NBR Iso 6579

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NORMA ABNT NBR

BRASILEIRA ISO
6579
Primeira edição
19.05.2014
Válida a partir de
19.06.2014
Microbiologia de alimentos para consumo

humano e animal — Método horizontal para a
detecção de Salmonella spp.
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the
detection of Salmonella spp.
ICS 07.100.30 ISBN 978-85-07-04975-3
Número de referência
ABNT NBR ISO 6579:2014
35 páginas
© ISO 2002 - © ABNT 2014


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Sumário Página
Prefácio Nacional ...............................................................................................................................iv

1 Escopo ................................................................................................................................1
2 Referências normativas .....................................................................................................1
3 Termos e definições ...........................................................................................................2
4 Princípio ..............................................................................................................................2
4.1 Geral ....................................................................................................................................2
4.2 Pré-enriquecimento em meio não seletivo líquido..........................................................2

4.3 Enriquecimento em meios líquidos seletivos..................................................................2
4.4 Plaqueamento e identificação ...........................................................................................2
4.5 Confirmação da identidade ...............................................................................................3
5 Meios de cultura, reagentes e soros ................................................................................3
5.1 Geral ....................................................................................................................................3
5.2 Meios de cultura e reagentes ............................................................................................3
5.2.1 Meio de pré-enriquecimento não seletivo: água peptonada tamponada ......................3
5.2.2 Primeiro meio de enriquecimento seletivo: Meio Rappaport-Vassiliadis com soja
(caldo RVS) .........................................................................................................................3
5.2.3 Segundo meio de enriquecimento seletivo: Caldo Muller-Kauffmann tetrationato
novobiocina (caldo MKTTn) ..............................................................................................3
5.2.4 Meio seletivo sólido para plaqueamento .........................................................................3
5.2.5 Ágar Nutriente ....................................................................................................................3
5.2.6 Ágar triplo açúcar/ferro (ágar TSI) ....................................................................................3
5.2.7 Ágar ureia (Christensen) ...................................................................................................4
5.2.8 Meio L-Lisina de descarboxilação ...................................................................................4
5.2.9 Reagente para a detecção de β-galactosidase (ou discos de papel preparados,
utilizados de acordo com as instruções do fabricante) ........................................................4
5.2.10 Reagentes para reação de Voges-Proskauer (VP) ...........................................................4
5.2.11 Reagentes para a reação de indol ....................................................................................4
5.2.12 Ágar nutriente semissólido ..............................................................................................4
5.2.13 Solução salina fisiológica .................................................................................................4
5.3 Soros ...................................................................................................................................4
6 Aparelhagem e vidraria......................................................................................................4
7 Amostragem .......................................................................................................................5
8 Preparação da amostra para análise ................................................................................5
9 Procedimento (ver diagrama no Anexo A) ..........................................................................5
9.1 Alíquota de ensaio e suspensão inicial ...........................................................................5
9.1.1 Geral ....................................................................................................................................5
9.1.2 Preparações específicas da suspensão inicial para determinados alimentos para
consumo humano ..............................................................................................................6
9.2 Pré-enriquecimento não seletivo ......................................................................................6
9.3 Enriquecimento seletivo ....................................................................................................6
9.4 Plaqueamento e identificação ...........................................................................................6
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9.5 Confirmação .......................................................................................................................7

9.5.1 Geral ....................................................................................................................................7
9.5.2 Seleção das colônias para a confirmação .......................................................................7
9.5.3 Confirmação bioquímica ...................................................................................................7
9.5.4 Confirmação sorológica e sorotipagem ...........................................................................9
9.5.5 Interpretação de reações bioquímicas e sorológicas ...................................................11
9.5.6 Confirmação definitiva .....................................................................................................11
10 Expressão dos resultados...............................................................................................11
11 Relatório de ensaio ..........................................................................................................11

12 Garantia da qualidade ......................................................................................................12
Bibliografia .........................................................................................................................................35
Anexos
Anexo A (normativo) Diagrama do processo ...................................................................................13
Anexo B (normativo) Composição e preparação de meios de cultura e reagentes .....................14
B.1 Água peptonada tamponada ...........................................................................................14
B.1.1 Composição ......................................................................................................................14
B.1.2 Preparação ........................................................................................................................14
B.2 Meio de Rappaport-Vassiliadis com soja (caldo RVS) ..................................................14
B.2.1 Solução A ..........................................................................................................................14
B.2.1.1 Composição ......................................................................................................................14
B.2.1.2 Preparação ........................................................................................................................15
B.2.2 Solução B ..........................................................................................................................15
B.2.2.1 Composição ......................................................................................................................15
B.2.2.2 Preparação ........................................................................................................................15
B.2.3 Solução C ..........................................................................................................................15
B.2.3.1 Composição ......................................................................................................................15
B.2.3.2 Preparação ........................................................................................................................15
B.2.4 Meio completo ..................................................................................................................15
B.2.4.1 Composição ......................................................................................................................15
B.2.4.2 Preparação ........................................................................................................................15
B.3 Caldo Muller-Kauffmann tetrationato-novobiocina (MKTTn) [7] ...................................16
B.3.1 Meio base ..........................................................................................................................16
B.3.1.1 Composição ......................................................................................................................16
B.3.1.2 Preparação ........................................................................................................................16
B.3.2 Solução de iodeto de iodo...............................................................................................16
B.3.2.1 Composição ......................................................................................................................16
B.3.2.2 Preparação ........................................................................................................................16
B.3.3 Solução de novobiocina .................................................................................................17
B.3.3.1 Composição ......................................................................................................................17
B.3.3.2 Preparação ........................................................................................................................17
B.3.4 Meio completo ..................................................................................................................17
B.3.4.1 Composição ......................................................................................................................17
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B.3.4.2 Preparação ........................................................................................................................17

B.4 Ágar xilose lisina desoxicolato (ágar XLD) [7]................................................................17
B.4.1 Meio base .........................................................................................................................17
B.4.1.1 Composição ......................................................................................................................17
B.4.1.2 Preparação ........................................................................................................................18
B.4.2 Preparação das placas de ágar.......................................................................................18
B.5 Ágar nutriente ...................................................................................................................18
B.5.1 Composição ......................................................................................................................18
B.5.2 Preparação ........................................................................................................................18

B.5.3 Preparação de placas de ágar nutriente ........................................................................18
B.6 Ágar triplo açúcar/ferro (Triple sugar/iron agar) (ágar TSI) ..........................................19
B.6.1 Composição ......................................................................................................................19
B.6.2 Preparação ........................................................................................................................19
B.7 Ágar ureia (Christensen) .................................................................................................19
B.7.1 Meio base .........................................................................................................................19
B.7.1.1 Composição ......................................................................................................................19
B.7.1.2 Preparação ........................................................................................................................20
B.7.2 Solução de ureia ..............................................................................................................20
B.7.2.1 Composição ......................................................................................................................20
B.7.2.2 Preparação ........................................................................................................................20
B.7.3 Meio completo ..................................................................................................................20
B.7.3.1 Composição ......................................................................................................................20
B.7.3.2 Preparação ........................................................................................................................20
B.8 Meio de descarboxilação de L-Lisina .............................................................................20
B.8.1 Composição ......................................................................................................................20
B.8.2 Preparação ........................................................................................................................21
B.9 Reagente de β-galactosidase ..........................................................................................21
B.9.1 Solução-tampão ...............................................................................................................21
B.9.1.1 Composição ......................................................................................................................21
B.9.1.2 Preparação ........................................................................................................................21
B.9.2 Solução ONPG ..................................................................................................................21
B.9.2.1 Composição ......................................................................................................................21
B.9.2.2 Preparação ........................................................................................................................21
B.9.3 Reagente completo ..........................................................................................................21
B.9.3.1 Composição ......................................................................................................................21
B.9.3.2 Preparação ........................................................................................................................22
B.10 Reagentes para reação Voges-Proskauer (VP) ..............................................................22
B.10.1 Meio VP ..............................................................................................................................22
B.10.1.1 Composição ......................................................................................................................22
B.10.1.2 Preparação ........................................................................................................................22
B.10.2 Solução de creatina (N-amidinosarcosina) ....................................................................22
B.10.2.1 Composição ......................................................................................................................22
B.10.2.2 Preparação ........................................................................................................................22
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B.10.3 Solução de solução etanólica de 1-naftol ......................................................................22

B.10.3.1 Composição ......................................................................................................................22
B.10.3.2 Preparação ........................................................................................................................22
B.10.4 Solução de hidróxido de potássio ..................................................................................23
B.10.4.1 Composição ......................................................................................................................23
B.10.4.2 Preparação ........................................................................................................................23
B.11 Reagentes para reação de indol .....................................................................................23
B.11.1 Meio triptona/triptofano ...................................................................................................23
B.11.1.1 Composição ......................................................................................................................23

B.11.1.2 Preparação ........................................................................................................................23
B.11.2 Reagente Kovacs .............................................................................................................23
B.11.2.1 Composição ......................................................................................................................23
B.11.2.2 Preparação ........................................................................................................................23
B.12 Ágar nutriente semissólido .............................................................................................24
B.12.1 Composição ......................................................................................................................24
B.12.2 Preparação ........................................................................................................................24
B.12.3 Preparação de placas de ágar.........................................................................................24
B.13 Solução salina fisiológica ...............................................................................................24
B.13.1 Composição ......................................................................................................................24
B.13.2 Preparação ........................................................................................................................24
Anexo C (informativo) Resultados do ensaio interlaboratorial.......................................................25
Anexo D (normativo) Detecção de Salmonella spp. em amostras ambientais e de fezes
de animais na produção primária ...................................................................................28
D.1 Introdução .........................................................................................................................28
D.2 Princípio ............................................................................................................................28
D.2.1 Geral ..................................................................................................................................28
D.2.2 Pré-enriquecimento em meio líquido não seletivo........................................................28
D.2.3 Enriquecimento em meio semi-sólido seletivo .............................................................29
D.2.4 Plaqueamento seletivo e identificação...........................................................................29
D.2.5 Confirmação da identidade .............................................................................................29
D.3 Meios de cultura, reagentes e soros ..............................................................................29
D.3.1 Geral ..................................................................................................................................29
D.3.2 Meio Rappaport-Vassiliadis modificado semissólido (MSRV) .....................................30
D.3.2.1 Meio base ..........................................................................................................................30
D.3.2.2 Solução de novobiocina ..................................................................................................30
D.3.2.3 Meio completo ..................................................................................................................30
D.4 Aparelhagem e vidrarias..................................................................................................31
D.4.1 alças estéreis, de 1 μL. .....................................................................................................31
D.5 Amostragem .....................................................................................................................31
D.6 Preparação da amostra de ensaio ..................................................................................31
D.7 Procedimento ...................................................................................................................31
D.7.1 Pré-enriquecimento não seletivo ....................................................................................31
D.7.2 Enriquecimento seletivo ..................................................................................................32
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D.7.3 Plaqueamento seletivo.....................................................................................................32

