Eletroforese de DNA

Gabriel M. Matos
Nicolas Conceição
Eletroforese

• Usada para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA;

• Bastante sensível, capaz de detectar até 20 pg de DNA;

• Permite a recuperação dos fragmentos após a separação.

Eletroforese em gel de agarose
Eletroforese em gel de agarose

Etapas da eletroforese

1) Preparo do Gel
Agarose ou Poliacrilamida

2) Migração

3) Visualização dos fragmentos

Tipos de géis

A escolha da matriz de separação usada depende

principalmente do tamanho dos fragmentos analisados.

Agarose: Separa fragmentos de tamanhos muito distantes (100 –

3.000 pb)

Poliacrilamida: Maior resolução. Separa fragmentos com até 1 pb

de diferença.
Tipos de géis

Agarose: polímero linear composto por resíduos de galactose

unidos por ligações glicosídicas.
Tipos de géis

Algas rodophytas utilizadas na

extração do ágar

A porcentagem utilizada é
medida em peso/volume
Tipos de géis

A agarose não é solúvel em temperatura ambiente e precisa ser aquecida e

resfriada para formação do gel (Gelificação)

32 - 45°C
80 - 95°C
Tipos de géis

Concentração do Faixa de separação

gel ( w/v %) de DNA (kb)
0.3 5 – 60
0.6 1 – 20
0.7 0.8 – 10
0.9 0.5 – 7
1.2 0.4 – 6
1.5 0.2 – 3
2.0 0.1 – 2
Sambrook et al., “Molecular Cloning” 3 ed - 2000
1% 0,3%
Tipos de géis
Tipos de tampões

Solução Tampão:

• Manter pH estável (H+ e OH- podem influenciar na carga líquida

da molécula)

• Maior força iônica (carrega mais corrente que a água)

Tipos de tampões

• Tris-Acetato e EDTA – TAE

• Tris-Borato e EDTA - TBE

Qual escolher??
• Tris-Fosfato e EDTA - TPE
Tipos de tampões

• Tris-Acetato e EDTA – TAE

Melhor resolução para fragmentos maiores.

• Tris-Borato e EDTA - TBE

• Tris-Fosfato e EDTA - TPE

Tipos de tampões
Diferença entre gel feito com Tampão e Água
Tipos de tampões

• Gel-Loading Buffer: usado para aumentar a densidade da

amostra e dar cor a amostra;

Azul de Bromofenol (migra mais rápido)

Xileno Cianol
Sacarose / Glicerol / Ficoll
Tipos de tampões
Corrida
Corrida

Os ácidos nucleicos apresentam

uma carga líquida negativa.

Com aplicação de uma corrente

elétrica eles migram em direção
ao polo positivo

Corrente elétrica
Corrida
Corrida
Migração

Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:

• Tamanho da molécula de DNA;

Migração

Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:

• Tamanho da molécula de DNA;

• A concentração de Agarose;
Poliacrilamida

Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de

acrilamida e bis-acrilamida.

Maior poder de resolução (até 1 pb)

Poliacrilamida

Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de

acrilamida e bis-acrilamida. Dependente de radicais livres (PAS e
TEMED)
Poliacrilamida

Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de

acrilamida e bis-acrilamida.
Visualização dos fragmentos

PCR

Eletroforese

Visualização
Visualização dos fragmentos

PCR

Eletroforese

Visualização
Visualização dos fragmentos

• Colorimétrico

• Fluorescência
Visualização dos fragmentos

• Corantes
Nitrato de prata

Alta sensibilidade
Visualização dos fragmentos

Prata
• Corantes
Nitrato de prata
DNA

Alta sensibilidade
Redução da prata

Cor
Visualização dos fragmentos

Prata
• Corantes
Nitrato de prata
DNA

Alta sensibilidade
Redução da prata

Cor
Visualização dos fragmentos

Fluorescência
Visualização dos fragmentos

Intercalantes de DNA
Visualização dos fragmentos

Intercalantes de DNA

• Moléculas que se inserem entre os pares de

bases do DNA
Visualização dos fragmentos

Intercalantes de DNA
A T

• Moléculas que se inserem entre os pares de

bases do DNA C G

A T
Visualização dos fragmentos

Intercalantes de DNA
A T

• Moléculas que se inserem entre os pares de

bases do DNA C G

A T
Visualização dos fragmentos

Intercalantes de DNA
A T

• Moléculas que se inserem entre os pares de

bases do DNA C G

A T
Visualização dos fragmentos

Intercalantes de DNA

• Moléculas que se inserem entre os pares de

bases do DNA

• Fluorescência mais visível quando ligados

ao DNA
Visualização dos fragmentos

Água age como uma

Intercalantes de DNA molécula “quencher”
absorvendo a fluorescência.

• Moléculas que se inserem entre os pares de

bases do DNA

• Fluorescência mais visível quando ligados

ao DNA
Visualização dos fragmentos

Intercalantes de DNA

• Moléculas que se inserem entre os pares de

bases do DNA

• Fluorescência mais visível quando ligados

ao DNA

• Como emitem fluorescência?

Visualização dos fragmentos

Intercalantes de DNA
A T
• Absorvem luz em um comprimento de
onda e emitem em um comprimento
menor (menos energia)
C G

A T
Visualização dos fragmentos

• Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese

Visualização dos fragmentos

• Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese A T

A T C G

C G
A T
A T
A T A T
C G
C G
A T
A T A T

C G A T

A T C G

A T
Visualização dos fragmentos
Brometo de Etídio

• Intercalante muito utilizado para visualização do DNA

Visualização dos fragmentos
Brometo de Etídio

• Intercalante muito utilizado para visualização do DNA

• Excitação em luz UV

• Emissão em luz laranja/vermelho

Visualização dos fragmentos
Visualização dos fragmentos
Brometo de Etídio

• Intercalante muito utilizado para visualização do DNA

• Pico de excitação em 285 nm (luz UV)

• Pico de emissão em 605 nm (luz laranja/vermelho)

• É considerado tóxico
Visualização dos fragmentos

Intercalantes alternativos

• Blue Green
• SYBR Green
• GelRed
• GelGreen
Visualização dos fragmentos

Mas isso é do
tamanho
esperado?
Visualização dos fragmentos

Mas isso é do
tamanho
esperado?
Interpretação de Resultados
Presença ou ausência
Interpretação de Resultados
Presença de fragmentos de diferentes tamanhos

500 pb

300 pb
Interpretação de Resultados
Expressão diferencial de determinado gene
Interpretação de Resultados
Expressão diferencial de determinado gene