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NORMA ABNT NBR

BRASILEIRA ISO
11290-1
Primeira edição
15.04.2020
Microbiologia da cadeia produtiva de alimentos

— Método horizontal para a detecção
e enumeração de Listeria monocytogenes
e de Listeria spp.
Parte 1: Método de detecção
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and
enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp.
Part 1: Detection method
ICS 07.100.30 ISBN 978-65-5659-046-2
Número de referência
ABNT NBR ISO 11290-1:2020
38 páginas
© ISO 2017 - © ABNT 2020


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Sumário Página
Prefácio Nacional...............................................................................................................................vii
Introdução..........................................................................................................................................viii
1 Escopo.................................................................................................................................1
2 Referências normativas......................................................................................................1
3 Termos e definições............................................................................................................2
4 Princípio...............................................................................................................................2
4.1 Geral.....................................................................................................................................2
4.2 Enriquecimento primário em meio de enriquecimento líquido seletivo com
concentração reduzida de agentes seletivos (caldo demi-Fraser).................................3
4.3 Enriquecimento secundário com meio de enriquecimento líquido seletivo com
concentração total de agentes seletivos (caldo Fraser).................................................3
4.4 Plaqueamento e identificação............................................................................................3
4.5 Confirmação........................................................................................................................3
5 Meios de cultura e reagentes.............................................................................................3
6 Equipamentos e consumíveis............................................................................................3
7 Amostragem........................................................................................................................4
8 Preparação da amostra de ensaio.....................................................................................4
9 Procedimento......................................................................................................................4
9.1 Alíquota de ensaio e suspensão inicial............................................................................4
9.2 Enriquecimento primário....................................................................................................5
9.3 Enriquecimento secundário...............................................................................................5
9.4 Plaqueamento e identificação............................................................................................5
9.4.1 Geral.....................................................................................................................................5
9.4.2 Agar Listeria, segundo Ottaviani e Agosti........................................................................6
9.4.3 Segundo meio seletivo.......................................................................................................6
9.5 Confirmação de Listeria monocytogenes ou Listeria spp..............................................6
9.5.1 Seleção de colônias para confirmação.............................................................................6
9.5.2 Confirmação de L. Monocytogenes...................................................................................7
9.5.3 Confirmação de Listeria spp............................................................................................12
9.6 Interpretação das propriedades morfológicas e fisiológicas e das reações
bioquímicas.......................................................................................................................13
9.7 Caracterização adicional de cepas isoladas (opcional)................................................13
10 Expressão dos resultados................................................................................................13
11 Características de desempenho do método...................................................................13
11.1 Estudos de validação do método....................................................................................13
11.2 Sensibilidade.....................................................................................................................13
11.3 Especificidade...................................................................................................................13
11.4 Nível de detecção (LOD50)................................................................................................13
12 Relatório de ensaio...........................................................................................................14
13 Garantia da qualidade.......................................................................................................14
Anexo A (normativo) Diagrama de procedimento...........................................................................15
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Anexo B (normativo) Composição e preparação de meios de cultura e reagentes....................16

B.1 Meio de enriquecimento primário seletivo: caldo demi-Fraser....................................16
B.1.1 Base....................................................................................................................................16
B.1.1.1 Composição.......................................................................................................................16
B.1.2 Solução de cloreto de lítio................................................................................................16
B.1.2.2 Preparação.........................................................................................................................16
B.1.3 Solução de sal sódico de ácido nalidíxico.....................................................................16
B.1.3.1 Composição.......................................................................................................................16
B.1.3.2 Preparação.........................................................................................................................17
B.1.4 Solução de cloridrato de acriflavina................................................................................17
B.1.4.1 Composição.......................................................................................................................17
B.1.4.2 Preparação.........................................................................................................................17
B.1.5 Solução de citrato férrico amoniacal..............................................................................17
B.1.5.1 Composição.......................................................................................................................17
B.1.5.2 Preparação.........................................................................................................................17
B.1.6 Meio completo...................................................................................................................17
B.1.6.1 Composição.......................................................................................................................17
B.1.6.2 Preparação.........................................................................................................................17
B.2 Meio de enriquecimento secundário seletivo: caldo Fraser.........................................18
B.2.1 Base....................................................................................................................................18
B.2.1.1 Composição.......................................................................................................................18
B.2.1.2 Preparação.........................................................................................................................18
B.2.2 Solução de cloridrato de acriflavina................................................................................18
B.2.3 Solução de citrato férrico amoniacal..............................................................................18
B.2.4 Meio completo...................................................................................................................18
B.3 Ágar Listeria, segundo Ottaviani e Agosti [16], [17].....................................................................19
B.3.1 Meio-base...........................................................................................................................19
B.3.1.1 Composição.......................................................................................................................19
B.3.1.2 Preparação.........................................................................................................................19
B.3.2 Solução de ácido nalidíxico.............................................................................................19
B.3.3 Solução de ceftazidima.....................................................................................................19
B.3.4 Solução de polimixina B...................................................................................................20
B.3.5 Suplemento antibiótico.....................................................................................................20
B.3.5.1 Solução de ciclo-heximida...............................................................................................20
B.3.5.2 Solução de anfotericina B (como alternativa à solução de ciclo-heximida)...............20
B.3.6 Suplemento........................................................................................................................20
B.3.7 Meio completo...................................................................................................................21
B.3.7.1 Composição.......................................................................................................................21
B.3.7.2 Preparação.........................................................................................................................21
B.3.7.3 Preparação de placas de ágar..........................................................................................21
B.4 Segundo meio sólido seletivo de plaqueamento...........................................................21
B.5 Teste de desempenho para a garantia da qualidade dos meios de cultura................21
B.6 Solução de peróxido de hidrogênio................................................................................23
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B.7 Ágar-motilidade.................................................................................................................23
B.7.1 Composição.......................................................................................................................23
B.7.2 Preparação.........................................................................................................................23
B.8 Ágar sangue.......................................................................................................................23
B.8.1 Base....................................................................................................................................23
B.8.1.1 Composição.......................................................................................................................23
B.8.1.2 Preparação.........................................................................................................................23
B.8.2 Sangue desfibrinado (ovelha, bezerro ou bovino).........................................................24
B.8.3 Meio completo...................................................................................................................24

B.8.3.1 Composição.......................................................................................................................24
B.8.3.2 Preparação.........................................................................................................................24
B.9 Solução salina tamponada com fosfato (PBS)...............................................................24
B.9.1 Composição.......................................................................................................................24
B.9.2 Preparação ........................................................................................................................24
B.10 Suspensão de glóbulos vermelhos.................................................................................24
B.11 Meio de CAMP test (Christie, Atkins, Munch-Petersen) e cepas-teste.........................25
B.11.1 Generalidades....................................................................................................................25
B.11.2 Base....................................................................................................................................25
B.11.3 Meio sangue.......................................................................................................................25
B.11.4 Meio completo...................................................................................................................25
B.12 Caldo-base de utilização de carboidratos (L-ramnose e D-xilose)...............................25
B.12.1 Base...................................................................................................................................25
B.12.1.1 Composição.......................................................................................................................25
B.12.1.2 Preparação.........................................................................................................................25
B.12.2 Soluções de carboidratos...............................................................................................26
B.12.2.1 Composição.......................................................................................................................26
B.12.2.2 Preparação.........................................................................................................................26
B.12.3 Meio completo...................................................................................................................26
B.13 Reagentes para reação Voges-Proskauer (VP)..............................................................26
B.13.1 Meio VP..............................................................................................................................26
B.13.1.1 Composição.......................................................................................................................26
B.13.1.2 Preparação.........................................................................................................................26
B.13.2 Solução etanólica, α-naftol...............................................................................................26
B.13.2.1 Composição.......................................................................................................................26
B.13.2.2 Preparação.........................................................................................................................27
B.13.3 Solução de hidróxido de potássio..................................................................................27
B.13.3.1 Composição.......................................................................................................................27
B.13.3.2 Preparação.........................................................................................................................27
B.14 Ágar triptona de soja extrato de levedura (TSYEA).......................................................27
B.14.1 Composição.......................................................................................................................27
B.14.2 Preparação.........................................................................................................................27
Anexo C (informativo) Distinção de Listeria spp., de outros gêneros..........................................28
Anexo D (informativo) Reações para a identificação de espécies de Listeria..............................29
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Anexo E (informativo) Ágares seletivos de Listeria........................................................................31

Anexo F (informativo) Resultados dos estudos interlaboratoriais para detecção de Listeria
monocytogenes.................................................................................................................32
F.1 Resultados dos estudos interlaboratoriais....................................................................32
F.2 Valores de LOD50 % da literatura.....................................................................................34
Bibliografia..........................................................................................................................................36
Figuras
Figura 1 – Inoculação e interpretação de placas de CAMP test.................................................... 11

Figura A.1 – Diagrama de procedimento..........................................................................................15
Tabelas
Tabela 1 – Teste de confirmação para L. monocytogenes...............................................................8
Tabela 2 – Teste de confirmação para Listeria spp.........................................................................12
Tabela B.1 – Teste de desempenho de meios de cultura para Listeria monocytogenes............22
Tabela C.1 – Distinção de Listeria spp. de outros gêneros ou espécies bacterianas.................28
Tabela D.1 – Principais testes prescritos neste documento (ver 9.5)...........................................29
Tabela D.2 – Reações adicionais para a identificação de espéciese de Listeria.........................30
Tabela E.1 – Ágares comerciais não seletivos de Listeria (extraído da Referência [7])..............31
Tabela F.1 – Resultados da análise dos dados obtidos com salmão defumado a frio................32
Tabela F.2 – Resultados da análise dos dados obtidos com amostras ambientais (compressas
de gaze imersas em diluente)..........................................................................................33
Tabela F.3 – Resultados da análise dos dados obtidos com saladas prontas para consumo
(mistura de espinafre fresco e alface americana)..........................................................33
Tabela F.4 – Resultados da análise dos dados obtidos com fórmula alimentar infantil em pó.. 33
Tabela F.5 – Resultados da análise dos dados obtidos com queijo (massa de queijo fundido).34
Tabela F.6 – LOD50 % (UFC/25g ou 25 mL).......................................................................................34
Tabela F.7 – Relatórios de validação do AFNOR fornecendo valores de LOD50 % [20]....................35
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Prefácio Nacional
A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Foro Nacional de Normalização. As Normas

Brasileiras, cujo conteúdo é de responsabilidade dos Comitês Brasileiros (ABNT/CB), dos Organismos
de Normalização Setorial (ABNT/ONS) e das Comissões de Estudo Especiais (ABNT/CEE), são
elaboradas por Comissões de Estudo (CE), formadas pelas partes interessadas no tema objeto
da normalização.
Os Documentos Técnicos internacionais adotados são elaborados conforme as regras da