D.7.4 Confirmação .....................................................................................................................33
D.8 Expressão dos resultados...............................................................................................33
D.9 Relatório de ensaio ..........................................................................................................33
D.10 Garantia da qualidade ......................................................................................................33
Tabelas
Tabela 1 – Interpretação dos ensaios bioquímicos ........................................................................10
Tabela 2 – Interpretação dos ensaios confirmatórios ....................................................................11

Tabela C.1 – Resultado da análise dos dados obtidos com amostras de massa fresca
de queijo............................................................................................................................25
Tabela C.2 – Resultado dos dados da análise obtida com amostras de ovo em pó ..................26
Tabela C.3 – Resultado das análises obtidas com amostras de carne de aves crua .................26
Tabela C.4 – Resultados das análises obtidas com materiais de referencia ..............................27
Tabela D.1 – Ensaio de desempenho de MSRV ..............................................................................34
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Prefácio Nacional
A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Foro Nacional de Normalização. As Normas

Brasileiras, cujo conteúdo é de responsabilidade dos Comitês Brasileiros (ABNT/CB), dos Organismos
de Normalização Setorial (ABNT/ONS) e das Comissões de Estudo Especiais (ABNT/CEE), são
elaboradas por Comissões de Estudo (CE), formadas por representantes dos setores envolvidos,
delas fazendo parte: produtores, consumidores e neutros (universidades, laboratórios e outros).
Os Documentos Técnicos ABNT são elaborados conforme as regras da Diretiva ABNT, Parte 2.
A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) chama atenção para a possibilidade de que
alguns dos elementos deste documento podem ser objeto de direito de patente. A ABNT não deve ser
considerada responsável pela identificação de quaisquer direitos de patentes.
A ABNT NBR ISO 6579 foi elaborada pela Comissão de Estudo Especial de Microbiologia
de Alimentos (ABNT/CEE-157). O Projeto circulou em Consulta Nacional conforme Edital nº 03,
de 27.03.2014 a 25.04.2014, com o número de Projeto 157:000.00-008.
Esta Norma é uma adoção idêntica, em conteúdo técnico, estrutura e redação, à ISO 6579:2002,
Cor1:2004 e Amd1:2007, que foi elaborada pelo Technical Committee Food products (ISO/TC 34),
Subcommittee Microbiology, (SC 9), conforme ISO/IEC Guide 21-1:2005.
AVISO A fim de salvaguardar a saúde do pessoal de laboratório, é essencial que os ensaios para
detecção de Salmonella e, especialmente, Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi, sejam realizados
somente em laboratórios devidamente equipados, sob o controle de um microbiologista qualificado,
e que todo cuidado seja tomado no descarte de todos os materiais incubados.
Escopo desta Norma Brasileira em inglês é o seguinte:
Scope
This Standard specifies a horizontal method for the detection of Salmonella, including Salmonella Typhi
and Salmonella Paratyphi.
Subject to the limitations discussed in the Introduction, this Standard is applicable to
— products intended for human consumption and the feeding of animals;
— environmental samples in the area of food production and food handling.
WARNING The method may not recover all Salmonella Typhi and Paratyphi.
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Introdução
Devido à grande variedade de produtos para o consumo humano e animal, este método horizontal
pode não ser adequado, em todos os pormenores, para certos produtos. Nestes casos, métodos
específicos para esses produtos podem ser utilizados, se for absolutamente necessário por razões
técnicas justificadas. No entanto, convém que toda tentativa seja feita para aplicar este método
horizontal, tanto quanto possível.
Quando esta Norma for revisada, será levada em conta toda a informação disponível sobre a aplicação
deste método horizontal e as razões para as alterações do método no caso de produtos específicos.
A harmonização dos métodos de ensaio pode não ser imediata, e para certos grupos de produtos
podem existir Normas Internacionais e/ou Nacionais que não atendam a este método horizontal.
Espera-se que, na revisão de tais normas, sejam feitas alterações em conformidade com esta Norma,
para que, só ocorram diferenças deste método horizontal eventualmente, em produtos específicos
justificáveis por razões técnicas.
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NORMA BRASILEIRA ABNT NBR ISO 6579:2014
Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal — Método

horizontal para a detecção de Salmonella spp.
1 Escopo
Esta Norma especifica um método horizontal para a detecção de Salmonella, incluindo Salmonella
Typhi e Salmonella Paratyphi.
Sujeita às limitações discutidas na Introdução, esta Norma é aplicável a
— produtos destinados ao consumo humano e animal;
— amostras ambientais na área de produção e manipulação de alimentos.
ATENÇÃO – O método pode não recuperar a totalidade de Salmonella Typhi e Paratyphi.
2 Referências normativas
Os documentos normativos a seguir contêm prescrições que, através de referência neste texto,
constituem prescrições para esta Norma. Para referências datadas não são aplicáveis às emendas
subsequentes ou as revisões destas publicações. Entretanto, recomenda-se àqueles que realizam
acordos com base nesta Norma que verifiquem a possibilidade de se utilizarem as edições mais
recentes dos documentos normativos relacionados a seguir. Para referências não datadas aplica-se
a última edição do documento normativo referenciado. A ABNT mantém registros das normas em vigor
em um dado momento.
ABNT NBR ISO 6887-1, Microbiologia de alimentos e de alimentação animal – Preparo de amostras,
da suspensão inicial e das diluições decimais para análise microbiológica – Parte 1: Regras gerais
para preparo da suspensão inicial e das diluições decimais
ISO 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs – General rules for microbiological
examination
NOTA BRASILEIRA A ISO 7218 foi revisada, e uma nova edição foi publicada em 2007, com o seguinte
título Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and guidance for microbiological
examinations. Em 2013 foi publicada uma emenda desta norma (Amd 1:2013).
ISO 8261, Milk and milk products – General guidance for the preparation of test samples, initial
suspensions and decimal dilutions for microbiological examination
NOTA BRASILEIRA A ISO 8261 foi cancelada e substituída pela ISO 6887-5:2010, Microbiology of
food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for
microbiological examination – Part 5: Specific rules for the preparation of milk and milk products.
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation
and production of culture media – Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation
of culture media in the laboratory
ISO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and
production of culture media – Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
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3 Termos e definições
Para os efeitos deste documento, aplicam-se os seguintes termos e definições.
3.1
Salmonella
microrganismos que formam colônias típicas ou menos típicas em meios sólidos seletivos e que
apresentam as características bioquímicas e sorológicas descritas quando os ensaios são realizados
em conformidade com esta Norma
3.2
detecção de Salmonella
determinação da presença ou ausência de Salmonella (3.1) em uma massa ou volume do produto
específico, quando os ensaios são realizados em conformidade com esta Norma
4 Princípio
4.1 Geral
A detecção de Salmonella requer quatro fases sucessivas (ver também o Anexo A).
NOTA A Salmonella pode estar presente em pequenas quantidades e é muitas vezes acompanhada por
números muito maiores de outras Enterobacteriaceae ou outras famílias. Além disso, o pré-enriquecimento
é necessário para permitir a detecção de baixos números de Salmonella ou de Salmonella injuriadas.
4.2 Pré-enriquecimento em meio não seletivo líquido

Água peptona tamponada é inoculada à temperatura ambiente com a alíquota de ensaio, em seguida,
incubada a 37 °C ± 1 °C, por 18 h ± 2 h.
Para certos produtos alimentícios, a utilização de outros processos de pré-enriquecimento é necessá-

ria. Ver 9.1.2.
Convém que, para grandes quantidades, a água peptona tamponada seja aquecida a 37 °C ± 1 °C
antes da inoculação com a alíquota de ensaio.
4.3 Enriquecimento em meios líquidos seletivos

O meio Rappaport-Vassiliadis com soja (caldo RVS) e o caldo Muller-Kauffmann tetrationato/
novobiocina (caldo MKTTn) são inoculados com a cultura obtida em 4.2.
O caldo RVS é incubado a 41,5 °C ± 1 °C por 24 h ± 3 h, e o caldo MKTTn a 37 °C ± 1 °C, por 24 h ± 3 h.
4.4 Plaqueamento e identificação

A partir das culturas obtidas em 4.3, dois meios sólidos seletivos são inoculados:
— ágar xilose lisina desoxicolato (ágar XLD);
— qualquer outro meio sólido seletivo complementar ao ágar XLD e especialmente apropriado para
o isolamento de Salmonella lactose positiva e cepas de Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi;
o laboratório pode escolher qual meio utilizar.
O ágar XLD é incubado a 37 °C ± 1 °C e examinado após 24 h ± 3 h. O segundo ágar seletivo

é incubado de acordo com as recomendações do fabricante.
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NOTA Para informação, o ágar verde brilhante (AVB), o ágar bismuto sulfito etc. podem ser usados como
segundo meio de plaqueamento .
4.5 Confirmação da identidade
As colônias presuntivas de Salmonella são ativadas e então plaqueadas como descrito em 4.4, e a sua
identidade é confirmada por meio de ensaios bioquímicos e sorológicos apropriados.
5 Meios de cultura, reagentes e soros

5.1 Geral
Para a prática laboratorial atual, ver ISO 7218.
5.2 Meios de cultura e reagentes
NOTA Devido ao grande número de meios de cultura e reagentes disponíveis, é preferível, para ficar mais
claro, fornecer as composições e formas de preparo no anexo B.
5.2.1 Meio de pré-enriquecimento não seletivo: água peptonada tamponada
Ver B.1.
5.2.2 Primeiro meio de enriquecimento seletivo: Meio Rappaport-Vassiliadis com soja (caldo
RVS)
Ver B.2.
5.2.3 Segundo meio de enriquecimento seletivo: Caldo Muller-Kauffmann tetrationato

novobiocina (caldo MKTTn)
Ver B.3.
5.2.4 Meio seletivo sólido para plaqueamento
5.2.4.1 Primeiro meio: ágar xilose lisina desoxicolato (ágar XLD)
Ver B.4.
5.2.4.2 Segundo meio
A escolha do segundo meio adequado fica a critério do laboratório de ensaio. Convém que as instruções
do fabricante sejam cumpridas rigorosamente quanto à sua preparação para o uso.
5.2.5 Ágar Nutriente
Ver B.5.
5.2.6 Ágar triplo açúcar/ferro (ágar TSI)
Ver B.6.

