Estimativa do desvio-padrão

Conforme equação a seguir:

Sr =
∑ ( xn − X)2
(n − 1)

onde

Sr é a estimativa do desvio-padrão;

∑ é o somatório;

Xn é o valor de cada medida;

X é a medida aritmética;

n é o número de medidas.

9.3 Coeficiente de variação (CV) = desvio-padrão relativo (DPR)

Conforme equação a seguir:


S
CV = DPR = × 100
X
onde

CV = DPR é o coeficiente de variação = desvio-padrão relativo;

S é a estimativa do desvio-padrão;

X é a média aritmética.

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9.4 Teste de Grubbs

Conforme equações a seguir:

Gn =
( Xn − X)
s
onde

Gn é o valor de Grubbs determinado para a maior medida;

Xn é o valor da maior medida;


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X é a média aritmética;

s é a estimativa do desvio padrão.

G1 =
( X − X1)
s
onde

G1 é o valor de Grubbs determinado para a menor medida;

X é a medida aritmética;

X1 é o valor da menor medida;

s é a estimativa do desvio-padrão.

NOTA 1 Se Gcalculado ≤ Gc (2,5 %), o valor é aceito; e se Gcalculado ≥ Gc (2,5 %) o valor é rejeitado.

NOTA 2 Em caso de rejeição acima de 22,2 % dos dados, é necessário refazer os ensaios referentes a este
conjunto de dados.

Os valores críticos (Gc) para o teste de Grubbs ao nível de 97,5 % de confiança são apresentados
conforme a Tabela 4.

Tabela 4 – Valores críticos (Gc)


Número de medidas GC
N 2,5 %
3 1,155
4 1,481
5 1,715
6 1,887
7 2,020
8 2,126
9 2,215

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Tabela 4 (continuação)
Número de medidas GC
N 2,5 %
10 2,290
11 2,355
12 2,412
13 2,462
14 2,507
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Bibliografia

[1]  EURACHEM Guide, The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory Guide
to Method Validation and Related Topics, Second Edition (2014).

[2]  INMETRO, DOQ-CGCRE-008: Orientação sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos,


revisão 04 (Julho, 2011).

[3]  INMETRO, Vocabulário Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de Metrologia –


Documento impresso em 08/04/2021 16:36:00, de uso exclusivo de OXITENO S/A IND & COMÉRCIO

5ª Edição 92007).

[4]  SANCO/3030/99 rev.4 - 11/07/00 Technical Material and Preparations: Guidance for generating
and reporting methods of analysis in support of pre- and post-registration data requirements for
Annex II (part A, Section 4) and Annex III (part A, Section 5) of Directive 91/414.

[5]  CIPAC, Guidelines on method validation to be performed in support of analytical methods for
agrochemical formulations.

[6]  F. E. Grubbs, G. Beck. Technometrics. 1972. 14 847.

[7]  Albert R. and Horwitz W. Anal. Chem. 1997. 69 789-790.

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