Aplicação de marcadores genéticos autossómicos

em identificação humana

Cíntia Alves

ABZ da Genética Humana, 31 Março 2006

Historial
~1980

Primeiros marcadores de DNA capazes de distinguir indivíduos - RFLPs

(Restriction Fragment Length Polymorphisms):

uso de enzimas de restrição – reconhecem (“cortam”) locais com

sequências específicas de DNA;

detecção dos fragmentos de DNA obtidos (alelos) - com base em

variações de tamanho e visualização através de sondas radioactivas
(sequências de DNA complementares ao fragmento em estudo) - Southern
Blotting.
RFLP
~1985

Descoberta dos VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats):

regiões com um número variável de unidades de repetição

(± entre 10 e 100pb);

elevado número de alelos;

corte com enzimas de restrição (sem afectar as regiões com

os VNTRs) e utilização de várias sondas (multilocais);

padrão de fragmentos de DNA observado é característico de

indivíduo para indivíduo - Impressão Digital de DNA
(Alec Jeffreys, Leicester, Inglaterra).
VNTR
V ? 1 2 3
A título de curiosidade…

1987

Na Inglaterra, o primeiro caso criminal é resolvido com provas de DNA

(violação e morte de duas jovens)

Comparação (por VNTRs)

DNA a partir do sémen DNA de cerca de 5000 homens

recuperado das jovens com da região onde foi cometido o
crime

Uma amostra partilhava o mesmo padrão que a obtida no local do crime

Colin Pitchfork ficará na História como o 1º a ter sido condenado a prisão perpétua
devido ao seu próprio DNA.

Também o suspeito inicial de um dos assassínios (Rodney Buckland) cairá na

História como o 1º a ter sido ilibado graças à tecnologia do DNA.
 ~1985

“I do my best thinking while driving“…

…while cruising in a Honda Civic on Highway 128

from San Francisco to Mendocino.

Kary Mullis
Prémio Nobel de Química, 1993

Polymerase Chain Reaction

 1º ciclo 2º ciclo 3º ciclo

1-desnaturação do DNA (± 95°C)

2-annealing dos primers (± entre 50-65°C)
3-extensão pela polimerase (±72°C)
STR (Short Tandem Repeats)
Desde o início dos anos 90 têm vindo a ser os marcadores genéticos de escolha
nas áreas forense e de investigação de parentescos.

Vantagens dosUm
STRs:
par de cromossomas
homólogos
- fácil e rápida amplificação por PCR (<350 pb)
- elevado polimorfismo
- detecçãoMaterno
simples Paterno
A
A
A
A T
3 Repetições A A 4 Repetições
A A
T A
A T
A A
A A
Alelo 3 T A Alelo 4
A T
A A
A A
T A
T
 Selecção de STRs para uso em identificação humana

- elevado grau de variabilidade (elevado polimorfismo) na população

- elevado poder de discriminação (elevada heterozigotia)

- fragmentos amplificados deverão ser de fácil distinção (unidade repetitiva

Estudo populacional prévio
regular, tetras e pentas, de preferência)

- baixo grau de fragmentos não específicos (“fantasma”, “slippage”)

- baixo grau de mutação

Frequências alélicas
- devem ser previamente testados para assegurar que as técnicas empregues
são robustas e reprodutíveis

- segregação independente

- relativa facilidade de amplificação em multiplex

Técnicas de
análise de
DNA (STRs)
 DNA DNA PCR:
PCR:amplificação
Colheita DNA DNA amplificação
extracção
extracção quantificação
quantificação de
de múltiplosSTRs
múltiplos STRs

separação e detecção dos genotipagem

produtos de PCR
(alelos dos STRs)

comparação do genótipo da
amostra com outros produção do relatório
resultados

comparação do perfil de DNA

usando bases de dados
populacionais
 Cabelo Saliva
Sangue
Sémen Osso
Esfregaço bocal Urina
Dentes

Outro tecidos biológicos

Manchas
Extracção de DNA

Chelex – rápido, menos eficiente

Orgânica – lento, mais eficiente

Kits comerciais
Amplificação de DNA por PCR

Kits Multiplex (comerciais ou próprios)

vários STRs amplificados na mesma reacção de

PCR (vários pares de primers específicos para
cada locus marcados com fluorescência)

possível, devido à evolução tecnológica…

Passamos de… para
Tamanho
+
D8S1179 D21S11 CSF1PO
D7S820

D3S1358 TH01 D13S317

D16S539 D2S1338

Intensidade
D19S433 VWA
TPO D18S51

Amel
D5S818
FGA

-
+ Tamanho

D8S1179 D21S11 CSF1PO

D7S820

D3S1358 TH01 D13S317

D16S539 D2S1338

Intensidade
D19S433 VWA
TPO D18S51

Amel
D5S818
FGA

ELECTROFORESE
“vou correr um gel”