5.2.7 Ágar ureia (Christensen)
Ver B.7.
5.2.8 Meio L-Lisina de descarboxilação
Ver B.8.
5.2.9 Reagente para a detecção de β-galactosidase (ou discos de papel preparados, utilizados
de acordo com as instruções do fabricante)
Ver B.9.
5.2.10 Reagentes para reação de Voges-Proskauer (VP)
Ver B.10.
5.2.11 Reagentes para a reação de indol
Ver B.11.
5.2.12 Ágar nutriente semissólido
Ver B.12.
5.2.13 Solução salina fisiológica
Ver B.13.
5.3 Soros
Vários tipos de soros contendo anticorpos aglutinantes para um ou vários antígenos-O estão
disponíveis comercialmente, ou seja, antissoros que contêm um ou mais grupos de “O” (chamados
antissoros-O monovalentes ou polivalentes), soro anti-Vi, e antissoros contendo anticorpos para um
ou vários fatores-H (chamados antissoros-H monovalentes ou polivalentes).
Convém que toda tentativa seja feita para assegurar que os antissoros utilizados sejam adequados
à detecção de todos os sorotipos de Salmonella. Assistência para esse objetivo pode ser obtida usando
um soro preparado por um fornecedor reconhecidamente competente (por exemplo, de uma agência
governamental apropriada).
6 Aparelhagem e vidraria
Aparelhagem descartável é uma alternativa aceitável para vidrarias reutilizáveis, se tiverem as espe-
cificações adequadas.
Equipamento de laboratório microbiológico (ver ISO 7218) e, em particular, o seguinte.
6.1 Aparelho para esterilização a seco (forno) ou esterilização úmida (autoclave)
Ver ISO 7218.
6.2 Estufa de secagem ou forno, ventilado por convecção, capaz de operar entre 37 °C
e 55 °C.

6.3 Estufa capaz de operar a 37 °C ± 1 °C.
6.4 Banho-maria capaz de operar a 41,5 °C ± 1 °C ou estufa capaz de operar a 41,5 °C ± 1 °C.
6.5 Banho-maria capaz de operar entre 44 °C e 47 °C.
6.6 Banho-maria capaz de operar a 37 °C ± 1 °C.
Recomenda-se a utilização de um banho-maria (6.4, 6.5 e 6.6), contendo um agente antibacteriano,

devido a baixa taxa infecciosa de Salmonella.
6.7 Alças estéreis, de aproximadamente 3 mm de diâmetro ou de 10 μL, ou pipetas estéreis.
6.8 Medidor de pH, com uma precisão de calibração de ± 0,1 unidades de pH em 20 °C a 25 °C.
6.9 Tubos de ensaio ou frascos, de capacidade adequada.
Garrafas ou frascos com tampas de rosca metálica ou plástica não tóxicas podem ser usadas.
6.10 Pipetas graduadas ou pipetas automáticas, de capacidade de 10 mL e 1 mL, com divisões

de 0,5 mL e 0,1 mL, respectivamente.
6.11 Placas de Petri, de tamanho pequeno (90 mm a 100 mm de diâmetro) e/ou de tamanho grande
(140 mm de diâmetro).
7 Amostragem
É importante que o laboratório receba uma amostra que seja verdadeiramente representativa e que
não tenha sido danificada ou alterada durante o transporte ou armazenamento.
A amostragem não é parte do método especificado nesta Norma. Ver a Norma específica para lidar com
o produto em questão. Se não existir uma Norma específica, recomenda-se que as partes envolvidas
cheguem a um acordo sobre este assunto.
8 Preparação da amostra para análise

Preparar a amostra de acordo com a Norma específica para lidar com o produto em questão. Se não
existir uma Norma específica, recomenda-se que as partes envolvidas cheguem a um acordo sobre
este assunto.
9 Procedimento (ver diagrama no Anexo A)

9.1 Alíquota de ensaio e suspensão inicial
9.1.1 Geral
Ver ABNT NBR ISO 6887-1 e Normas específicas que lidem com o produto em questão. Ver ISO 8261
para leite e produtos lácteos.
Para a preparação da suspensão inicial, utilizar o diluente de pré-enriquecimento especificado em

5.2.1 e 4.2 (água peptonada tamponada).
Se a massa determinada da alíquota de ensaio for diferente de 25 g, utilizar a quantidade necessária

de meio de pré-enriquecimento, para se obter uma diluição de 1/10.

Para reduzir o trabalho do ensaio quando houver mais de uma alíquota de ensaio de 25 g a ser
analisada de um lote específico de alimento, e quando houver evidência disponível de que uma mistura
(junção de alíquotas de ensaio) não afetará o resultado para o alimento específico, o ensaio de porções
pode ser composta. Por exemplo, se 10 alíquotas de ensaio de 25 g forem examinadas, combinar
as 10 unidades para formar uma alíquota de ensaio composta de 250 g e adicionar 2,25 L de caldo
de pré-enriquecimento. Alternativamente, a 0,1 mL (em 10 mL de caldo RVS) e 1 mL (em 10 mL
de caldo MKTTn), porções do caldo de pré-enriquecimento a partir de 10 alíquotas de ensaios separadas
(ver 9.3.1) podem ser compostas por enriquecimento em 100 mL de meio de enriquecimento seletivo.
9.1.2 Preparações específicas da suspensão inicial para determinados alimentos para

consumo humano
NOTA As seguintes preparações específicas são apenas para Salmonella. Preparações específicas
aplicáveis para a determinação de quaisquer microrganismos são descritas nas ABNT NBR ISO 6887-2,
ISO 6887-3, 6887-4 e ISO 8261.
9.1.2.1 Cacau e seus produtos contendo (por exemplo, mais de 20%)
Adicionar à água peptona tamponada (5.2.1), de preferência, 50 g /L de caseína (evitar o uso

de caseína ácida) ou 100 g/L de leite em pó desnatado estéril, e adicionar, depois de cerca de 2 h
de incubação, 0,018 g/L de verde brilhante, se o alimento para consumo humano for suscetível
de estar altamente contaminado com bactérias gram-positivas.
9.1.2.2 Alimentos para consumo humano ácidos e acidificantes
Certificar-se de que o pH não fique abaixo de 4,5 durante o pré-enriquecimento.
NOTA O pH dos alimentos para consumo humano ácidos e acidificantes é mais estável se for usada água
peptonada tamponada com concentração dupla.
9.2 Pré-enriquecimento não seletivo
Incubar a suspensão inicial (9.1) a 37 °C ± 1 °C, por 18 h ± 2 h.
9.3 Enriquecimento seletivo
9.3.1 Transferir 0,1 mL da cultura obtida em 9.2 para um tubo contendo 10 mL de caldo RVS (5.2.2);
transferir 1 mL da cultura obtida em 9.2 para um tubo contendo 10 mL de caldo MKTTn (5.2.3).
9.3.2 Incubar o caldo RVS inoculado (9.3.1) a 41,5 °C ± 1 °C por 24 h ± 3 h e o caldo MKTTn
inoculado a 37 °C ± 1 °C por 24 h ± 3 h. Convém que se tome cuidado para que a temperatura
de incubação máxima (42,5 °C) não seja excedida.
9.4 Plaqueamento e identificação
9.4.1 Após incubação por 24 h ± 3 h, usando a cultura obtida no caldo RVS (9.3.2), inocular, por
meio de uma alça (6.7), a superfície de uma placa de Petri grande (6.11), contendo o primeiro meio
de plaqueamento seletivo (ágar XLD, ver 5.2.4.1), de modo que as colônias fiquem bem isoladas.
Na ausência de placas de Petri grandes, usar duas placas pequenas, uma após a outra, utilizando
a mesma alça.
Proceder do mesmo modo para o segundo meio de plaqueamento seletivo (5.2.4.2), utilizando uma
alça estéril e placas de Petri como citado acima.