ABNT Diretiva 3.
A ABNT chama a atenção para que, apesar de ter sido solicitada manifestação sobre eventuais direitos
de patentes durante a Consulta Nacional, estes podem ocorrer e devem ser comunicados à ABNT
a qualquer momento (Lei nº 9.279, de 14 de maio de 1996).
Os Documentos Técnicos ABNT, assim como as Normas Internacionais (ISO e IEC), são voluntários
e não incluem requisitos contratuais, legais ou estatutários. Os Documentos Técnicos ABNT não
substituem Leis, Decretos ou Regulamentos, aos quais os usuários devem atender, tendo precedência
sobre qualquer Documento Técnico ABNT.
Ressalta-se que os Documentos Técnicos ABNT podem ser objeto de citação em Regulamentos
Técnicos. Nestes casos, os órgãos responsáveis pelos Regulamentos Técnicos podem determinar as
datas para exigência dos requisitos de quaisquer Documentos Técnicos ABNT.
A ABNT NBR ISO 11290-1 foi elaborada pela Comissão de Estudo Especial de Microbiologia
de Alimentos (ABNT/CEE-157). O Projeto circulou em Consulta Nacional conforme Edital nº 03,
de 06.03.2020 a 06.04.2020.
A ABNT NBR ISO 11290-1 é uma adoção idêntica, em conteúdo técnico, estrutura e redação,
à ISO 11290-1:2017, que foi elaborada pelo Technical Committee Food Analysis – Horizontal methods
(CEN/TC 275), Subcommittee Microbiology (SC 9).
O Escopo em inglês da ABNT NBR ISO 11290-1 é o seguinte:
Scope
This document specifies a horizontal method for
—— the detection of L. monocytogenes, and
—— the detection of Listeria spp. (including L. monocytogenes).
This document is applicable to
—— products intended for human consumption and for the feeding of animals, and
—— environmental samples in the area of food production and food handling.
It is possible that certain additionally described Listeria species may not be detected or confirmed
by this method.
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Introdução
As principais alterações, listadas no Prefácio, introduzidas neste documento, em comparação

à ISO 11290-1:1996, são consideradas principais (ver ISO 17468[28]). As alterações técnicas foram
avaliadas e foram consideradas como não tendo efeito significativo nas características de desempenho
do método ou nos resultados dos ensaios.
NOTA BRASILEIRA Esta lista de alterações referente à ISO 11290-1:1996, não adotada como Norma
Brasileira, não foi incluída nesta edição nacional.
Devido à grande variedade de alimentos para consumo humano e animal, este método horizontal pode
não ser apropriado em todos os detalhes para certos produtos para os quais pode ser necessário usar
métodos diferentes ou específicos. No entanto, em todos os casos, este método horizontal destina-se
a ser aplicado tanto quanto possível e os desvios a este apenas serão feitos por razões técnicas
justificadas.
Quando este documento for posteriormente revisado, serão levadas em conta todas as informações
então disponíveis quanto ao grau em que este método horizontal foi seguido e as razões para desvios
deste, no caso de produtos específicos.
A harmonização dos métodos de ensaio não pode ser imediata e, para determinados grupos de
produtos, podem já existir Normas Internacionais e/ou normas nacionais que não cumpram este
método horizontal. Espera-se que, quando essas normas forem revisadas, elas sejam alteradas para
atender a este documento, de modo que, eventualmente, os únicos desvios remanescentes deste
método horizontal sejam aqueles necessários por razões técnicas bem estabelecidas.
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NORMA BRASILEIRA ABNT NBR ISO 11290-1:2020
Microbiologia da cadeia produtiva de alimentos — Método horizontal para

a detecção e enumeração de Listeria monocytogenes e de Listeria spp.
Parte 1: Método de detecção
ADVERTÊNCIA – A fim de salvaguardar a saúde da equipe de laboratório, é essencial que

os ensaios para detectar L. monocytogenes e Listeria spp. sejam realizados apenas em labo-
ratórios devidamente equipados, sob o controle de um microbiologista qualificado, e que seja
tomado muito cuidado na eliminação de todos os materiais incubados. Convém que os profissio-
nais que utilizem este documento estejam familiarizados com as práticas comuns de laboratório.
Este documento não pretende abordar todos os aspectos de segurança, caso haja, associados
ao seu uso. É de responsabilidade do usuário estabelecer práticas adequadas de segurança
e saúde. Em particular, é fortemente recomendado que ensaios para detectar L. monocytoge-
nes sejam realizados em laboratórios que forneçam condições de biossegurança de nível 2.
Recomenda-se fortemente que as colaboradoras do laboratório estejam cientes do risco parti-
cular para o feto em desenvolvimento, apresentado pela infecção da mãe por meio da exposição
à L. monocytogenes e Listeria spp., e que gestantes e pessoas com condições de vulnerabi-
lidade reconhecidas ou imunocomprometidas não manipulem culturas de L. monocytogenes
e Listeria spp.
1 Escopo
Este documento especifica um método horizontal para
—— detecção de L. monocytogenes, e
—— detecção de Listeria spp. (incluindo L. monocytogenes).
Este documento é aplicável a
—— produtos destinados ao consumo humano e animal, e
—— amostras ambientais na área de produção de alimentos e manipulação de alimentos.
É possível que certas espécies de Listeria descritas adicionalmente não sejam enumeradas
ou confirmadas por este método. [5],[10],[12],[14],[25],[26],[27]
2 Referências normativas
Os documentos a seguir são citados no texto de tal forma que seus conteúdos, totais ou parciais,
constituem requisitos para este Documento. Para referências datadas, aplicam-se somente as edições
citadas. Para referências não datadas, aplicam-se as edições mais recentes do referido documento
(incluindo emendas).
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain – Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination
ABNT NBR ISO 7218, Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal — Requisitos
gerais e orientações para análises microbiológicas
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ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water – Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Termos e definições
Para os efeitos deste documento, aplicam-se os seguintes termos e definições.
A ISO e a IEC mantêm as bases de dados terminológicos para uso na normalização nos seguintes
endereços:
—— ISO Online browsing platform: disponível em http://www.iso.org/obp
—— IEC Electropedia: disponível em http://www.electropedia.org/”
3.1
Listeria monocytogenes
microrganismos que formam colônias típicas em meios seletivos sólidos e que apresentam
as características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas descritas, quando os ensaios são realizados
em conformidade com este documento
3.2
detecção de Listeria monocytogenes
determinação da detecção/não detecção de Listeria monocytogenes (3.1), em uma dada massa
ou volume de produto ou em uma superfície especificada, quando os ensaios são realizados
3.3
Listeria spp.
microrganismos que formam colônias típicas em meios seletivos sólidos e que apresentam
as características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas descritas, quando os ensaios são realizados
3.4
detecção de Listeria spp.
determinação da detecção/não detecção de Listeria spp. (3.3), em uma dada massa ou volume
de produto ou em uma superfície especificada, quando os ensaios são realizados em conformidade
com este documento
4 Princípio
4.1 Geral
Listeria spp. podem estar presentes em pequeno número e muitas vezes são acompanhadas por
um número consideravelmente maior de outros microrganismos, portanto, o enriquecimento seletivo
é necessário. Também é necessário detectar Listeria spp. injuriadas e estressadas, e o meio
de enriquecimento seletivo primário, com concentração reduzida de inibidor, atende parcialmente esta
função.
NOTA A presença de L. monocytogenes pode ser mascarada pela presença de outras espécies
de Listeria, em particular L. innocua ou L. ivanovii.
2 © ISO 2017 - © ABNT 2020 - Todos os direitos reservados

Dentro dos limites deste documento, a detecção de L. monocytogenes e Listeria spp. necessita
de quatro etapas sucessivas, conforme descrito no fluxograma do Anexo A.
4.2 Enriquecimento primário em meio de enriquecimento líquido seletivo com

concentração reduzida de agentes seletivos (caldo demi-Fraser)
Inoculação de um meio de enriquecimento primário seletivo contendo metade das concentrações

de acriflavina e ácido nalidíxico (caldo demi-Fraser, ver B.1), que também é usado como diluente para
a alíquota de ensaio (9.1).
Incubação da suspensão inicial a 30 °C, por 24 h a 26 h.
4.3 Enriquecimento secundário com meio de enriquecimento líquido seletivo com

concentração total de agentes seletivos (caldo Fraser)
Inoculação de meio de enriquecimento líquido secundário de concentração completa (caldo Fraser),

com uma cultura obtida em 4.2.
Incubação do caldo Fraser a 37 °C, por 24 h. [29]
4.4 Plaqueamento e identificação
Das culturas obtidas em 4.2 e 4.3, plaquear nos dois meios sólidos seletivos:
—— ágar Listeria, segundo Ottaviani e Agosti (ver referências [16] e [17] e B.3);
—— qualquer outro meio sólido seletivo à escolha do laboratório complementar ao ágar Listeria,
segundo Ottaviani e Agosti, utilizando um substrato e/ou princípio diferente do utilizado no ágar
Listeria, segundo Ottaviani e Agosti (ver B.4). Ver o Anexo E para obter informações sobre meios.
Incubar o ágar Listeria, de acordo com Ottaviani e Agosti, a 37 °C, por um total de 48 h. Se colônias
presuntivas de L. monocytogenes ou Listeria spp. forem evidentes em 24 h, a incubação pode ser
interrompida nesta fase. Incubar o segundo meio seletivo na temperatura apropriada e examinar após
o tempo apropriado.
4.5 Confirmação
Isolar as colônias presuntivas de L. monocytogenes ou Listeria spp., plaqueadas conforme descrito

em 4.4, e confirmar por meio de testes morfológicos e/ou bioquímicos apropriados.
5 Meios de cultura e reagentes

Para as práticas laboratoriais atuais, ver a ISO 11133.
A composição e o teste de desempenho de meios de cultura e reagentes e sua preparação estão

descritos no Anexo B.
6 Equipamentos e consumíveis
Materiais microbiológicos usuais (conforme especificado na ABNT NBR ISO 7218) e, em particular,
o seguinte.

6.1 Equipamento para esterilização a seco (estufa) ou esterilização por via úmida (autoclave).
Conforme especificado na ABNT NBR ISO 7218.
6.2 Estufa de secagem ou incubadora, capaz de ser mantida entre 25 °C e 50 °C.
6.3 Incubadoras, capazes de operar a 30 °C ± 1 ° C, 37 °C ± 1 ° C e 25 °C ± 1 °C (opcional).
6.4 Banho-maria, capaz de operar entre 47 °C e 50 °C.

6.5 Alças estéreis com aproximadamente 3 mm de diâmetro ou 10 µL e agulha de inoculação

ou alça metálica.
6.6 Medidor de pH, com capacidade de leitura próxima de 0,01 unidade de pH a 25 °C, permitindo
a realização de medições com exatidão de ± 0,1 unidade de pH.
6.7 Pipetas graduadas ou pipetas automáticas, com capacidades nominais de 1 mL e 10 mL.
6.8 Placas de Petri, por exemplo, com diâmetro de 90 mm.
6.9 Microscópio, preferencialmente com contraste de fase, e com lâminas e lamínulas.
6.10 Refrigerador, capaz de operar a 5 °C ± 3 °C.
7 Amostragem
A amostragem não faz parte do método especificado neste documento. Se não houver uma Norma
Internacional específica tratando da amostragem do produto em questão, recomenda-se que as partes
envolvidas cheguem a um acordo sobre este assunto. Para amostras de alimentos para consumo
humano e animal, ver ISO/TS 17728 [3]. Para amostras ambientais, usar a ISO 18593[2] e consultar
a Referência [24].
É importante que o laboratório receba uma amostra que seja verdadeiramente representativa e que não
tenha sido danificada ou alterada durante o transporte ou armazenamento (ver ABNT NBR ISO 7218).
8 Preparação da amostra de ensaio

Preparar a amostra de ensaio de acordo com a Norma Internacional específica que trata do produto
em questão [ver ISO 6887 (todas as partes) e ISO 18593 [2]]. Se não houver uma Norma Internacional
específica, recomenda-se que as partes envolvidas cheguem a um acordo sobre este assunto.
9 Procedimento
9.1 Alíquota de ensaio e suspensão inicial
Ver a ISO 6887 (todas as partes) e qualquer Norma Internacional específica apropriada para o produto
em questão.
Para a preparação da suspensão inicial, utilizar como diluente o meio de enriquecimento primário
seletivo especificado em B.1 (caldo demi-Fraser).