9.4.2 Após incubação durante 24 h ± 3 h, usando a cultura obtida no caldo MKTTn (9.3.2), repetir
o procedimento descrito em 9.4.1 com os dois meios de plaqueamento seletivo.
9.4.3 Inverter as placas (9.4.1 e 9.4.2), de modo que o fundo fique para cima, e colocá-las na estufa
(6.3), ajustada para 37 °C para o primeiro meio de cultura (5.2.4.1). As instruções do fabricante devem
ser seguidas para o segundo meio (5.2.4.2).
9.4.4 Após a incubação por 24 h ± 3 h, examinar as placas (9.4.3) para verificar a presença
de colônias típicas de Salmonella e colônias atípicas que podem ser Salmonella (ver Nota). Marcar
a sua posição sobre o fundo da placa.
Colônias típicas de Salmonella cultivadas em ágar XLD apresentam um centro negro e uma zona
levemente transparente de cor avermelhada, devido à mudança de cor do indicador.
NOTA Variantes de Salmonella H2S negativas (por exemplo, S. Paratyphi A) cultivadas em ágar XLD são
cor de rosa, com um tom rosa mais escuro no centro. Salmonella lactose-positiva cultivadas em ágar XLD são
amarelas, com ou sem escurecimento.
Incubar o segundo meio sólido seletivo a uma temperatura apropriada e, depois do tempo apropriado,
examinar para verificar a presença de colônias que, pelas suas características, sejam consideradas
colônias presuntivas de Salmonella.
9.5 Confirmação
9.5.1 Geral
Se demonstrado que são confiáveis, os kits de identificação comercialmente disponíveis para a análise
bioquímica de Salmonella podem ser utilizados. O uso de kits de identificação bioquímica refere-se
à confirmação de colônias. Convém que estes kits sejam usados seguindo as instruções do fabricante.
NOTA O reconhecimento de colônias de Salmonella é em grande parte uma questão de experiência, e a

aparência das colônias pode variar um pouco, não apenas de sorovar para sorovar, mas também de lote para
lote do meio de cultura seletivo utilizado.
9.5.2 Seleção das colônias para a confirmação
Para a confirmação, selecionar de cada placa (duas placas pequenas ou uma placa grande), de cada
meio seletivo (ver 9.4), pelo menos uma colônia considerada típica ou suspeita e mais quatro colônias,
se a primeira for negativa.
Recomenda-se que pelo menos cinco colônias sejam identificadas no caso de estudos epidemiológicos.
Se uma placa tiver menos de cinco colônias típicas ou suspeitas, levar para confirmação todas as
colônias típicas ou suspeitas.
Estriar as colônias selecionadas na superfície de placas de ágar nutriente previamente secadas

(5.2.5), de forma que seja permitido que as colônias se desenvolvam bem isoladas. Incubar as placas
inoculadas (9.4.3), a 37 °C ± 1 °C, por 24 h ± 3 h.
Usar culturas puras para confirmações bioquímica e sorológica.
9.5.3 Confirmação bioquímica

9.5.3.1 Geral
Por meio de uma agulha de inoculação, inocular os meios especificados em 9.5.3.2 a 9.5.3.7 com cada
uma das culturas obtidas a partir das colônias selecionadas em 9.5.2.

9.5.3.2 Ágar TSI (5.2.6)

Espetar a agulha no fundo do tubo e estriar a superfície inclinada do ágar. Incubar a 37 °C ± 1 °C, por
24 h ± 3 h.
Interpretar as mudanças no meio como a seguir.
a) Fundo do tubo
— amarelo glicose positiva (glicose usada)
— vermelho ou inalterado glicose negativa (glicose não utilizada)

— negro formação de sulfeto de hidrogênio
— bolhas ou fissuras formação de gás a partir de glicose
b) na superfície inclinada
— amarelo lactose e/ou sacarose positiva (lactose e/ou sacarose utilizada)
— vermelho ou inalterada lactose e sacarose negativa (nem lactose nem sacarose utilizada)
Culturas de Salmonella típicas mostram-se alcalinas (vermelho) na superfície inclinada e ácidas
(amarelo) no fundo com formação de gás (bolhas) e (em cerca de 90 % dos casos) com formação
de sulfeto de hidrogênio (escurecimento do ágar) (9.5.3.8).
Quando uma Salmonella lactose positiva é isolada (ver 4.4), a superfície inclinada do ágar TSI fica
amarela. Assim, a confirmação preliminar de culturas de Salmonella não pode basear-se apenas nos
resultados do ensaio de ágar TSI (ver 9.5.3).
9.5.3.3 Ágar ureia (5.2.7)
Estriar a superfície do ágar inclinado. Incubar a 37 °C ± 1 °C, por 24 h ± 3 h, e examinar em intervalos.
Se a reação for positiva, a quebra da ureia libera amônia, que muda a cor do vermelho de fenol para
rosa-pink e, mais tarde, muda para a cor cereja-escuro. A reação aparece frequentemente após 2 h a 4 h.
9.5.3.4 Meio de descarboxilação de L-Lisina (5.2.8)
Inocular logo abaixo da superfície do meio líquido. Incubar a 37 °C ± 1 °C, por 24 h ± 3 h.
Turbidez e uma cor púrpura após incubação indicam uma reação positiva. A cor amarela indica uma
reação negativa.
9.5.3.5 Detecção de β-galactosidase (5.2.9)
Suspender uma alça cheia da colônia suspeita em um tubo contendo 0,25 mL de solução salina
(5.2.13).
Adicionar 1 gota de tolueno e agitar o tubo. Colocar o tubo em um banho-maria (6.6) a 37 °C, deixando
repousar durante alguns minutos (aproximadamente 5 min). Adicionar 0,25 mL de reagente para
a detecção de β-galactosidase e misturar.
Substituir o tubo no banho-maria regulado a 37 °C, deixando repousar durante 24 h ± 3 h, examinando
o tubo nos intervalos.
A cor amarela indica uma reação positiva. A reação aparece frequentemente depois de 20 min.
Caso sejam usados discos de papel preparados (5.2.9), seguir as instruções do fabricante.

9.5.3.6 Meio para reação de Voges-Proskauer (VP) (5.2.10)
Suspender uma alça cheia da colônia suspeita em um tubo estéril contendo 3 mL do meio de VP.
Incubar a 37 °C ± 1 °C, por 24 h ± 3 h.
Após a incubação, adicionar duas gotas de solução de creatina, a três gotas de solução etanólica
de 1-naftol e, em seguida, duas gotas de solução de hidróxido de potássio; agitar após a adição
de cada reagente.
A formação de cor de rosa para vermelho-brilhante no prazo de 15 min indica uma reação positiva.
9.5.3.7 Meio de reação de indol (5.2.11)
Inocular um tubo que contenha 5 mL de meio de triptona/triptofano com a colônia suspeita.
Incubar a 37 °C ± 1 °C, por 24 h ± 3 h. Após a incubação, adicionar 1 mL de reagente de Kovacs.
A formação de um anel vermelho indica uma reação positiva. Um anel amarelo-castanho indica uma
reação negativa.
9.5.3.8 Interpretação dos ensaios bioquímicos
Salmonella mostram geralmente as reações indicadas na Tabela 1.
9.5.4 Confirmação sorológica e sorotipagem
9.5.4.1 Geral
A detecção da presença de antígenos de Salmonella O, Vi e H é ensaiada por aglutinação em

lâmina com o soro adequado, a partir de colônias puras (9.5.2), e após cepas autoaglutinantes terem
sido desconsideradas. Usar o antissoro de acordo com as instruções do fabricante, se for diferente
da descrição a seguir.
9.5.4.2 Eliminação de cepas autoaglutinantes
Colocar uma gota da solução salina (5.2.13) em uma lâmina de vidro cuidadosamente limpa. Dispersar
na gota, por meio de uma alça (6.7), parte da colônia a ser ensaiada, de forma a obter uma suspensão
homogênea e turva.
NOTA É também possível dispersar parte da colônia a ser ensaiada em uma gota de água, e depois
misturar esta solução com uma gota de solução salina (5.2.13).
Agitar lentamente a lâmina durante 30 s a 60 s. Observar o resultado contra um fundo escuro,

de preferência com o auxílio de uma lupa.
Se as bactérias se acumularem em unidades mais ou menos distintas, a cepa é considerada

autoaglutinante, e não pode ser submetida aos seguintes ensaios por não ser viável a detecção
dos antígênos.

Tabela 1 – Interpretação dos ensaios bioquímicos

Ensaio a Cepa de Salmonella
(9.5.3.2 a S. Typhi S. Paratyphi A S. Paratyphi B S. Paratyphi C Outras cepas
9.5.3.7) Reação % b Reação % b Reação % c Reação % c Reação %b
Ácido TSI de
+ 100 + 100 + + + 100
glicose
Gás TSI de
–d 0 + 100 + + + 92
glicose
Ácido TSI de
– 2 – 100 – – – 1
lactose
Ácido TSI de
– 0 – 0 – – – 1
sacarose
Sulfeto TSI
de hidrogênio + 97 – 10 + + + 92
produzido
Hidrólise de
– 0 – 0 – – – 1
ureia
Descarboxilase
+ 98 – 0 + + + 95
de Lisina
Reação
– 0 – 0 – – – 2e
β-galactosidase
Reação Voges-
– 0 – 0 – – – 0
Proskauer
Produção de
– 0 – 0 – – – 1
indol
a Da referência [5].
b Essas porcentagens indicam que nem todos os isolados do sorotipo Salmonella serotype mostram
as reações marcada + ou –. Estas porcentagens podem variar entre e dentro de sorotipos causadores
de infecção alimentar provenientes de diferentes localizações.
c As porcentagens não são conhecidas a partir da literatura disponível.
d Salmonella Typhi é anaerogênica.
e A Salmonella entérica subespécie arizonae dá uma reação lactose positiva ou negativa, mas é sempre
β-galactosidase positiva. Para o estudo destas cepas pode ser útil realizar ensaios complementares.
9.5.4.3 Exame de antígenos-O
Usando uma colônia não autoaglutinante pura, proceder de acordo com 9.5.4.2, utilizando uma gota
de antissoro O (5.3) em vez da solução salina (5.2.13).
Se ocorrer aglutinação, a reação é considerada positiva.
Utilizar os soros poli-e monovalente, um após o outro.
9.5.4.4 Exame de antígenos-Vi
Proceder de acordo com 9.5.4.2, mas utilizando uma gota de antissoro-Vi (5.3) em vez da solução
salina.