Em geral, para preparar a suspensão inicial, adicionar uma alíquota de ensaio de 25 g ou 25 mL a 225 g
ou 225 mL do meio de enriquecimento primário seletivo (B.1), para obter uma diluição de dez vezes,
e homogeneizar. Preaquecer o meio de enriquecimento primário seletivo à temperatura ambiente
antes de usar.
Este documento foi validado para alíquotas de ensaio de 25 g ou mL. Uma alíquota de ensaio menor
pode ser usada, sem a necessidade de validação/verificação adicional, desde que a mesma proporção
entre o caldo de enriquecimento primário e a alíquota de ensaio seja mantida. Uma porção maior do
que a inicialmente validada pode ser usada, se um estudo de validação/verificação tiver mostrado que
não há efeitos adversos na detecção de L. monocytogenes ou Listeria spp.
NOTA 1 A validação pode ser realizada de acordo com o documento apropriado da ISO 16140 (all parts)[1].
A verificação para coleta de amostras pode ser conduzida de acordo com o protocolo descrito
na ABNT NBR ISO 6887-1:2019, Anexo D (protocolo de verificação para agrupar amostras para ensaios
qualitativos). Ver as Referências [21] e [22], pois elas fornecem informações sobre o caso particular
de amostras em pool de Listeria.
NOTA 2 Para grandes quantidades, recomenda-se preaquecer o meio de enriquecimento primário seletivo
a 30 °C ± 1 °C antes de misturá-lo com a alíquota de ensaio.
9.2 Enriquecimento primário
Incubar o meio de enriquecimento primário (caldo demi-Fraser, ver B.1), preparado de acordo com
9.1, a 30 °C (6.3), por 25 h ± 1 h.
NOTA 1 Uma coloração preta pode se desenvolver durante a incubação.
NOTA 2 É possível armazenar a amostra pré-enriquecida a 5 °C (6.10), após a incubação, antes

da transferência para o caldo Fraser, por um período máximo de 72 h.
(Ver referência [20]).
9.3 Enriquecimento secundário
9.3.1 Após a incubação da suspensão inicial (enriquecimento primário), durante 25 h ± 1 h (9.2),

transferir 0,1 mL da cultura obtida em 9.2 (independentemente da sua cor) para um tubo ou frasco
contendo 10 mL de meio de enriquecimento (caldo Fraser) (B.2).
9.3.2 Incubar o meio inoculado (9.3.1), por 24 h ± 2 h, a 37 °C (6.3).
NOTA No caso de Listeria spp., além da detecção de Listeria monocytogenes, incubações adicionais
de 24 h podem permitir a recuperação de mais espécies.
9.4 Plaqueamento e identificação
9.4.1 Geral
9.4.1.1 A partir da cultura primária de enriquecimento (9.2), incubada durante 25 h ± 1 h a 30 °C (6.3),

inocular, por meio de uma alça (6.5), a superfície do primeiro meio seletivo, ágar Listeria, segundo
Ottaviani e Agosti (B.3), para obter colônias bem separadas.
Proceder da mesma maneira com o segundo meio seletivo de plaqueamento de escolha (B.4).
NOTA O caldo Half-Fraser e o caldo Fraser podem ser refrigerados a 5 °C (6.10), antes do isolamento em
ágar seletivo, por no máximo 72 h. [20]

9.4.1.2 Do meio de enriquecimento secundário, incubado por 24 h ± 2 h, a 37 °C (6.3) (9.3.2), repetir

o procedimento descrito em 9.4.1.1 com os dois meios de plaqueamento seletivo.
9.4.1.3 Inverter as placas de Petri obtidas em 9.4.1.1 e 9.4.1.2 e colocá-las em uma incubadora
ajustada a 37 °C (6.3) para ágar Listeria, segundo Ottaviani e Agosti (B.3). Para o segundo meio
seletivo (B.4), seguir as instruções do fabricante.
9.4.1.4 Para ágar Listeria, segundo Ottaviani e Agosti, incubar por um total de 48 h ± 2 h.
Se colônias presuntivas de L. monocytogenes ou Listeria spp. estiverem evidentes em 24 h ± 2 h,
a incubação pode ser interrompida nesta fase. Para a segunda incubação seletiva em ágar pelo
tempo apropriado, examinar as placas (9.4.1.3) quanto à presença de colônias presuntivas

de L. monocytogenes ou Listeria spp.
NOTA Após a incubação, as placas podem ser refrigeradas a 5 °C (6.10), por um período máximo de 48 h
antes da leitura.
9.4.2 Agar Listeria, segundo Ottaviani e Agosti
Considerar como presuntivas L. monocytogenes as colônias azul-esverdeadas circundadas por

um halo opaco (colônias típicas). As colônias de L. ivanovii também são azul-esverdeadas e circundadas
por um halo opaco.
Considerar como presuntivas Listeria spp. colônias azul-verdes com ou sem halo opaco.
NOTA 1 Algumas cepas de L. monocytogenes expostas a condições de estresse, particularmente estresse

por ácido, podem mostrar um halo muito fraco (ou mesmo ausência de halo).
NOTA 2 Algumas L. monocytogenes raras são caracterizadas por uma atividade lenta de PIPLC (fosfatidil
inositol fosfolipase C). Tais bactérias são detectadas quando a duração total da incubação é maior que, por
exemplo, quatro dias. Algumas dessas cepas podem ser patogênicas. [13] Nenhuma cepa de L. monocytogenes
foi descrita como negativa para PIPLC.
NOTA 3 Alguns organismos, além de Listeria spp., podem produzir colônias azuis neste meio. Ver Anexo C
e Referência [23].
9.4.3 Segundo meio seletivo
Após o tempo apropriado, examinar as placas para a presença de colônias que são consideradas
presuntivas de Listeria spp. ou L. monocytogenes, com base em suas características para o tipo
de meio utilizado (B.4). Ver o Anexo E para mais informações.
9.5 Confirmação de Listeria monocytogenes ou Listeria spp.
9.5.1 Seleção de colônias para confirmação
9.5.1.1 Para confirmação de L. monocytogenes presuntivas, isolar pelo menos uma colônia
presuntiva de L. monocytogenes (ver 9.4.2 e 9.4.3). Um isolado confirmado por amostra é suficiente.
Se a primeira colônia for negativa, isolar outras colônias presuntivas como sendo L. monocytogenes
do meio seletivo (até um máximo de cinco colônias de cada placa de cada meio seletivo).
Estriar as colônias selecionadas sobre a superfície das placas pré-secas de um ágar não seletivo,
por exemplo, ágar sangue, ágar-nutriente, ágar-extrato de levedura de soja triptona (TSYEA) (B.14),
de maneira que seja permitido que as colônias isoladas se desenvolvam.

A utilização de ágar-sangue para cultura pura permite a interpretação da hemólise, quando positiva,
já nessa fase (ver 9.5.2.5.2 e Anexo D). Se as estrias no ágar sangue não apresentarem hemólise,
o teste da hemólise deve ser realizado por inoculação em profundidade (9.5.2.5.2) ou em meio líquido
(9.5.2.5.3).
Colocar as placas na incubadora a 37 °C (6.3), por 18 h a 24 h, ou até que o crescimento seja

satisfatório.
Se as colônias não estiverem isoladas, escolher uma colônia típica de L. monocytogenes em outra
placa de ágar não seletiva. Realizar os seguintes testes (9.5.2) a partir de colônias de uma cultura
pura no ágar não seletivo.
9.5.1.2 Para confirmação de Listeria spp. presuntivas, considerar pelo menos uma colônia que se
presuma que seja Listeria spp. (ver 9.4.2 e 9.4.3). Um isolado confirmado por amostra é suficiente. Se
a primeira colônia for negativa, isolar outras colônias presuntivas como sendo Listeria spp. de meio
seletivo (até um máximo de cinco colônias de cada placa de cada meio seletivo).
Para confirmação de Listeria spp., usar placas de TSYEA.
Estriar as colônias selecionadas sobre a superfície das placas pré-secas de TSYEA (B.14), de maneira
que seja permitido o desenvolvimento de colônias isoladas.
Colocar as placas na incubadora a 37 °C (6.3), por 18 h a 24 h, ou até que o crescimento seja

satisfatório.
Colônias típicas de Listeria spp. no TSYEA têm 1 mm a 2 mm de diâmetro, convexo, incolor e opaco
com uma borda inteira. Quando as placas são mantidas na luz (artificial ou natural) em um ângulo
de aproximadamente 45°, as colônias exibem uma cor cinza-azulada e uma superfície granular.
Se as colônias não estiverem isoladas, escolher uma colônia típica de Listeria spp em outra placa
de ágar não seletivo.
Realizar os seguintes testes (9.5.3) a partir de colônias típicas de uma cultura pura em TSYEA.
9.5.2 Confirmação de L. Monocytogenes
9.5.2.1 Geral
Efetuar os testes de confirmação para L. monocytogenes. Devem ser utilizadas as cepas de controle
positivas e negativas apropriadas para cada um dos testes de confirmação.
Executar no mínimo os testes obrigatórios, conforme listados (em negrito) na Tabela 1.

Tabela 1 – Teste de confirmação para L. monocytogenes

Teste de confirmação
Teste Resultados
L. monocytogenes
Mandatório Aspecto microscópico (9.5.2.4) Bastonetes curtos ou cocobacilos
Beta-hemólise (9.5.2.5) +
L-ramnose (9.5.2.7) +
D-xilose (9.5.2.7) -
Opcional Catalase (9.5.2.2) +
Motilidade a 25 °C (9.5.2.3) +
CAMP Test (9.5.2.6) +
a Aspecto microscópico é opcional para ágar Listeria, segundo Ottaviani e Agosti, e para o segundo
meio é permitida a distinção entre Listeria spp. patogênica e não patogênica.
Detalhes sobre os resultados dos testes de confirmação podem ser encontrados no Anexo D.
NOTA Um procedimento alternativo, como mencionado na ABNT NBR ISO 7218, pode ser usado para
confirmar o isolado como Listeria monocytogenes, desde que a adequação do procedimento relevante seja
verificada.
Caso se mostrem confiáveis, podem ser utilizadas galerias miniaturizadas para a identificação
bioquímica de Listeria monocytogenes (ver ABNT NBR ISO 7218).
São raras as cepas de L. monocytogenes que não apresentem beta-hemólise ou uma reação positiva
ao CAMP test sob as condições descritas neste documento. Se colônias típicas em ágar Listeria forem
negativas para hemólise, segundo Ottaviani e Agosti, com atividade de PIPLC, mesmo que sejam
baixas, recomenda-se a realização de testes adicionais (por exemplo, coloração de Gram, catalase,
motilidade, CAMP test, PCR), de forma a determinar se este isolado é uma L. monocytogenes não
hemolítica.
9.5.2.2 Reação com catalase (opcional)
Selecionar uma colônia isolada obtida em 9.5.1.1 e suspendê-la em uma gota de solução de peróxido
de hidrogênio (B.6) em uma lâmina. A formação imediata de bolhas de gás indica uma reação positiva.
NOTA Uma reação com catalase realizada a partir de uma colônia originária de um ágar sangue pode
levar a resultados falsos positivos.
9.5.2.3 Teste de motilidade (opcional)
Selecionar uma colônia isolada, obtida em 9.5.1.1, e suspendê-la em um tubo contendo meio líquido
nutriente não seletivo.
Incubar na incubadora (6.3) a 25 °C, por 8 h a 24 h, até que o meio fique turvo.
Pingar uma gota da cultura acima usando uma alça (6.5) em uma lâmina de vidro limpo. Colocar uma
lamínula no topo e examiná-la em microscópio (6.9).
Listeria spp. (incluindo L. monocytogenes) aparecem como bastonetes finos e curtos, com motilidade
tipo tombamento.

Culturas incubadas a temperaturas acima de 25 °C podem não exibir esse movimento. Compará-las
sempre com uma cultura de Listeria conhecida. Cocos, bastonetes grandes ou bastonetes com
motilidade rápida não são Listeria spp.
Como teste alternativo de motilidade, usando uma agulha de inoculação (6.5), diluir em água estéril
(ou outro diluente apropriado) um fragmento de colônia isolado, obtido em ágar não seletivo. Listeria
spp. (incluindo L. monocytogenes) aparecem como bastonetes finos e curtos, com motilidade tipo
tombamento.
Como outro teste alternativo para motilidade, usando uma agulha de inoculação (6.5), perfurar o ágar
de motilidade (B.7) com uma cultura selecionada de uma colônia típica, obtida em 9.5.1.1. Incubar
a 25 °C, por 48 h ± 2 h.
Examinar o crescimento em torno da perfuração. Listeria spp. são móveis, apresentando um perfil
típico de crescimento tipo guarda-chuva. Se o crescimento não for suficiente, incubar por até cinco
dias adicionais e observar a perfuração novamente.
NOTA Algumas novas espécies de Listeria foram recentemente isoladas. [5], [10], [12], [14], [25], [26], [27]
A maioria delas não é móvel no ágar de motilidade.
9.5.2.4 Aspecto microscópico (opcional no caso de uso de ágar específico para Listeria spp.
patogênica)
Fazer uma preparação microscópica (por exemplo, a coloração de Gram, microscopia úmida)
em uma colônia bem isolada, obtida em 9.5.1.1. Listeria spp. (incluindo L. monocytogenes) aparecem
como Gram positivas (se esta coloração for realizada), bastonetes finos e curtos ou cocobacilos, com
motilidade tipo tombamento, quando originários de uma cultura nova.
Para preparação microscópica da coloração de Gram, ver ABNT NBR ISO 7218.
9.5.2.5 Teste de hemólise
9.5.2.5.1 Geral
Escolher um dos testes de hemólise (9.5.2.5.2 ou 9.5.2.5.3).
NOTA Existem raras cepas de L. monocytogenes que não apresentam b-hemólise ou uma reação positiva
ao CAMP test, sob as condições descritas neste documento.
9.5.2.5.2 Hemólise em ágar sangue
Se as características morfológicas e fisiológicas forem indicativas de Listeria spp., inocular placas

de ágar sangue (B.8) para determinar a reação hemolítica.
Secar bem a superfície do ágar antes de usar. Selecionar uma colônia isolada, obtida em 9.5.1.1,
usando uma agulha (6.5) e, em seguida, perfurar uma seção do ágar. Repetir para cada cultura.
Na mesma placa, se possível, inocular por perfuração as culturas controle-positivas (L. monocytogenes)
e negativas (L. innocua). Por exemplo, podem ser utilizados L. monocytogenes 4b WDCM 00021 ou L.
monocytogenes 1/2a WDCM 00109 e L. innocua WDCM 00017.
Após a incubação a 37 °C (6.3), por 24 h ± 2 h, examinar as cepas e controles de teste.

L. monocytogenes que mostram halos estreitos, claros e pálidos de hemólise; L. innocua não mostra
halo algum ao redor da perfuração. L. seeligeri mostra principalmente um halo fraco de hemólise.

L. ivanovii geralmente mostram halos de hemólise largos e claramente delineados. Examinar as placas
sob uma luz brilhante para comparar as culturas de teste com os controles.
NOTA 1 A reação de hemólise é mais prontamente vista pela remoção de qualquer crescimento de colônia
na superfície do ágar ao redor da marca do inóculo.
NOTA 2 O teste de hemólise pode ser realizado perfurando a placa de ágar sangue usada no CAMP test.
9.5.2.5.3 Reação de hemólise usando glóbulos vermelhos
A reação hemolítica também pode ser realizada utilizando glóbulos vermelhos do sangue, como
a seguir.
Dispersar a colônia em 150 μL de meio nutriente líquido não seletivo, incubar a 37 °C (6.3), por 2 h.
Adicionar 150 μL de suspensão de glóbulos vermelhos (B.10). Incubar a 37 °C (6.3), por 15 min
a 60 min, em seguida, refrigerar a 5 °C (6.10), por aproximadamente 2 h. Examinar a atividade
hemolítica. Se a reação for duvidosa, deixar a 5 °C (6.10), por até 24 h ± 2 h. A sedimentação de
glóbulos vermelhos (formação de um ponto vermelho no fundo dos tubos) indica uma reação negativa.
Incluir controles positivos e negativos. Para cepas de controle, ver 9.5.2.5.2.
9.5.2.6 CAMP test (opcional)
Se o resultado do teste de hemólise for difícil de interpretar, recomenda-se que o CAMP test demonstre
claramente que a hemólise é devida à atividade de listeriolisina.
Uma cepa β-hemolítica de Staphylococcus aureus (por exemplo, WDCM 00034) e uma cepa
de Rhodococcus equi (por exemplo, WDCM 0028) são requeridas para realizar o CAMP test. Nem todas
as cepas de S. aureus são adequadas para o CAMP test. Estriar cada uma das culturas de S. aureus
e R. equi em linhas simples em placa de ágar sangue (B.8.3 ou B.11.4), de modo que as duas culturas
fiquem paralelas e diametralmente opostas (ver Figura 1). Um inóculo fino e uniforme é requerido.
Isto pode ser obtido usando uma alça de inoculação ou uma agulha (6.5) mantida perpendicularmente
ao ágar.
Estriar uma colônia bem isolada da cepa sob ensaio (9.5.1.1) de uma forma semelhante, em ângulos
retos a estas culturas, de modo que a cultura de ensaio e as culturas de S. aureus e R. equi não
se toquem, mas no seu ponto mais próximo estejam a cerca de 1 mm a 2 mm de distância. Várias
cepas de teste podem ser estriadas na mesma placa.


Legenda
1 halo estreito de β-hemólise

2 sem hemólise
3 halo largo de β-hemólise
4 L. monocytogenes
5 L. innocua
6 L. ivanovii
Figura 1 – Inoculação e interpretação de placas de CAMP test
As linhas verticais na Figura 1 representam estrias de S. aureus (S) e R. equi (R). Linhas horizontais
representam estrias das culturas-teste. Áreas hachuradas indicam os locais de hemólise aumentada.
A área pontilhada indica a zona de influência da cultura S. aureus.
Simultaneamente, estriar culturas-controle de L. monocytogenes, L. innocua e L. ivanovii. Por exemplo,

podem ser utilizados L. monocytogenes 4b WDCM 00021, L. monocytogenes 1/2a WDCM 00109,
L. innocua WDCM 00017 e L. ivanovii WDCM 00018. Manter as culturas-estoque conforme especificado
na ISO 11133.
Se o ágar sangue (B.8.3) for usado, incubar as placas a 37 °C, por 18 h a 24 h. Se forem utilizadas
placas de camada dupla (B.11.4), incubar a 37 °C, por 12 h a 18 h.
A reação positiva com R. equi é vista como uma “cabeça de seta” larga (5 mm a 10 mm) de hemólise.
A reação é considerada negativa se um pequeno halo de hemólise fraca se estender apenas a cerca de
1 mm na interseção da cepa-teste com a zona de difusão da cultura de R. equi.
Uma reação positiva com S. aureus aparece como um pequeno halo de hemólise aumentada, que
se estende apenas cerca de 2 mm da cepa-teste e dentro do halo fracamente hemolítico, devido ao
crescimento da cultura de S. aureus. Grandes halos de hemólise não ocorrem na área de S. aureus e
L. monocytogenes.
9.5.2.7 Utilização de carboidratos
Utilizando uma alça (6.5), inocular cada um dos caldos de carboidratos utilizados (B.12) com as
culturas obtidas a partir do ágar não seletivo (9.5.1.1). Incubar a 37 °C. As reações positivas (formação
de ácido) são indicadas por uma cor amarela e ocorrem principalmente dentro de 24 h a 48 h para
tubos de microvolumes e até 5 dias para tubos de macrovolumes. L-ramnose e D-xilose são utilizados
para a confirmação de L. monocytogenes, que é positivo para L-ramnose e negativo para D-xilose
(ver Anexo D).
NOTA Existem raras cepas de L. Monocytogenes que não fermentam L-ramnose. [15], [18]

Para microvolumes, as reações são mais rápidas. O nível de inoculação comparado ao volume total
é um fator importante. Para cada protocolo escolhido, é importante verificar o tempo necessário para
obter uma coloração amarela. É aconselhável usar controles. Por exemplo, podem ser utilizados
L. monocytogenes 4b WDCM 00021, L. innocua WDCM 00017 e L. ivanovii WDCM 00018. Manter
culturas-estoque conforme especificado na ISO 11133.
9.5.3 Confirmação de Listeria spp.
9.5.3.1 Geral
Efetuar os testes de confirmação para Listeria spp. de uma colônia típica (9.5.1.2). Devem ser utilizadas
as cepas de controle positivas e negativas apropriadas para cada um dos testes de confirmação.
Executar no mínimo os testes obrigatórios, conforme listados (em negrito) na Tabela 2.
Para outros testes, se for necessária a identificação de espécies de Listeria, ver o Anexo D.
Tabela 2 – Teste de confirmação para Listeria spp.