9.5.4.5 Exame para antígenos-H
Inocular o ágar nutriente semissólido (5.2.12) com uma colônia não autoaglutinante pura. Incubar
o meio a 37 °C ± 1 °C, por 24 h ± 3 h.
Usar esta cultura na realização do exame para antígenos-H, procedendo de acordo com 9.5.4.2, mas
usando uma gota do soro anti-H (5.3) em vez da solução salina.

9.5.5 Interpretação de reações bioquímicas e sorológicas
A Tabela 2 apresenta a interpretação dos ensaios confirmatórios (9.5.3 e 9.5.4) realizadas nas colônias
utilizadas (9.5.2).
Tabela 2 – Interpretação dos ensaios confirmatórios

Reações
Autoaglutinação Reações sorológicas Interpretação
bioquímicas
Antígeno-O, -Vi ou -H Cepa considerada
Reação típica Não
positivo Salmonella
Reação típica Não Todas as reações negativas
Pode ser
Reação típica Sim Não ensaiadas (ver 9.5.4.2)
considerada
Antígeno-O, -Vi ou -H Salmonella
Reação atípica Não/Sim
positivo
Não considerada
Reação atípica Não/Sim Todas as reações negativas
Salmonella
9.5.6 Confirmação definitiva
Cepas que são consideradas Salmonella, ou que podem ser Salmonella (ver Tabela 2), devem ser
enviadas para um centro de referência de Salmonella para tipagem definitiva.
Este envio deve ser acompanhado de toda a informação possível sobre a cepa e se é caso de surto
ou presença em alimentos.
10 Expressão dos resultados

De acordo com os resultados da interpretação, indicar a presença ou ausência de Salmonella em uma
alíquota de ensaio de x g ou x mL de produto (ver ISO 7218).
Ver o anexo C para os dados de precisão obtidos a partir do ensaio interlaboratorial.
11 Relatório de ensaio
O relatório deve especificar:
— o método de amostragem utilizado, se conhecido;

— qualquer desvio nos meios de enriquecimento ou nas condições de incubação usadas;
— todas as condições operacionais não especificadas nesta Norma, ou consideradas opcionais,

juntamente com detalhes de quaisquer incidentes que possam ter influenciado os resultados;
— os resultados obtidos.
O relatório deve também indicar se um resultado positivo foi obtido apenas quando for utilizado
plaqueamento com um meio de cultura (5.2.4) não especificado nesta Norma.
12 Garantia da qualidade
Para verificar a capacidade do laboratório na detecção de Salmonella com os métodos e meios
descritos nesta Norma, acondicionar as amostras de referência dentro de frascos com o meio de pré-
enriquecimento (ver 5.2.1). Proceder com os frascos de controle da mesma forma que para as culturas
de ensaio.

Anexo A
(normativo)
Diagrama do processo
PRE-ENRIQUECIMENTO
Água peptonada tamponada,

à temperatura ambiente
Incubar (9.2) por

18 h ± 2 h a 37 °C ± 1 °C
ENRIQUECIMENTO
0,1 ml de cultura 1 ml de cultura

+ +
10 mL de caldo RVS (9.3.1) 10 mL de caldo MKTTn (9.3.1)
SELETIVO
Incubar por Incubar por

24 h ± 3 h a 41,5 °C ± 1 °C 24 h ± 3 h a 37 °C ± 1 °C
Ágar XLD e outro meio à escolha (9.4.1)

Incubar por 24 h ± 3 h a 37 °C ± 1 °C
PLAQUEAMENTO
De cada placa ensaiar uma colônia típica.

Se negativo, ensaiar outras quatro colônias
selecionadas (9.5.2)
Ágar nutriente, incubar por

24 h ± 3 h a 37 °C ± 1 °C (9.5.2)
CONFIRMAÇÃO
Confirmação Confirmação
bioquímica (9.5.3) sorológica (9.5.4)
Expressar os resultados (Seção 10)

Anexo B
(normativo)
Composição e preparação de meios de cultura e reagentes
B.1 Água peptonada tamponada

B.1.1 Composição
Digestão enzimática de caseína 10,0 g

Cloreto de sódio 5,0 g
Fosfato de hidrogênio dissódico dodecahidratado (Na2HPO4 ⋅ 12H2O) 9,0 g
Fosfato dihidrogênio potássico (KH2PO4) 1,5 g
Água 1 000 mL
B.1.2 Preparação
Dissolver os componentes na água, por aquecimento, se necessário.
Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, seja de 7,0 ± 0,2 a 25 °C.
Distribuir o meio em frascos (6.9) de capacidade adequada para obter as alíquotas necessárias para
o ensaio.
Esterilizar por 15 min em autoclave (6.1) a 121 °C.
B.2 Meio de Rappaport-Vassiliadis com soja (caldo RVS)
B.2.1 Solução A
B.2.1.1 Composição
Digestão enzimática de soja 5,0 g

Cloreto de sódio 8,0 g
Fosfato hidrogênio dipotássico (K2HPO4) 0,2 g
Água 1 000 mL

B.2.1.2 Preparação
Dissolver os componentes na água por aquecimento a cerca de 70 °C, se necessário.
A solução deve ser preparada no dia da preparação do meio RVS completo.
B.2.2 Solução B
Cloreto de magnésio hexahidratado (Mg Cl2 ⋅ 6H2O) 400,0 g

Água 1 000 mL
Dissolver o cloreto de magnésio na água.
Como este sal é muito higroscópico, é aconselhável dissolver todo o conteúdo do MgCl2 ⋅ 6H2O
de um frasco recém-aberto, de acordo com a fórmula. Por exemplo, 250 g de MgCl2 ⋅ 6H2O é adicionado
a 625 mL de água, dando um solução de volume total de 788 mL e uma concentração em massa
de cerca de 31,7 g por 100 mL de MgCl2 ⋅ 6H2O.
A solução pode ser conservada em um frasco de vidro escuro com tampa bem vedada em temperatura
ambiente, por pelo menos 2 anos.
B.2.3 Solução C
Oxalato de verde malaquita 0,4 g

Água 100 mL
Dissolver o oxalato de verde malaquita na água.
A solução pode ser conservada em um frasco de vidro âmbar à temperatura ambiente durante pelo
menos 8 meses.
B.2.4 Meio completo

Solução A (B.2.1) 1 000 mL

Solução B (B.2.2) 100 mL
Solução C (B.2.3) 10 mL
Adicionar 1 000 mL da solução A, 100 mL da solução B e 10 mL da solução C.
Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, o pH esteja a 5,2 ± 0,2.

Antes do uso, distribuir em tubos de ensaio (6.9) em quantidades de 10 mL.
Esterilizar durante 15 min em autoclave (6.1) a 115 °C.
Armazenar o meio preparado a 3 °C ± 2 °C. Usar o meio no dia da sua preparação.

NOTA A composição final do meio é: digestão enzimática de soja, 4,5 g/L; cloreto de sódio, 7,2 g/L;
fosfato dihidrogênio potássico (KH2PO4 + K2HPO4), 1,44 g/L; cloreto de magnésio anidro (MgCl2), 13,4 g/L
ou cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2 ⋅ 6H2O), 28,6 g/L; oxalato de verde malaquita, 0,036 g/L.
B.3 Caldo Muller-Kauffmann tetrationato-novobiocina (MKTTn) [7]
B.3.1 Meio base

Extrato de carne 4,3 g

Digestão enzimática de caseina 8,6 g
Cloreto de sódio (NaCl) 2,6 g
Carbonato de calcio (CaCO3) 38,7 g
Tiosulfato de sódio pentahidratado (Na2S2O3 ⋅ 5H2O) 47,8 g
Bile bovina para uso bacteriológico 4,78 g
Verde brilhante 9,6 mg
Água 1 000 mL
Dissolver os componentes básicos desidratados ou o meio desidratado completo em água em ebulição

por 5 min.
Ajustar o pH, se necessário, de modo que esteja 8,0 ± 0,2, a 25 °C.
Misturar bem o meio.
O meio de base pode ser armazenado por 4 semanas, a 3 °C ± 2 °C.
B.3.2 Solução de iodeto de iodo

Iodo 20,0 g
Iodeto de potássio (KI) 25,0 g
Água 100 mL
Dissolver completamente o iodeto de potássio em 10 mL de água, em seguida, adicionar o iodo e diluir

a 100 mL com água estéril. Não aquecer.
Armazenar a solução preparada no escuro e à temperatura ambiente em um recipiente bem fechado.

B.3.3 Solução de novobiocina

Sal sódico de novobiocina 0,04 g
Água 5 mL
Dissolver o sal sódico de novobiocina em água e esterilizar por filtração.
Armazenar por até 4 semanas, a 3 °C ± 2 °C.
B.3.4 Meio completo

Meio base (B.3.1) 1 000 mL
Solução de iodeto de iodo (B.3.2) 20 mL
Solução de novobiocina (B.3.3) 5 mL
Adicionar assepticamente 5 mL da solução de novobiocina (B.3.3) em 1 000 mL de meio de base
(B.3.1). Misturar, em seguida, adicionar 20 mL de a solução de iodeto de iodo (B.3.2). Misturar bem.
Distribuir o meio assepticamente em frascos estéreis (6.9), de capacidade adequada, para obter
as alíquotas necessárias para o ensaio.
O meio completo deve ser usado no dia da sua preparação.
B.4 Ágar xilose lisina desoxicolato (ágar XLD) [7]

B.4.1 Meio base
Extrato de levedura em pó 3,0 g
Xilose 3,75 g
Lactose 7,5 g
Sacarose 7,5 g
Hidrocloreto de L-Lisina 5,0 g
Tiossulfato de sódio 6,8 g
Citrato férrico amoniacal 0,8 g
Vermelho de fenol 0,08 g
Desoxicolato de sódio 1,0 g
Ágar 9 g to 18 g 1
Água 1 000 mL

Dissolver os componentes de base desidratados ou a base completamente desidratada em água por

aquecimento, com frequente agitação, até que o meio comece a ferver. Evitar o superaquecimento.
Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja a 7,4 ± 0,2, a 25 °C.
Verter a base para tubos ou frascos (6.9) de capacidade apropriada.
Aquecer com agitação frequente até que o meio ferva e o ágar se dissolva. Não superaquecer.
B.4.2 Preparação das placas de ágar
Transferir imediatamente para um banho-maria (6.5) a 44 °C a 47 °C, agitar e verter em placas.