Testes Listeria spp. Resultados
Aspecto microscópico (9.5.2.4) Bastões curtos ou cocobacilos
Obrigatório
Catalase (9.5.2.2) +
Teste de VP (9.5.3.5) +
Opcional
Motilidade a 25 °C (9.5.2.3) +
NOTA 1 Um procedimento alternativo, como mencionado na ABNT NBR ISO 7218, pode ser usado para
confirmar o isolado como Listeria spp., desde que a adequação do procedimento relevante seja verificada.
NOTA 2 É possível que algumas novas espécies de Listeria recentemente isoladas possam não
corresponder a este esquema, em particular para a motilidade, teste de VP e crescimento a 37 °C (ver, por
exemplo, Referências [4], [10], [25], [26] e [27]).
9.5.3.2 Reação com catalase
Selecionar uma colônia isolada obtida em 9.5.1.2 e realizar o teste conforme descrito em 9.5.2.2.
9.5.3.3 Teste de motilidade (opcional)
Selecionar uma colônia isolada obtida em 9.5.1.2 e realizar o teste conforme descrito em 9.5.2.3.
9.5.3.4 Aspecto microscópico
Selecionar uma colônia isolada, obtida em 9.5.1.2, e realizar o teste conforme descrito em 9.5.2.4.
9.5.3.5 Reação Voges – Proskauer (VP) (opcional)
Utilizando uma alça (6.5), inocular um tubo contendo 3 mL do meio VP (B.13.1). Incubar a 37 °C, por
24 h ± 2 h. Após a incubação, adicionar 0,6 mL de solução de α-naftol a 5 % (B.13.2) e 0,2 mL
de solução de hidróxido de potássio a 40 % (B.13.3). Agitar bem, inclinar o tubo (para aumentar
a área da interface ar-líquido). Analisar após 15 min e 1 h. Uma reação positiva é indicada por uma cor
vermelha forte. Listeria spp. são VP positivo.

NOTA Algumas novas espécies de Listeria foram isoladas recentemente. [5], [10], [12], [14], [25], [26], [27]
A maioria delas é VP negativa.
9.6 Interpretação das propriedades morfológicas e fisiológicas e das reações

bioquímicas
Todas as Listeria spp. são pequenos bastonetes Gram-positivos ou cocobacilos que dão uma reação
positiva no teste da catalase.
L. monocytogenes são confirmadas de acordo com os testes listados na Tabela 1 e Listeria spp.
confirmadas de acordo com os testes listados na Tabela 2.
9.7 Caracterização adicional de cepas isoladas (opcional)

Os isolados que são considerados L. monocytogenes (9.6) podem ser enviados para caracterização
mais detalhada a um Laboratório de Referência nacional ou regional reconhecido para Listeria, ou (se
não estiverem disponíveis) para os Centros Colaboradores da Organização Mundial de Saúde para
Listeria. A expedição deve ser acompanhada de todas as informações possíveis relativas à(s) cepa(s).
Para outros ensaios, se for necessária a identificação de espécies de Listeria, ver o Anexo D.
10 Expressão dos resultados

De acordo com a interpretação dos resultados (ver 9.6), relatar se L. monocytogenes foi detectada
ou não detectada, e/ou se Listeria spp. foi detectada ou não detectada na alíquota de ensaio,
especificando a massa em gramas, o volume em mililitros da amostra ensaiada e a superfície
em centímetros quadrados ou por dispositivo de amostragem.
11 Características de desempenho do método

11.1 Estudos de validação do método
As características de desempenho do método foram determinadas em estudos interlaboratoriais,
para estabelecer a especificidade, sensibilidade e, quando possível, o nível de detecção (LOD50)
do método. Os dados estão resumidos no Anexo F. Os valores derivados dos estudos interlaboratoriais
podem não ser aplicáveis a tipos de alimentos diferentes dos indicados no Anexo F.
11.2 Sensibilidade
A sensibilidade é definida como o número de amostras positivas encontradas, dividido pelo número
de amostras ensaiadas em um determinado nível de contaminação. Os resultados são, então,
dependentes do nível de contaminação da amostra.
11.3 Especificidade
A especificidade é definida como o número de amostras negativas encontradas, dividido pelo número
de amostras em branco ensaiadas.
11.4 Nível de detecção (LOD50)

O nível de detecção a 50 % (LOD50) é a concentração (UFC/alíquota de ensaio) para a qual
a probabilidade de detecção é de 50 %.

12 Relatório de ensaio
O relatório de ensaio deve especificar o método utilizado e os resultados obtidos. Deve também
mencionar quaisquer detalhes operacionais não especificados neste documento, ou considerados
opcionais, juntamente com detalhes de quaisquer incidentes que possam ter influenciado os resultados
(ver Seção 10).
O relatório de ensaio deve incluir todas as informações necessárias para a identificação completa
da amostra.
13 Garantia da qualidade
Convém que o laboratório possua um sistema de controle de qualidade claramente definido que
garanta que o equipamento, os reagentes e as técnicas sejam adequados para o ensaio. O uso
de controles positivos, negativos e brancos faz parte do ensaio. O teste de desempenho de meios
de cultura é especificado em B.5 e descrito na ISO 11133.

Anexo A
(normativo)
Diagrama de procedimento
Alíquota de ensaio (25 g ou 25 mL)

Meio de enriquecimento primário (caldo demi-Fraser; B1) (225 g ou 225 mL)
Incubar a 30 °C ± 1 °C por 24 h a 26 h
0,1 mL de cultura em 10 mL de meio

de enriquecimento secundário (caldo Fraser; B2)
Incubação a 37 °C ± 1 °C por 24 h ± 2 h
Plaqueamento em
Ágar Listeria segundo Ottaviani e Agosti (B3) e plaqueamento no segundo meio seletivo (B4)
- Incubação de Ágar Listeria segundo Ottaviani e Agosti por 24 h ± 2 h

e uma incubação adicional de 24 h ± 2 h a 37 °C ± 1 °C
- Incubação do segundo meio seletivo, conforme o meio escolhido como especificado pelo fabricante
Confirmação de L. monocytogenes ou Listeria spp. (9.5):
- Inoculação do meio ágar não seletivo e incubação a 37 °C ± 1 °C (9.5.1)
- Confirmação de L. monocytogenes (ver 9.5.2) - Confirmação de Listeria spp. (ver 9.5.3)
Figura A.1 – Diagrama de procedimento

Anexo B
(normativo)
Composição e preparação de meios de cultura e reagentes
B.1 Meio de enriquecimento primário seletivo: caldo demi-Fraser

B.1.1 Base
B.1.1.1 Composição
Digestão enzimática de carne 5,0 g

Digestão enzimática de caseína 5,0 g
Extrato de carne 5,0 g
Extrato de levedura 5,0 g
Cloreto de sódio 20,0 g
Hidrogenofosfato dissódico di-hidratado 12,0 g
Di-hidrogenofosfato de potássio 1,35 g
Esculina 1,0 g
Água 1 000 mL
B.1.2 Solução de cloreto de lítio
Cloreto de lítio 3 g

Água 10 mL
B.1.2.2 Preparação
Adicionar o cloreto de lítio à água.
Esterilizar por filtração em uma membrana de 0,45 μm.
ADVERTÊNCIA – Tomar todas as precauções necessárias ao dissolver o cloreto de lítio

na água, pois a reação é fortemente exotérmica. Além disto, esta solução irrita as membranas
mucosas.
B.1.3 Solução de sal sódico de ácido nalidíxico
Sal sódico de ácido nalidíxico 0,1 g

Hidróxido de sódio, solução 0,05 mol/L 10 mL

Dissolver o sal do ácido nalidíxico no hidróxido de sódio.
Esterilizar por filtração em uma membrana de 0,45 µm.
B.1.4 Solução de cloridrato de acriflavina
Cloridrato de acriflavina 0,25 g

Água 100 mL
Dissolver o cloridrato de acriflavina na água.
B.1.5 Solução de citrato férrico amoniacal
Citrato férrico amoniacal 5,0 g

Água 100 mL
Dissolver o citrato férrico amoniacal na água.
B.1.6 Meio completo
Base (B.1.1) 100 mL

Solução de cloreto de lítio (B.1.2) 1,0 mL
Solução de sal sódico de ácido nalidíxico (B.1.3) 0,1 mL
Solução de cloridrato de acriflavina (B.1.4) 0,5 mL
Solução de citrato férrico amoniacal (B.1.5) 1,0 mL
Imediatamente antes do uso, adicionar as quatro soluções (B.1.2 a B.1.5) a cada alíquota de 100 mL
da base (B.1.1).

B.2 Meio de enriquecimento secundário seletivo: caldo Fraser
B.2.1 Base
Digestão enzimática de carne 5,0 g

Digestão enzimática de caseína 5,0 g
Extrato de carne 5,0 g
Extrato de levedura 5,0 g

Di-hidrogenofosfato de potássio 1,35 g
Esculina 1,0 g
Cloreto de lítio 3,0 g
Água 1 000 mL
Dissolver os componentes ou o meio completo desidratado na água, aquecendo, se necessário.
Ajustar o pH, se necessário, para que, após a esterilização, esteja 7,2 ± 0,2, a 25 °C.
Verter o meio em tubos de ensaio com capacidade adequada para obter alíquotas apropriadas para
o ensaio.
Esterilizar por 15 min na autoclave a 121 °C.
B.2.2 Solução de cloridrato de acriflavina
Ver B.1.4.
B.2.3 Solução de citrato férrico amoniacal
Ver B.1.5.
B.2.4 Meio completo
Imediatamente antes da utilização, adicionar, a cada tubo (volumes de 10 mL) de base (B.2.1), 0,1 mL
das soluções de B.2.2 e B.2.3. Misturar suavemente.

B.3 Ágar Listeria, segundo Ottaviani e Agosti [16], [17]
B.3.1 Meio-base
Digestão enzimática de carne 18 g

Digestão enzimática de caseína 6 g
Extrato de levedura 10 g
Piruvato de sódio 2 g

Glicose 2 g
Glicerofosfato de magnésio 1 g
Sulfato de magnésio (anidro) 0,5 g
Cloreto de sódio 5 g
Cloreto de lítio 10 g
Hidrogenofosfato dissódico (anidro) 2,5 g
5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glicopiranosídeo 0,05 g
Ágar 12 g a 18 g a
Água 930 mL b
a Dependendo da força de gel do ágar.
b 925 mL, se a solução de anfotericina B for utilizada (ver B.3.5.2).
Dissolver os componentes desidratados ou a base completa desidratada na água, fervendo.
Esterilizar por 15 min na autoclave, a 121 °C.
Ajustar o pH, se necessário, para que, após a esterilização, esteja 7,2 ± 0,2.
B.3.2 Solução de ácido nalidíxico

Hidróxido de sódio (0,05 mol/L) 5 mL
Dissolver o sal sódico de ácido nalidíxico em 5 mL de hidróxido de sódio e esterilizar por filtração em
uma membrana de 0,45 µm.
B.3.3 Solução de ceftazidima
Ceftazidima 0,02 g
Água 5 mL
Dissolver a ceftazidima em 5 mL de água e esterilizar por filtração em uma membrana de 0,45 μm.

B.3.4 Solução de polimixina B
Sulfato de polimixina 76 700 IU

Água 5 mL
Dissolver a polimixina B em 5 mL de água. Esterilizar por filtração em uma membrana de 0,45 μm.
B.3.5 Suplemento antibiótico

B.3.5.1 Solução de ciclo-heximida
Ciclo-heximida 0,05 g
Etanol 2,5 mL
Água 2,5 mL
Dissolver a ciclo-heximida em 2,5 mL de etanol e depois adicionar 2,5 mL de água. Esterilizar por
filtração em uma membrana de 0,45 μm.
B.3.5.2 Solução de anfotericina B (como alternativa à solução de ciclo-heximida)
Anfotericina B 0,01 g
HCl (1 mol/L) 2,5 mL
Dimetilformamida (DMF) 7,5 mL
Dissolver a anfotericina na solução de HCl/DMF. Esterilizar por filtração em uma membrana de 0,45 μm.
Outras técnicas de dissolução (por exemplo, em água ou em base de meio quente) podem ser
realizadas de acordo com fornecedores de meios.
ADVERTÊNCIA – A solução de HCl/DMF é tóxica, manusear com cuidado.
B.3.6 Suplemento
Dissolver 2 g de L-α-fosfatidilinositol 1 em 50 mL de água.
Podem ser utilizados 2 g de lecitina de soja contendo pelo menos 9 % a 15 % de fosfatidilinositol não
fracionado, em vez de L-α-fosfatidilinositol. [6], [9], [19]
Agitar durante cerca de 30 min até obter uma suspensão homogênea. Autoclavar a 121 °C por 15 min
e arrefecer entre 47 °C e 50 °C.
1 O P 6636 fornecido pela Sigma é um exemplo de um produto adequado disponível comercialmente. Esta
informação é dada para a conveniência dos usuários deste documento e não constitui um endosso pela ABNT
a este produto.

B.3.7 Meio completo
Meio-base (B.3.1) 930 mL a

Solução de ácido nalidíxico (B.3.2) 5 mL
Solução de ceftazidima (B.3.3) 5 mL
Solução de polimixina B (B.3.4) 5 mL
Solução de ciclo-heximida (B.3.5.1) 5 mL

ou solução de anfotericina B (B.3.5.2) 10 mL
Suplemento (B.3.6) 50 mL
a 925 mL, se a solução de anfotericina B for usada.
Adicionar as soluções à base fundida entre 47 °C e 50 °C (6.4), misturando completamente entre cada
adição.
O pH do meio completo deve ser de 7,2 ± 0,2 a 25 °C.
O meio deve ser ligeiramente opalescente e homogêneo.
B.3.7.3 Preparação de placas de ágar
Colocar, em cada placa de Petri, 18 mL a 20 mL do meio completo recém-preparado e depois deixar

solidificar.
B.4 Segundo meio sólido seletivo de plaqueamento

A escolha do segundo meio é deixada a critério do laboratório de ensaio. Se um meio comercial for
usado, seguir as instruções do fabricante quanto à sua preparação e uso.
B.5 Teste de desempenho para a garantia da qualidade dos meios de cultura

O teste de desempenho dos meios de cultura deve ser realizado em conformidade com a ISO 11133,
que inclui definições de produtividade, seletividade e especificidade. A Tabela B.1 fornece detalhes das
cepas de controle a serem usadas para testes de desempenho dos meios de cultura especificados
neste documento.
Para o segundo meio de isolamento, usar o teste de desempenho fornecido na ISO 11133
ou de acordo com as especificações do fabricante.
NOTA Para ensaios de produtividade, no caso de detecção de Listeria spp., pode ser informativo adicionar
outra cepa de controle (de outra espécie de Listeria).

Tabela B.1 – Teste de desempenho de meios de cultura para Listeria monocytogenes

Reações
características
Números Meios de Método de
Meiosa Função Incubação Cepas de controle Critério do
WDCMc referência controle
microrganismo-
alvo
Listeria
00021b
monocytogenes 4b
00012
+ Escherichia colid > 10
ou 00013
+ Enterococcus 00009 colônias

Colônias azul-
faecalisd ou 00087 em ágar
Produtividade – Qualitativo esverdeadas
Listeria Listeria, segundo
00109 com halo opaco
monocytogenes 1/2a Ottaviani e
Demi- (25 ± 1) h/ + Escherichia 00012
Agosti
Fraser (30 ± 1) °C colid ou 00013
+ Enterococcus 00009
faecalisd ou 00087
Escherichia 00012 Inibição total (0)
– Qualitativo –
colid ou 00013 em TSA
< 100 colônias
Seletividade em TSA
Enterococcus 00009
– Qualitativo –
faecalisd ou 00087 < 100 colônias
no TSA
Listeria
00021b
monocytogenes 4b
00012
+ Escherichia colid > 10
ou 00013
+ Enterococcus 00009 colônias
Colônias azul-
faecalisd ou 00087 em ágar
Produtividade – Qualitativo esverdeadas
Listeria
00109 Listeria, segundo com halo opaco
(24 ± 2) h/ monocytogenes 1/2a
Fraser Ottaviani e
(37 ± 1) °C 00012
+ Escherichia colid Agosti
ou 00013
+ Enterococcus 00009
faecalisd ou 00087
Escherichia 00012 Inibição total (0)
– Qualitativo –
colid ou 00013 em TSA
Seletividade
Enterococcus 00009 < 100 colônias
– Qualitativo –
faecalisd ou 00087 no TSA
Listeria
Produtividade 00021b Colônias azul-
monocytogenes 4b Bom cresci-
– Qualitativo esverdeadas
Listeria mento (2)
Ágar Seletividade 00109 com halo opaco
monocytogenes 1/2a
Listeria, 00012
(48 ± 4) h/ Escherichia colid
segundo ou 00013
(37 ± 1) °C – Qualitativo Inibição total (0) –
Ottaviani Enterococcus 00009
e Agosti Especificidade faecalisd ou 00087

Colônias azul-
Listeria innocua 00017 – Qualitativo – esverdeadas
sem halo opaco
a Nomes completos de termos abreviados dos meios.
b Cepas a serem usadas, no mínimo.
c Consultar o catálogo de cepas de referência, disponível em www.wfcc.info, para obter informações sobre os números das cepas da coleção de cultura e
detalhes de contato.
d Cepas livres de escolha; uma das cepas, no mínimo, tem que ser usada.

B.6 Solução de peróxido de hidrogênio

Usar uma fração mássica de 3 %, ou seja, 10 volumes de solução.
B.7 Ágar-motilidade
B.7.1 Composição
Digestão enzimática de caseína 20,0 g 20,0 g

Digestão enzimática de carne 6,1 g 6,1 g

Ágar 3,5 g
Água 1 000 mL
B.7.2 Preparação
Dissolver os componentes na água por fervura.
Verter o meio em tubos, em quantidades de cerca de 5 mL.
B.8 Ágar sangue
B.8.1 Base

Fígado digerido 2,5 g
Ágar 9 g a 18 g a
Água 1 000 mL
Dissolver os componentes na água por fervura.
Verter o meio em frascos com capacidade adequada para obter alíquotas apropriadas para o ensaio.

B.8.2 Sangue desfibrinado (ovelha, bezerro ou bovino)
B.8.3 Meio completo
Base (B.8.1) 100 mL

Sangue desfibrinado (B.8.2) 5 mL a 7 mL
Adicionar o sangue à base previamente arrefecida entre 47 °C e 50 °C (6.4). Misturar bem.
Verter o meio em placas de Petri estéreis, em alíquotas apropriadas para o ensaio. Deixar solidificar.
B.9 Solução salina tamponada com fosfato (PBS)
B.9.1 Composição

Fosfato de sódio di-hidrogenado 2,71 g
Água 1 000 mL
B.9.2 Preparação
Dissolver os componentes na água.
Esterilizar na autoclave por 15 min, a 121 °C.
B.10 Suspensão de glóbulos vermelhos

Manter os glóbulos vermelhos do sangue a 5 °C ± 2 °C, antes de usar.
Antes de usar, examinar os sinais de hemólise (vermelhidão) na camada superior do soro. Se não tiver
havido hemólise, introduzir 2 mL dos glóbulos sanguíneos da camada inferior em 98 mL de tampão
PBS (B.9).
Se a hemólise tiver ocorrido, suspender aproximadamente 4 mL da camada de glóbulos vermelhos

do sangue em 10 mL de tampão PBS, misturar suavemente e depois centrifugar. Se o líquido
sobrenadante ficar nitidamente vermelho, devido à hemólise significativa, não usar a suspensão-
estoque e descartá-la. Caso contrário, decantar o líquido sobrenadante e adicionar 2 mL desta solução
de glóbulos vermelhos a 98 mL de tampão PBS. Manter a suspensão durante cinco dias, a 5 °C ± 2 °C.
Descartar se ocorrer hemólise.

B.11 Meio de CAMP test (Christie, Atkins, Munch-Petersen) e cepas-teste
B.11.1 Generalidades
Placas de ágar sangue (B.8) podem ser usadas para este ensaio, mas é preferível usar placas de ágar
de dupla camada, com uma camada muito fina de sangue (B.11.4).
B.11.2 Base
Ver B.8.1.
B.11.3 Meio sangue
Ver B.8.3.
B.11.4 Meio completo
Verter a base (B.11.2) em placas de Petri estéreis em quantidades de cerca de 10 mL e deixar solidificar.
Verter uma camada muito fina do meio sangue (B.11.3), usando quantidades não superiores a 3 mL
por placa.
Deixar solidificar. Se o meio sangue for adicionado a placas contendo a base que foi preparada
antecipadamente, pode ser necessário aquecer as placas por 20 min, colocando-as em uma estufa
a 37 °C antes de verter a camada de meio sangue.
B.12 Caldo-base de utilização de carboidratos (L-ramnose e D-xilose)
B.12.1 Base

Extrato de carne 1 g
Roxo de bromocresol 0,02 g
Água 1 000 mL
Dissolver os componentes na água, aquecendo, se necessário.
Verter o meio em tubos com capacidade adequada para obter alíquotas apropriadas para o ensaio.

B.12.2 Soluções de carboidratos
Carboidrato a 5 g
Água 100 mL
a L-ramnose ou D-xilose.
Dissolver os componentes na água e esterilizar por filtração em uma membrana de 0,45 μm.
B.12.3 Meio completo
Para cada carboidrato, adicionar assepticamente x mL da solução B.12.2 a 9x mL da base (B.12.1).
B.13 Reagentes para reação Voges-Proskauer (VP)
B.13.1 Meio VP

Glicose 5 g
Água 1 000 mL
Dissolver os componentes na água, aquecendo, se necessário.
Ajustar o pH, se necessário, para que, após a esterilização, esteja 6,9 ± 0,2, a 25 ° C.
Verter o meio em tubos em quantidades de 3 mL.
NOTA Formulações pré-preparadas, comercialmente disponíveis, com um pH 6,9, dentro de uma faixa
de 0,5 unidade de pH, são aceitáveis.
B.13.2 Solução etanólica, α-naftol
α-naftol 5 g
Etanol, 96 % (fração volumétrica) 100 mL

Dissolver o α-naftol no etanol.
ADVERTÊNCIA – O α-naftol é tóxico, manusear com cuidado.
B.13.3 Solução de hidróxido de potássio
Hidróxido de potássio 40 g

Água 100 mL
Dissolver o hidróxido de potássio na água.
B.14 Ágar triptona de soja extrato de levedura (TSYEA)
B.14.1 Composição
Digestão enzimática de caseína 17 g

Digerido de farelo de soja por papaína 3 g
Glicose 2,5 g
Hidrogenofosfato dipotássico 2,5 g
Ágar 12 g a 18 g a
Água 1 000 mL
B.14.2 Preparação
Dissolver os componentes desidratados ou o meio completo desidratado na água, por fervura.
B.14.2.1 Preparação de placas de ágar
Verter, em cada placa de Petri, 18 mL a 20 mL do meio completo recém-preparado e depois deixar

solidificar.