Aguardar solidificar.
Imediatamente antes do uso, secar as placas de ágar cuidadosamente (preferencialmente com as

tampas abertas e com a superfície do meio para baixo) no forno (6.2) ajustado entre 37 °C e 55 °C até
que a superfície do ágar esteja seca.
Armazenar as placas vertidas por até 5 dias a 3 °C ± 2 °C.
B.5 Ágar nutriente
B.5.1 Composição

Peptona 5,0 g
Ágar 9 g a 18 g 1
Água 1 000 mL
B.5.2 Preparação
Dissolver os componentes ou o meio desidratado completo na água, por aquecimento, se necessário.
Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja a 7,0 ± 0,2 a 25 °C.
Transferir o meio de cultura para tubos ou frascos (6.9), de capacidade apropriada.
Esterilizar durante 15 min na autoclave (6.1) ajustada a 121 °C.
B.5.3 Preparação de placas de ágar nutriente
Transferir cerca de 15 mL do meio derretido para placas pequenas de Petri estéreis (6.11) e prosseguir
conforme B.4.2.
1 Dependendo da consistência do gel de ágar.

B.6 Ágar triplo açúcar/ferro (Triple sugar/iron agar) (ágar TSI)
B.6.1 Composição

Extrato de levedura 3,0 g
Peptona 20,0 g
Lactose 10,0 g
Sacarose 10,0 g
Glicose 1,0 g
Citrato de ferro (III) 0,3 g
Tiossulfato de sódio 0,3 g
Ágar 9 g a 18 g 1
Água 1 000 mL
B.6.2 Preparação
Dissolver os componentes ou o meio desidratado completo na água, por aquecimento, se necessário.
Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja 7,4 ± 0,2 a 25 °C.
Distribuir o meio em tubos de ensaio ou placas em quantidades de 10 mL.
Deixar em uma posição inclinada, de forma que fique com cerca de 5 cm de profundidade e 2,5 cm
na parte superior inclinada.
B.7 Ágar ureia (Christensen)
B.7.1 Meio base

Peptona 1,0 g
Glicose 1,0 g
Ágar 9 g a 18 g 1
Água 1 000 mL

Dissolver os componentes ou a base desidratada completa na água, por aquecimento, se necessário.
Esterilizar durante 15 min na autoclave (6,1) ajustada a 121 °C.
B.7.2 Solução de ureia

Ureia 400 g
Água até completar o volume final de 1 000 mL
Dissolver a ureia na água. Esterilizar por filtração e verificar a esterilidade.
Ver ISO 7218:1996, 7.3.2.
B.7.3 Meio completo
Base (B.7.1) 950 mL

Solução de ureia (B.7.2) 50 mL
Adicionar, sob condições assépticas, a solução de ureia para a base, previamente derretida e, em
seguida, resfriar de 44 °C para 47 °C.
Distribuir o meio completo em tubos estéreis (6.9) em quantidades de 10 mL.
Deixar em uma posição inclinada.
B.8 Meio de descarboxilação de L-Lisina
B.8.1 Composição
Monoidrocloridrato de L-Lisina 5,0 g

Extrato de levedura 3,0 g
Glicose 1,0 g
Purpura de bromocresol 0,015 g
Água 1 000 mL

B.8.2 Preparação
Transfir o meio em quantidades de 2 mL a 5 mL para distribuir em tubos de cultura (6.9) com tampas
de rosca.
Esterilizar durante 15 min na autoclave (6.1) ajustada em 121 °C.

B.9 Reagente de β-galactosidase
B.9.1 Solução-tampão
Fosfato dihidrogênio sódico (NaH2PO4) 6,9 g

Hidróxido de sódio, solução a 10 mol/L cerca de 3 mL
Água a um volume um final de 50 mL
Dissolver o fosfato dihidrogênio sódico em aproximadamente 45 mL de água em um balão volumétrico.
Ajustar o pH a 7,0 ± 0,2 a 25 °C com a solução de hidróxido de sódio.
Adicionar água até um volume final de 50 mL.
B.9.2 Solução ONPG
o-Nitrofenil β-D-galactopiranosidio (ONPG) 0,08 g

Água 15 mL
Dissolver o ONPG em água a aproximadamente 50 °C.
Resfriar a solução.
B.9.3 Reagente completo
Solução-tampão (B.9.1) 5 mL
Solução ONPG (B.9.2) 15 mL

Adicionar a solução-tampão na solução ONPG.
B.10 Reagentes para reação Voges-Proskauer (VP)
B.10.1 Meio VP
Peptona 7,0 g
Glicose 5,0 g
Fosfato hidrogênio dipotássico (K2HPO4) 5,0 g
Água 1 000 mL
Transferir o meio para os tubos de ensaio (6.9) em quantidades de 3 mL.
B.10.2 Solução de creatina (N-amidinosarcosina)
Creatina monoidratada 0,5 g

Água 100mL
Dissolver a creatina monoidratada em água.
B.10.3 Solução de solução etanólica de 1-naftol
1-Naftol 6g
Etanol, 96 % (fração de volume) 100 mL
Dissolver o 1-naftol no etanol.

B.10.4 Solução de hidróxido de potássio
Hidróxido de potássio 40 g
Agua 100mL
Dissolver o hidróxido de potássio na água.
B.11 Reagentes para reação de indol
B.11.1 Meio triptona/triptofano
Triptona 10 g
Cloreto de sódio (NaCl) 5g
DL-Triptofano 1g
Água 1 000 mL
Dissolver os componentes na água em ebulição.
Distribuir 5 mL do meio em cada um dos tubos (6.9).
B.11.2 Reagente Kovacs
4-dimetilaminobenzaldeído 5g
Ácido clorídrico, ρ = 1,18 g/mL a 1,19 g/mL 25 mL
2-metilbutano-2-ol 75 mL
Misturar os componentes.

B.12 Ágar nutriente semissólido
B.12.1 Composição

Peptona 5,0 g
Ágar de 4 g a 9 g 1
Água 1 000 mL
B.12.2 Preparação
Transferir o meio para frascos (6.9) de capacidade apropriada.
Esterilizar durante 15 min na autoclave (6.1) a 121 °C.
B.12.3 Preparação de placas de ágar
Verter, em pequenas placas de Petri estéreis (6.11), cerca de 15 mL do meio preparado e fresco.
Não permitir que as placas de ágar sequem.
B.13 Solução salina fisiológica
B.13.1 Composição

Água 1 000 mL
B.13.2 Preparação
Dissolver o cloreto de sódio na água.
Distribuir uma quantidade de solução em frascos ou tubos (6.9), de forma que contenham 90 mL
a 100 mL após a esterilização.

Anexo C
(informativo)
Resultados do ensaio interlaboratorial
Um ensaio de colaborativo internacional foi organizado, em 2000, pela AFSSA Ploufragan na Europa,
e BioControl Systems nos EUA, no âmbito do Projeto Europeu SMT CT 96 2098 [6]. Esse ensaio
envolveu 11 laboratórios em 9 países da Europa e 10 laboratórios nos EUA, e foi realizado para massa
fresca de queijo, ovo em pó, carne de aves crua e um material de referência. As amostras de alimentos
foram ensaiadas, cada uma em dois níveis diferentes de contaminação, acrescidas de um controle
negativo.
Os valores de desempenho obtidos a partir deste ensaio colaborativo são mostrados por tipo de
amostra nas Tabelas C.1 a C.4. Os dados obtidos por alguns laboratórios foram excluídos dos cálculos
apenas por razões técnicas claramente identificadas (desvios do protocolo).
Tabela C.1 – Resultado da análise dos dados obtidos com amostras de massa fresca
de queijo
Massa fresca Massa fresca

Massa fresca de de queijo de queijo
queijo
(baixo nível de (alto nível de
(controle negativo)
contaminação) contaminação)
Número de laboratórios que

23 23 23
reportaram seus resultados
Número de amostras por laboratório 5 5 5
Número de laboratórios excluídos 2 2 2
Número de laboratórios mantidos
21 21 21
após a exclusão
Número de amostras aceitáveis 105 105 105
Precisão (especificidade), % 100 – –
Precisão (sensibilidade), % – 74,3 83,8
Conformidade (Accordance), % 100 83,8 95,2
Concordância (Concordance), % 100 60,5 71,7

Tabela C.2 – Resultado dos dados da análise obtida com amostras de ovo em pó
Ovo em pó Ovo em pó
Ovo em pó
(controle negativo)
26 26 26
Número de amostras por
5 5 5
laboratório

21 21 21
após a exclusão
Precisão (sensibilidade), % – 98,1 99
Conformidade (Accordance), % 100 96,2 98,1
Concordância (Concordance), % 100 96,2 98,1
Tabela C.3 – Resultado das análises obtidas com amostras de carne de aves crua
Carne de aves Carne de aves
Carne de aves
crua crua
crua
(controle negativo)
25 25 25
Número de amostras por laboratório 5 5 5
20 20 20
após a exclusão
Precisão (sensibilidade), % – 98 100
Conformidade (Accordance), % 100 96,9 100
Concordância (Concordance), % 100 96 100

Tabela C.4 – Resultados das análises obtidas com materiais de referencia

Materiais de referencia
(capsulas contendo cerca de 5 ufc de S.
Typhimurium)
Número de laboratórios que reportaram
26
seus resultados
Número de amostras por laboratório 5
Número de laboratórios excluídos 1

Número de laboratórios mantidos após a
25
exclusão
Número de amostras aceitáveis 125
Precisão (especificidade), % –
Precisão (sensibilidade), % 94,4
Conformidade (Accordance), % 88,8
Concordância (Concordance), % 89,1