Anexo C
(informativo)
Distinção de Listeria spp., de outros gêneros
Tabela C.1 – Distinção de Listeria spp. de outros gêneros ou espécies bacterianas

Grama Motilidade Crescimento

Catalase Teste VP
aparência (20 °C a 25 °C) a 37 °C
Listeria spp. Gpb/Gpcb + + + +
Grande portador
Bacillus spp. a de esporos Gpb b + V V +
(cultura jovem)
Carnobacterium spp. a Gpb – – – +
Staphylococcus spp. a Gpc + – V +
Streptococcus spp. a Gpc – – V +
– –
Lactobacillus spp. Gpb – +
(ocasional +) (ocasional +)
Brochothrix spp. Gpb + – + –
Kurthia spp. Gpb + + – +
Erysipelothrix spp. Gpb – – – +
–
Corynebacterium spp. Gpb + – +
(ocasional +)
Enterococcus spp. a Gpc – – + +
Cellulosimicrobium funkei a Gpcb + + – +
+
Kocuria kristinae a Gpc + – +
(ocasional –)
Marinilactibacillus
Gpb + + + +
psychrotolerans a,c
Rothia terrae a Gpc + – + +

a Conhecido por crescer em ágar Listeria, segundo Ottaviani e Agosti, e outros meios cromogênicos e, às vezes, formando colônias azuis ou azuladas.
b Bacillus oleronius apresenta uma reação variável à coloração de Gram; a maioria das células aparece como Gram-negativa. [23]
c Distinção de M. psychrotolerans de Listeria spp. pode ser auxiliada por suas diferentes características de colônia em TSYEA (colônias opacas,
pálidas-amareladas, lenticulares, com 2 mm a 3 mm de diâmetro, após 24 h de incubação a 37 °C). [23]
Gpb: Bacilo Gram positivo
Gpcb: cocobacilo Gram positivo
GPC: cocos Gram positivos ou cocoides
V: reação variável
NOTA 1 Algumas novas espécies de Listeria recentemente isoladas podem não corresponder a este esquema, em particular para a motilidade,
teste de VP e crescimento a 37 °C (ver, por exemplo, Referências [5], [10], [12], [14], [25], [26] e [27]).
NOTA 2 Algumas cepas raras de Listeria são lentas ou não catalase positivas.

Anexo D
(informativo)
Reações para a identificação de espécies de Listeria
Tabela D.1 – Principais testes prescritos neste documento (ver 9.5)

Produção de ácido CAMP test

Espécies PI-PLC β-hemólise
L-ramnose D-xilose Manitol S. aureus R. equi
L. monocytogenes + (24 h) + + – – + –
L. innocua – – V – – – –
L. ivanovii + (24 h a 48 h) + – + – – +
L. seeligeri – (+) – + – (+) –
L. welshimeri – – V + – – –
L. grayi – – V – + – –
L. fleischmanii – – + + + – –
L. marthii – – – – + – –
L. rocourtiae – – + + + – –
L. weihenstephanensis – – + + – – –
PI-PLC: fosfatidilinositol fosfolipase C
V: reação variável
(+): reação fraca
+: mais de 90 % das reações positivas
–: sem reação
NOTA 1 Existem cepas raras de L. monocytogenes que não mostram β-hemólise ou uma reação positiva ao CAMP test sob
as condições descritas neste documento.
NOTA 2 Algumas cepas de L. seeligeri podem dar os mesmos resultados de hemólise que L. monocytogenes.
NOTA 3 Algumas novas espécies de Listeria foram isoladas recentemente. Testes adicionais podem ser necessários para
identificá-los com precisão. [5], [10], [12], [14], [25], [26], [27]
NOTA 4 Algumas cepas atípicas de L. innocua apresentaram características fenotípicas de L. monocytogenes e só puderam ser
distinguidas por um Laboratório de Referência. [11]
NOTA 5 Existem cepas raras de L. monocytogenes que não fermentam L-ramnose. [15], [18]

Tabela D.2 – Reações adicionais para a identificação de espéciese de Listeria
30
Motilidade Esculina CAMP test
Gênero e espécie Catalase PI-PLC a Manitol β-hemólise Rhodococcus Staphylococcus DIM a MAN DAR XYL RHA MDG RIB G1P TAG
(22 a 30 °C) (β-glucosidase)
equi aureus
L. fleischmannii
subsp. + – + – + – – – – – + + + + – – –
coloradensis
L. fleischmannii
+ – + – + – – – – – + + + + – – –
subsp. fleischmannii
L. grayi biovar grayi c + + + – + – – – + + + – (-) Vb + – –
L. grayi biovar
+ + + – + – – – + + + – + V + – –
murrayi c
L. innocua + + + – – – – – + + + – V + – – –
+
L. ivanovii subsp.
+ + + (24 h a – + + – V – + + – + + V –
ivanovii
48 h)
+
L. ivanovii subsp.
+ + + (24 h a – + + – V – + + – + - V –
londoniensis
48 h)
L. marthii + + + – – – – – – + + – – + – – –
+
+
L. monocytogenes + + + – (24 h a – + – + + – +d + – – –
(24 h)
72 h)
+
L. rocourtiae + + – + – – – – + – + + + + – –
fraca
L. seeligeri + + + – – + – + + – + + – + – – –
L. +
+ + – – – – – – – + + + + + – –
weihenstephanensis fraca
L. welshimeri + + + – – – – – (+) + + + V + – – +
a PI-PLC: fosfatidilinositol fosfolipase C; DIM: D-arilamidase; HOMEM: alfa-manosidase; DAR: D-arabitol; XYL: D-xilose; RHA: L-ramnose; ODM: alfa-metil-D-glicosídeo; RIB: D-ribose; GIP: glicose-I-fosfato; TAG:
D-Tagatose.
b V: variável; + ou –: a maioria das cepas é positiva ou negativa; (+) ou (–): 90 % de reações positivas ou negativas.
c grayi biovar é negativo para nitrato e turanose, embora murrayi biovar seja positivo para nitrato e turanose.
d Existem variedades raras de ramnose negativa, que pertencem à linhagem IIIB/IIIC.
e Fonte: Centro Nacional de Referência/Centro Colaborador da OMS para Listeria, Institut Pasteur, Paris.
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Anexo E
(informativo)
Ágares seletivos de Listeria
A detecção de Listeria spp. baseia-se na clivagem dos conjugados X-β-D-glucósido pela β-D-glicosidase,
uma enzima que é comum a todas as Listeria spp. No entanto, a detecção de L. monocytogenes
e L. ivanovii patogênica é baseada na detecção de atividade de lecitinase (fosfatidilcolina fosfolipase

C – PCPLC) e/ou fosfatidilinositol fosfolipase C (PIPLC).
Tabela E.1 – Ágares comerciais não seletivos de Listeria (extraído da Referência [7])
Cloreto Polimixina (P) Sistema de
Acriflavina Outros Referências
de lítio ou colistina (C) indicação a
(g/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L)

Ágares que não diferenciam Listeria spp.
Meio Arlequim Fosfomicina 5,
Smith et al.,
Listeria 15 C10 2,5 cefotetan 1, CHEg + Fe
2000
ciclo-heximida 200
Cloreto de Moxalactama 20, Lee e
lítio feniletanol Henry
5 0 0 glicerina anídrica 10, McCain,
moxalactama
(LPM) feniletanol 2500 1986
Fosfomicina 10,
Curtis et al.,
Oxford 15 C20 5 cefotetan 2 Ae + Fe
1989
ciclo-heximida 4009
Oxford Modificado
12 C10 0 Ceftazidima 20 Ae + Fe Cook, 1998
(MOX)
Ae + Fe Van Netten et
PALCAM 10 P10 5 Ceftazidima 30
Mann + PR al., 1989
Ágar que diferenciam as espécies por hemólise
Ágar de hemólise MUG
Cox et al.,
suplementado 10 P10 5 Ceftazidima 30 Sangue de
1991 b
(EHA) ovelha
Ágar-sangue
para Listeria Sangue de Johansson,
10 P10 0 Ceftazidima 20
monocytogenes ovelha 1998
(LMBA)
Ágares específicos para Listeria spp. patogênicas
Adicionar: Anfotericina B 10,
Ágar para Listeria,
Polimixina B: Cromo Ottaviani et
segundo Ottaviani 10 ácido nalidíxico,
76700 U, na PCPLC al., 1997
e Agosti ceftazidima 20
coluna “outros”
a Ae: Esculina; CHEg: CHE-glucosídeo; Cromo: substrato cromogênico; Fe: sal de ferro; Henry: Henry’s (1993). Método de iluminação;
Mann: Manitol; MUG: 4-metilumbeliferil-ß-D-glucosídeo; PR: Vermelho de fenol.

Anexo F
(informativo)
Resultados dos estudos interlaboratoriais para detecção de Listeria

monocytogenes
F.1 Resultados dos estudos interlaboratoriais

Estudos internacionais interlaboratoriais de um total de 17 países foram realizados. Os seguintes tipos
de alimentos foram utilizados nos estudos: salmão defumado a frio, amostras ambientais, saladas
prontas para consumo, fórmula alimentar infantil em pó e queijo. As amostras de alimentos foram
ensaiadas em dois níveis diferentes de contaminação, além de um controle negativo. As amostras
foram contaminadas artificialmente tanto por L. monocytogenes como por L. innocua para amostras
ambientais e queijo, e ambas por L. monocytogenes e L. welshimeri para salmão defumado a frio, que
poderia alterar a sensibilidade. Para amostras ambientais, uma mistura de Staphylococcus epidermidis,
Bacillus cereus e Pseudomonas fragi foi adicionada a cada amostra. Amostras de fórmulas alimentares
infantis em pó foram contaminadas artificialmente apenas por L. monocytogenes.
O estudo foi organizado em 2013 pelo Laboratório de Segurança Alimentar da ANSES, Maisons-Alfort,
França, para salmão defumado a frio, amostras ambientais, saladas prontas para consumo, fórmula
alimentar infantil em pó e por ACTALIA-CECALAIT, Poligny, França, para amostras de queijo,
no âmbito do mandato CEN M381 da Comissão Europeia.
Os valores das características de desempenho derivados dos estudos interlaboratoriais são mostrados
por tipo de amostra nas Tabelas F.1 a F.5. Algumas condições de armazenamento ou adição de uma
mistura bacteriostática em certas matrizes podem ter induzido estresse em L. monocytogenes, que
pode explicar uma menor sensibilidade do que em outras matrizes.
Os estudos interlaboratoriais foram realizados com enriquecimento primário, com duração de 24 h ± 2 h,

mas essa duração foi modificada posteriormente no documento para 25 h ± 1 h. Esta mudança não
tem impacto nas características de desempenho do método, uma vez que foi adotada para permitir
o crescimento de bactérias-alvo para um nível mais alto em caldo de enriquecimento primário.
O número de laboratórios que realizaram enriquecimento primário com menos de 24 h para cada
ensaio foi: três para salmão defumado a frio, dois para amostras ambientais, cinco para saladas
prontas para consumo, uma para fórmula alimentar infantil em pó e seis para queijo.
Tabela F.1 – Resultados da análise dos dados obtidos com salmão defumado a frio
8 UFC / 25 g 74 UFC / 25g
0 UFC/25g
Parâmetro (nível baixo de (nível alto de
(branco)
contaminação) contaminação)
Número de colaboradores participantes 15 15 15
Número de colaboradores mantidos após a avaliação dos
15 15 15
dados
Número de amostras 120 120 120
Número de amostras mantidas após a avaliação dos dados 120 120 120
Sensibilidade em % – 100 100
Especificidade em % 100 – –