Anexo D
(normativo)
Detecção de Salmonella spp. em amostras ambientais e de fezes

de animais na produção primária
D.1 Introdução
O método apresentado no texto principal desta Norma destina-se principalmente ao isolamento
de Salmonella spp. a partir de alimentos para consumo humano e animal, e não é sempre adequado
à detecção de Salmonella spp. a partir de outras matrizes.
Este anexo é aplicável à detecção de Salmonella spp. em
— fezes de animais (como de aves, suínos, gado) e
— amostras ambientais da produção primária (como poeira).
O método neste anexo baseia-se na Seção 9, com um meio de enriquecimento seletivo diferente.
Portanto, sempre que possível, será feita referência à Seção 9.
O meio de enriquecimento seletivo, como descrito neste anexo (MSRV:meio Rappaport-Vassiliadis

semissólido modificado), destina-se à detecção de Salmonellae móveis e não é adequado à detecção
de Salmonellae não móveis.
NOTA Os biovares de Salmonella não móveis de Salmonella Gallinarum (Salmonella Gallinarum biovar
gallinarum e Salmonella Gallinarum biovar pullorum) parecem não sobreviver por muito tempo em amostras
ambientais e, portanto, raramente podem ser detectadas em amostras ambientais (como poeira) e de fezes
(independentemente do método). O número de outros sorovares de Salmonella não móveis em amostras
fecais parece ser geralmente baixo. Por exemplo, na Referência [7], em que cerca de 1 000 amostras de fezes
de aves poedeiras e em cerca de 900 amostras de fezes de frangos de corte que foram analisadas, menos
de 1 % do número total de amostras foram positivas em caldo seletivo e ao mesmo tempo negativas no meio
MSRV (e provavelmente não móveis). Resultados semelhantes foram observados em um estudo holandês
com cerca de 3 200 amostras de fezes de porcos (dados não publicados). Por outro lado, no caso do estudo
de Referência [7], cerca de 40 % de amostras positivas não teriam sido detectadas (isto é, teriam dado falso
negativo), se apenas um caldo seletivo (neste caso Rappaport-Vassiliadis) tivesse sido usado em vez de um
meio semissólido.
D.2 Princípio
D.2.1 Geral
A detecção de Salmonella em fezes de animais e em amostras da produção primária requer quatro
etapas, conforme descrito na Seção 4.
D.2.2 Pré-enriquecimento em meio líquido não seletivo

Água peptonada tamponada (BPW) é inoculada à temperatura ambiente com a alíquota de ensaio, em
seguida, incubada a 37 °C ± 1 °C, durante 18 h ± 2 h.

D.2.3 Enriquecimento em meio semi-sólido seletivo
Placas de ágar Rappaport-Vassiliadis modificado semissólido (MSRV) são inoculadas com a cultura
obtida em D.2.2.
O MSRV é incubado a 41,5 °C ± 1 °C durante 24 h ± 3 h. Se uma placa for negativa após 24 h,

é incubada por mais 24 h ± 3 h.
D.2.4 Plaqueamento seletivo e identificação

A partir da cultura obtida em D.2.3, dois meios sólidos seletivos são inoculados:
— ágar xilose lisina desoxicolato (XLD);
— qualquer outro meio sólido seletivo complementar para ágar XLD (ver 4.4).
O ágar XLD é incubado a 37 ° C ± 1 ° C e examinado após 24 h ± 3 h.
O segundo meio seletivo é incubado de acordo com as instruções do fabricante.
D.2.5 Confirmação da identidade
As colônias presuntivas de Salmonella são subcultivadas e então plaqueadas como descrito em D.2.4,
e a sua identidade é confirmada por meio de ensaios bioquímicos e sorológicos adequados.
D.3 Meios de cultura, reagentes e soros
D.3.1 Geral
Para a prática laboratorial atual, ver ISO 7218.
Todos os meios e reagentes necessários para este anexo estão descritos no Anexo B, exceto para meio
Rappaport-Vassiliadis modificado semissólido (MSRV), que é descrito em D.3.2. Alternativamente,
pode ser utilizado meios ou diluentes desidratados completos. Seguir as instruções do fabricante.
NOTA A composição de MSRV, como descrito na Referência [8], contém 20 mg/L de novobiocina. No entanto,
do ponto de vista científico, 10 mg/L de novobiocina é preferida. Em estudos efetuados no CRL-Salmonella,
mais resultados positivos para Salmonella foram encontrados em amostras de fezes de suínos, quando
ensaiadas com MSRV contendo 10 mg/L, do que com MSRV contendo 20 mg/L de novobiocina (ver Referência
[9]). Além disso, ao ensaiar diferentes fezes de animais (porcos, galinhas, bovinos) e poeira contaminada
naturalmente, as zonas de migração em MSRV contendo 10 mg/L de novobiocina foram (muito) maiores do
que em meio MSRV contendo 20 mg/L de novobiocina (Referência [9]) . A influência do novobiocina sobre a
motilidade bacteriana foi anteriormente descrita na Referência [10].
NOTA BRASILEIRA Community Reference Laboratories (CRL-Salmonella).
Para a preparação de placas de ágar seletivo (ver B.4, ágar-XLD), podem ser utilizadas placas de Petri
de tamanho padrão (90 mm ou 100 mm), em vez de placas de Petri de tamanho grande (140 mm).

D.3.2 Meio Rappaport-Vassiliadis modificado semissólido (MSRV)

D.3.2.1 Meio base
D.3.2.1.1 Composição
Digestão enzimática do tecido animal e vegetal 4,6 g

Ácido hidrolisado de caseína 4,6 g
Fosfato dihidrogênio potássico (KH2PO4), 1,5 g

Cloreto de magnésio anidro (MgCl2) 10,9 g
Oxalato de verde malaquita 0,04 g
Ágar 2,7 g
Água 1 000 mL
D.3.2.1.2 Preparação
Suspender os ingredientes na água.
Aquecer com agitação até ferver. Não autoclavar.
Não manter o meio a temperaturas elevadas por tempo superior ao necessário.
Resfriar o meio a 47-50 °C.
D.3.2.2 Solução de novobiocina
Novobiocina sódica 0,05 g

Água 10 mL
Dissolver a novobiocina sódica na água.
Esterilizar por filtração através de um filtro com porosidade de 0,22 μm.
A solução pode ser armazenada por até 4 semanas a 5 °C ± 3 °C, ou em pequenas porções (por
exemplo, de 2 mL) a – 20 °C por até um ano.
D.3.2.3 Meio completo
Meio base (D.3.2.1) 1 000 mL

Solução de novobiocina (D.3.2.2) 2 mL

Adicionar assepticamente 2 mL da solução de novobiocina (D.3.2.2) até 1 000 mL de meio base

(D.3.2.1 ) a 47 °C a 50 °C. Misturar com cuidado.
O pH final deve ser 5,2 ( 5,1 a 5,4), de 20 °C até 25 °C.
Verter em placas até um volume de 15 mL a 20 mL em placas de Petri, com um diâmetro de 90 mm.
Deixar o meio solidificar antes de movê-lo e manusear com cuidado.

Armazenar as placas, com a superfície para cima, por no máximo 2 semanas a 5 °C ± 3 °C no escuro.
Não inverter as placas, uma vez que o ágar semissólido é muito líquido.
Não se pode utilizar qualquer placa cujo ágar semissólido tenha se liquefeito ou fragmentado.
Imediatamente antes da utilização, e apenas se necessário, secar a superfície das placas de ágar com
cuidado, por exemplo, destampando-as com a superfície do ágar para cima em uma câmara de fluxo
laminar. Tomar cuidado para não secar em excesso o meio.
D.4 Aparelhagem e vidrarias

Usar os materiais listados na Seção 6 e o seguinte.
D.4.1 alças estéreis, de 1 μL.
D.5 Amostragem
Ver Seção 7.
D.6 Preparação da amostra de ensaio

Ver Seção 8.
Em geral, uma quantidade de amostra é adicionada a uma quantidade de BPW para obter uma diluição
de 1/10 (por exemplo, 25 g de amostra adicionada a 225 mL de BPW). No entanto, para alguns tipos
de amostras pode ser necessário utilizar outra proporção.
D.7 Procedimento
D.7.1 Pré-enriquecimento não seletivo
Preaquecer a BPW à temperatura ambiente antes do uso.
Homogeneizar bem as amostras, utilizando as formas mais adequadas para o tipo de amostra.
Pesar a amostra e adicioná-la à quantidade apropriada de BPW (ver D.6). Incubar os frascos
a 37 °C ± 1 °C, por 18 h ± 2 h.