Tabela F.2 – Resultados da análise dos dados obtidos com amostras ambientais (compressas
de gaze imersas em diluente)
11 UFC/ 100 UFC/
0 UFC/ compressa de compressa de
Parâmetro compressa de gaze gaze gaze
(branco) (nível baixo de (nível alto de
Número de colaboradores mantidos após a avaliação dos
14a 14a 14a
dados
Número de amostras mantidas após a avaliação dos
112 112 112
dados
Sensibilidade em % – 99,1b 99,1b
a Um laboratório foi excluído por ter recebido amostras abertas (problema durante o transporte).
b Um laboratório (diferente para níveis baixos e níveis altos) detectou L. monocytogenes em sete das oito amostras. De fato, colônias
características de L. monocytogenes foram observadas, mas cobertas por L. innocua: isso não permitiu isolamento e purificação para
confirmação adicional.
Tabela F.3 – Resultados da análise dos dados obtidos com saladas prontas para consumo
(mistura de espinafre fresco e alface americana)
9 UFC /25g 90 UFC / 25g
0 UFC/25g
(branco)
Número de colaboradores mantidos após a avaliação dos dados 16 16 16
Sensibilidade em % – 100 100
Especificidade em % 97,6a – –
a Três falsos positivos foram obtidos em três laboratórios diferentes (um de oito amostras). As possíveis razões podem ser: (i)
contaminação cruzada em nível do organizador, (ii) contaminação cruzada em nível dos laboratórios participantes, (iii) contaminação
muito baixa e heterogênea da matriz, não detectada por ensaios preliminares de detecção, realizados tanto pelo organizador quanto
pelo produtor da amostra, e é improvável que afete os resultados de qualidade do ensaio.
Tabela F.4 – Resultados da análise dos dados obtidos com fórmula alimentar infantil em pó
11 UFC / 25 g 91 UFC / 25g
0 UFC/25g
(branco)
Número de colaboradores mantidos após a avaliação dos dados 16 16 16
Sensibilidade em % – 99,2a 100
a Um laboratório detectou L. monocytogenes em sete de oito amostras.

Tabela F.5 – Resultados da análise dos dados obtidos com queijo (massa de queijo fundido)
7 UFC / 25 g 78 UFC / 25g
0 UFC/25g
(branco)
Número de colaboradores mantidos após a avaliação dos dados 14a 14a 14a

Sensibilidade em % – 91,1b 100
a Um laboratório foi excluído por ter recebido amostras tarde demais.
b Três laboratórios detectaram L. monocytogenes em sete de oito amostras e um laboratório em uma de oito amostras.
F.2 Valores de LOD50 % da literatura

LOD50 % não pôde ser estimado no quadro do estudo interlaboratorial descrito em F.1. Entretanto,
os valores médios de LOD50 % da ISO 11290-1:1996/Amd.1:2004, disponíveis nos estudos de validação
da AFNOR de métodos comerciais alternativos, de acordo com a ISO 16140:2003 2, são apresentados
na Tabela F.6 para várias categorias de alimentos ou amostras ambientais. Considera-se que
as modificações técnicas deste documento não têm impacto significativo sobre esses valores
para LOD50 %.
Tabela F.6 – LOD50 % (UFC/25g ou 25 mL)

Produtos de carne Produtos
Produtos Amostras
Patês de frutos do Vegetais
Parâmetro Carne moída lácteos ambientais
(n = 19) mar (n = 22)
(n = 2) (n = 23) (n = 22)
(n = 22)
Média 0,6 1 0,5 0,6 0, 6 0,5
Desvio-padrão 0,2 0,9 0,2 0,2 0,2 0,1
Valores
0,2 a 1,0 0,4 a 1,7 0,1 a1,3 0,3 a 1,2 0,1 to 0,9 0,3 a 0,8
extremos
NOTA Ver a Referência [20].
2 Norma cancelada.

Tabela F.7 – Relatórios de validação do AFNOR fornecendo valores de LOD50 % [20]

Referência do Relatório AFNOR
Método de origem
(número do certificado/data de publicação)
AES 10/3 – 09/00
ALOA One Day
20 de dezembro de 2012
AES 10/8 – 12/09
ADIAFOOD Listeria monocytogenes
agosto de 2010
TRA 02/11–03/08
Transia Plate Listeria monocytogenes
2008 v01
ChromIDTM Lmono Agar BIO 12/31–05/11

BIO 12/24–03/08,
ChromIDTM Ottaviani Agosti Agar
9 de fevereiro de 2012
BIO 12/09–07/02
Vidas Listeria monocytogenes 2 (30 °C)
2007 v01
BIO 12/11–03/04
Vidas Listeria monocytogenes 2 (37 °C)
2013 v01
BIO 12/18–03/06
Vidas Listeria DUO
2006 v01
BIO 12/27–02/10
VIDAS Listeria monocytogenes Xpress
2012 v01
BRD 07/04–09/98
Rapid L'Mono (detecção)
2010 v01
BRD 07/10 – 04/05
IQ Check Listeria monocytogenes II
2013 v01
BRD 07/16 – 01/09,
AL/ágar detecção
2013
CHR 21/1 – 12/01
CHROMágar™ Listeria
7 de outubro de 2013
EUR 15/03 −12/05
Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes
fevereiro de 2010
BIO 12/4 - 02/95
Accuprobe Listeria monocytogenes
ABI 29/05–12/11
MicroSEQ Listeria monocytogenes 5 dezembro 2011
5 de dezembro de 2011
UNI 03/04–04/05
Listeria Precis™
UNI 03/08–11/13
ThermoScientific SureTect PCR Assay
28 de novembro de 2013
QUA 18/05 – 07/08
BAX ® Listeria mono 24E
9 de julho de 2012
GEN 25/08–07/10
GeneDisc Listeria monocytogenes
31 de março de 2011
BKR 23/02 – 11/02
Compass Listeria ágar (detecção)
28 de junho de 2013

Bibliografia
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[28] ISO 17468, Microbiology of the food chain – Technical requirements and guidance on establishment
or revision of a standardized reference method

[29] Gnanou Besse N., Favret S., Desreumaux J., Decourseulles Brasseur E., Kalmokoff M. Evaluation
of reduction of Fraser incubation by 24h in the EN ISO 11290-1 standard on detection and diversity
of Listeria species. Int. J. Food Microbiol. 2016, 224 pp. 16–21
[30] ISO 16140:2003 3 Microbiology of food and animal feeding stuffs –– Protocol for the validation of
alternative methods
NOTA BRASILEIRA A ISO 16140:2003 foi revisada e substituída pelas ISO 16140-1:2016
e ISO 16140-2:2016.
3 Norma cancelada.

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NORMA ABNT NBR

Microbiologia da cadeia produtiva de alimentos

ICS 07.100.30 ISBN 978-65-5659-046-2

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Anexo B (normativo) Composição e preparação de meios de cultura e reagentes....................16

iv © ISO 2017 - © ABNT 2020 - Todos os direitos reservados

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B.8.3 Meio completo...................................................................................................................24

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Anexo E (informativo) Ágares seletivos de Listeria........................................................................31

Figura 1 – Inoculação e interpretação de placas de CAMP test.................................................... 11

vi © ISO 2017 - © ABNT 2020 - Todos os direitos reservados

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A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Foro Nacional de Normalização. As Normas

Os Documentos Técnicos internacionais adotados são elaborados conforme as regras da

O Escopo em inglês da ABNT NBR ISO 11290-1 é o seguinte:

—— the detection of L. monocytogenes, and

—— the detection of Listeria spp. (including L. monocytogenes).

This document is applicable to

—— environmental samples in the area of food production and food handling.

© ISO 2017 - © ABNT 2020 - Todos os direitos reservados vii

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As principais alterações, listadas no Prefácio, introduzidas neste documento, em comparação

viii © ISO 2017 - © ABNT 2020 - Todos os direitos reservados

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Microbiologia da cadeia produtiva de alimentos — Método horizontal para

ADVERTÊNCIA – A fim de salvaguardar a saúde da equipe de laboratório, é essencial que

—— detecção de Listeria spp. (incluindo L. monocytogenes).

Este documento é aplicável a

—— produtos destinados ao consumo humano e animal, e

—— amostras ambientais na área de produção de alimentos e manipulação de alimentos.

© ISO 2017 - © ABNT 2020 - Todos os direitos reservados 1

ABNT NBR ISO 11290-1:2020

—— ISO Online browsing platform: disponível em http://www.iso.org/obp

—— IEC Electropedia: disponível em http://www.electropedia.org/”

2 © ISO 2017 - © ABNT 2020 - Todos os direitos reservados

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4.2 Enriquecimento primário em meio de enriquecimento líquido seletivo com

Inoculação de um meio de enriquecimento primário seletivo contendo metade das concentrações

Incubação da suspensão inicial a 30 °C, por 24 h a 26 h.

4.3 Enriquecimento secundário com meio de enriquecimento líquido seletivo com

Inoculação de meio de enriquecimento líquido secundário de concentração completa (caldo Fraser),

Incubação do caldo Fraser a 37 °C, por 24 h. [29]

4.4 Plaqueamento e identificação

Isolar as colônias presuntivas de L. monocytogenes ou Listeria spp., plaqueadas conforme descrito

5 Meios de cultura e reagentes

A composição e o teste de desempenho de meios de cultura e reagentes e sua preparação estão

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ABNT NBR ISO 11290-1:2020

Conforme especificado na ABNT NBR ISO 7218.

6.2 Estufa de secagem ou incubadora, capaz de ser mantida entre 25 °C e 50 °C.

6.3 Incubadoras, capazes de operar a 30 °C ± 1 ° C, 37 °C ± 1 ° C e 25 °C ± 1 °C (opcional).

6.4 Banho-maria, capaz de operar entre 47 °C e 50 °C.

6.5 Alças estéreis com aproximadamente 3 mm de diâmetro ou 10 µL e agulha de inoculação

6.7 Pipetas graduadas ou pipetas automáticas, com capacidades nominais de 1 mL e 10 mL.

6.8 Placas de Petri, por exemplo, com diâmetro de 90 mm.