D.7.2 Enriquecimento seletivo
Deixar as placas de MSRV à temperatura ambiente, caso tenham sido armazenadas a uma temperatura
baixa.
Inocular as placas de MSRV com 3 gotas da cultura incubada na BPW. Convém que as três gotas
totalizem 0,1 mL e sejam colocadas separadamente e igualmente espaçadas sobre a superfície
do meio.
Ao retirar uma subcultura da BPW, é muito importante não agitar as amostras de material particulado.
Portanto, convém que os recipientes sejam movidos com cuidado, sem serem misturados, agitados
ou rodados. O objetivo é retirar um inóculo do maior volume líquido livre mais próximo da interface
entre o recipiente e a superfície da cultura, mas é aconselhável ir mais fundo se houver partículas
flutuando na superfície.
Incubar as placas MSRV inoculadas a 41,5 °C ± 1 °C, por 24 h ± 3 h.
Não inverter as placas.
Placas positivas irão mostrar uma zona turva cinza-branca, que se estende desde a gota inoculada.
A zona turva é caracterizada por uma auréola branca com uma aresta claramente definida.
Se as placas forem negativas após 24 h, reincubar por mais 24 h ± 3 h.
D.7.3 Plaqueamento seletivo
Deixar as placas de ágar xilose lisina desoxicolato (XLD) e as placas do segundo meio de plaqueamento
seletivo (ver 5.2.4.2) à temperatura ambiente, se elas forem armazenadas a temperaturas baixas.
Se necessário, secar a superfície das placas, antes da utilização.
Repicar as culturas das placas de MSRV positivas:
Observar a placa MSRV (se necessário, em uma superfície branca ou em caixa de luz). Determinar onde
é o ponto mais distante de propagação do crescimento opaco dos pontos de inoculação e mergulhar
uma alça de 1 μL dentro da fronteira do crescimento. Retirar a alça, garantindo que nenhum pedaço
grande de MSRV seja extraído. Inocular a superfície de uma placa de XLDL, de modo que colônias bem
isoladas sejam obtidas. Proceder da mesma forma com o segundo meio de plaqueamento seletivo,
utilizando uma nova alça estéril.
NOTA Para plaquear pouco material do MSRV (utilizar uma alça de 1 μL), colônias bem isoladas podem
ser obtidas, utilizando-se apenas uma placa de Petri de tamanho padrão (90 mm a 100 mm) com ágar
seletivo. Portanto, a utilização de placas maiores (140 mm) não é necessária.
Incubar as placas XLD, invertidas, a 37 °C ± 1 °C por 24 h ± 3 h.
Incubar o segundo meio de plaqueamento seletivo de acordo com as instruções do fabricante.
Retornar as placas MSRV negativas para a incubadora a 41,5 °C e incubar por mais 24 h ± 3 h.
Executar o procedimento de plaqueamento seletivo se, após 48 h de incubação, estas placas MSRV
tornarem-se positivas.
Colônias típicas de Salmonella cultivadas em ágar XLD apresentam um centro negro e uma zona
levemente transparente de cor avermelhada, devido à mudança de cor do indicador.

Variantes de Salmonella H2S negativas (por exemplo, Salmonella Paratyphi A), cultivadas em ágar
XLD, são cor de rosa, com um tom rosa mais escuro no centro. Salmonella lactose-positiva cultivadas
em ágar XLD são amarelas, com ou sem escurecimento (ver também 9.4.4).
Verificar o segundo meio de plaqueamento seletivo após o tempo de incubação apropriado para a presença
de colônias que, pelas suas características, sejam consideradas colônias presuntivas de Salmonella.
D.7.4 Confirmação
Para confirmação das colônias típicas, isoladas em meios de plaqueamento seletivos, seguir
as instruções dadas em 9.5. Em 9.5.2, é recomendado estriar as colônias isoladas dos meios
de plaqueamento seletivos em ágar nutriente antes de realizar a confirmação bioquímica. No entanto,
esta etapa adicional não é necessária se colônias bem isoladas (de uma cultura pura) estiverem
disponíveis nos meios de plaqueamento seletivos. Se este for o caso, realizar a confirmação bioquímica
diretamente em uma colônia típica (suspeita), a partir de colônias bem isoladas de cada meio seletivo.
D.8 Expressão dos resultados

Ver Seção 10.
D.9 Relatório de ensaio

Ver Seção 11.
D.10 Garantia da qualidade

Ver Seção 12.
Para o ensaio de desempenho do meio, seguir as recomendações das ISO/TS 11133-1 e ISO/TS
11133-2. No entanto, nestes documentos, os procedimentos fornecidos são para caldos seletivos,
bem como para meios de plaqueamento seletivos para a detecção de Salmonella, mas não para
meios semissólidos, como MSRV. O procedimento descrito abaixo pode ser utilizado para ensaiar
o desempenho do MSRV e baseia-se no procedimento e cepas de ensaio, descritos para os meios
seletivos (de enriquecimento) para a detecção de Salmonella (por exemplo, RVS e MKTTn, ver B.2 e
B.3) em ISO/TS 11133-2.
O procedimento descrito a seguir, foi extraído da ISO/TS 11133-2:2003, 5.4.2.1, mas com uma con-
centração adaptada das cepas de ensaio. O procedimento, cepas de ensaio e critérios encontram-se
resumidos na Tabela D.1.
— Inoculação dos microrganismos-alvo: Inocular, para cada organismo de ensaio, com ca.
104 ufc/0,1 mL, o meio MSRV (para a preparação do inóculo, ver ISO/TS 11133-2:2003, 5.2.1).
— Inoculação dos microrganismos não alvo: Inocular, para cada organismo de ensaio, com
105 a 106 ufc/0,1 mL, o meio MSRV (para a preparação do inóculo, ver ISO/TS 11133-2:2003,
5.2.1).
— Inoculação dos microrganismos-alvo e não alvo como uma cultura mista: Inocular com uma cultura
mista contendo ca. 104 ufc/0,1 mL de microrganismos-alvo e 105 a 106 ufc/0,1 mL de microrganis-
mos não alvo o meio MSRV (para a preparação dos inóculos, ver ISO/TS 11133-2:2003, 5.2.1).
Incubar as placas MSRV a 41,5 °C ± 1 °C e avaliar as placas após 24 h ± 3 h e após 48 h ± 6 h.

Tabela D.1 – Ensaio de desempenho de MSRV

Concentração
final no Incubação
Função Cepas de controle Critérios
inoculo de MSRV
de 0,1 mL
Especificidade S. Typhimurium ATCC 14028 ou 104 ufc 41,5 °C ± 1°C, Cinza-branco,
S. Enteritidis ATCC 13076 2 × 24 h ± 3 h zona turva que
se estende
desde o ponto de
inoculação. Após
48 h, as zonas
turvas das 3 gotas
terão migrado
(quase) totalmente
sobre a placa.
Seletividade E. coli ATCC 25922 ou ATCC 8739 Possível
crescimento no
41,5 °C ± 1 °C,
E. faecalis ATCC 29212 105 a 106 ufc local da gota
2 × 24 h ± 3 h
ou ATCC 19433 inoculada sem zona
turva.
Produtividade S. Typhimurium ATCC 14028 ou S. 104 ufc 41,5 °C ± 1 °C, Cinza-branco,
Enteritidis ATCC 13076 2 × 24 h ± 3 h zona turva que se
+ estende desde
o ponto de
inoculação. Após
48 h, as zonas
turvas das 3 gotas
terão migrado
(quase) totalmente
sobre a placa.
E. coli ATCC 25922 ou ATCC 8739 105 – 106 ufc Possibilidade extra:
+ subcultivar com
alça de 1 μL no
limite da borda
da zona opaca de
crescimento
e espalhar sobre
o XLD. Incubar
P. aeruginosa ATCC 27853 105 – 106 ufc a 37 °C ± 1 °C
durante
24 h ± 3 h. Critérios:
crescimento de
maioria de colônias
características.
NOTA Em geral, S. Typhimurium vai mostrar um crescimento mais rápido e zonas de migração maiores
do que S. Enteritidis.

Bibliografia
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amostras, da suspensão inicial e das diluições decimais para análise microbiológica – Parte 2:
Regras específicas para o preparo de carne e produtos cárneos
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[3] ISO 6887-4, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial
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NBR Iso 6579

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Documento impresso em 03/03/2021 15:11:16, de uso exclusivo de INSTITUTO FEDERAL DO ESPIRITO SANTO

NORMA ABNT NBR

Microbiologia de alimentos para consumo

ICS 07.100.30 ISBN 978-85-07-04975-3

© ISO 2002 - © ABNT 2014

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ii © ISO 2002 - © ABNT 2014 - Todos os direitos reservados

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Prefácio Nacional ...............................................................................................................................iv

4.2 Pré-enriquecimento em meio não seletivo líquido..........................................................2

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9.5 Confirmação .......................................................................................................................7

11 Relatório de ensaio ..........................................................................................................11

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B.3.4.2 Preparação ........................................................................................................................17

B.5.2 Preparação ........................................................................................................................18

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B.10.3 Solução de solução etanólica de 1-naftol ......................................................................22

B.11.1.1 Composição ......................................................................................................................23

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D.7.3 Plaqueamento seletivo.....................................................................................................32

Tabela 2 – Interpretação dos ensaios confirmatórios ....................................................................11

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A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Foro Nacional de Normalização. As Normas

Escopo desta Norma Brasileira em inglês é o seguinte:

Subject to the limitations discussed in the Introduction, this Standard is applicable to

— products intended for human consumption and the feeding of animals;

— environmental samples in the area of food production and food handling.

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NORMA BRASILEIRA ABNT NBR ISO 6579:2014

Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal — Método

Sujeita às limitações discutidas na Introdução, esta Norma é aplicável a

— produtos destinados ao consumo humano e animal;

— amostras ambientais na área de produção e manipulação de alimentos.

ATENÇÃO – O método pode não recuperar a totalidade de Salmonella Typhi e Paratyphi.

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4.2 Pré-enriquecimento em meio não seletivo líquido

Para certos produtos alimentícios, a utilização de outros processos de pré-enriquecimento é necessá-

4.3 Enriquecimento em meios líquidos seletivos

O caldo RVS é incubado a 41,5 °C ± 1 °C por 24 h ± 3 h, e o caldo MKTTn a 37 °C ± 1 °C, por 24 h ± 3 h.

4.4 Plaqueamento e identificação

— ágar xilose lisina desoxicolato (ágar XLD);

O ágar XLD é incubado a 37 °C ± 1 °C e examinado após 24 h ± 3 h. O segundo ágar seletivo

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4.5 Confirmação da identidade

5 Meios de cultura, reagentes e soros

Para a prática laboratorial atual, ver ISO 7218.

5.2 Meios de cultura e reagentes

5.2.1 Meio de pré-enriquecimento não seletivo: água peptonada tamponada

5.2.3 Segundo meio de enriquecimento seletivo: Caldo Muller-Kauffmann tetrationato

5.2.4 Meio seletivo sólido para plaqueamento

5.2.4.1 Primeiro meio: ágar xilose lisina desoxicolato (ágar XLD)

5.2.4.2 Segundo meio

5.2.5 Ágar Nutriente