“vou pôr as amostras a correr”

 AmpFlSTR® Identifiler™ (Applied Biosystems)

D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO

TH01 D13S317
D3S1358 D16S539 D2S1338

D19S433 VWA TPOX D18S51

D5S818
AMEL FGA

4+1 cores
As empresas fornecem ladders de alelos para facilitar a
genotipagem
 D8 Identifiler™ kit (Applied Biosystems)

TH01
D13
D19 D5 VWA
TPOX D16
AMEL D21 CSF
D3 FGA
D18 D2
D7

PowerPlex® 16 kit (Promega Corporation)

D8
D18 CSF Penta E
D5 D21
AMEL D7
VWA
D3 TH01 D13 Penta D
D16 FGA
TPOX

Com 2 kits comerciais – total de 17 STRs analisados (13 são comuns a ambos)
Controle de qualidade interno
 Perfil genético individual

LOCI João Silva

CSF1PO 10
D2S1338 17-18
D3S1358 17-18
D5S818 11
D7S820 9
D8S1179 12-15
D13S317 11-12
D16S539 11
D18S51 14-16
D19S433 13-14
D21S11 29-30
FGA 22-23
PD 8-12
PE 5-13
TH01 7-8
TPO 8-11
VWA 17-19
Parentescos
 Maria José

M P

4-8 5-5
João

5-8
 GenePrint® Powerplex™ 16 System (Promega)

D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Penta E

Pretenso pai
1 14-18

Mãe
16-17
2

“Inclusão”
Filho
3 17-18
 GenePrint® Powerplex™ 16 System (Promega)

Amel. vWA D8S1179 TPOX FGA

16-18 Pretenso pai

r
1

18 Mãe
2
“Exclusão”
14-18 Filho
r
3
Observação de compatibilidade genética em todos os STRs analisados
LOCI Pretenso Pai Mãe Filho
CSF1PO 10 9-11 9-10
D2S1338 17-18 20-25 18-25
D3S1358 17-18 15-17 15-17
D5S818 11 12 11-12
D7S820 9 8-10 8-9
D8S1179 12-15 13-14 12-13
D13S317 11-12 11-12 11
D16S539 11 8-11 8-11
D18S51 14-16 13-17 14-17
D19S433 13-14 14 14
D21S11 29-30 29 29
FGA 22-23 22-23 23
PD 8-12 9-12 12
PE 5-13 12-13 12-13
TH01
TPO
7-8
8-11
6-9.3
9-11
> 99,99% 8-9.3
8-9
VWA 17-19 16-19 16-17

Resultado emitido sob a forma de uma probabilidade de paternidade

O peso dos resultados genéticos obtidos é quantificado estatisticamente e o seu cálculo

baseia-se unicamente nas frequências dos alelos na população em causa.
 Caso se observe incompatibilidades em muitos STRs

LOCI Pretenso Pai Mãe Filho

CSF1PO 10-12 12 11-12
D2S1338 17-20 19-21 19-23
D3S1358 14-16 15-16 16-17
D5S818 11-12 11-13 12-13
D7S820 10-11 8-10 8-14
D8S1179 12-13 13-14 13-14
D13S317 11-13 11-12 11
D16S539 9-11 10-13 10-11
D18S51 12-17 12-16 15-16
D19S433 12-13 14-17 14-15
D21S11 29-31.2 31.2-32.2 32.2-33.2
FGA
PD
23-26
11-13
22-26
2.2-13
“Paternidade 24-26
9-13
PE 7-13 5-12 praticamente 5-16
TH01 6-9.3 7-8 8-9
TPO 8-10 9-11 nula” 8-11
VWA 17-18 14-19 14-19

hipótese de não paternidade prevalece

Mas…

LOCI Pretenso Pai Mãe Filho

CSF1PO 10-11 10-11 10-11
D2S1338 17 18-20 17-20
LOCI
D3S1358 Pretenso
14-15 Pai Mãe
14-16 14Filho
CSF1PO
D5S818 10-11
11-14 1210-11 10-11
12-13
D7S820
D2S1338 8-12
17 11
18-20 11-12
17-20
D8S1179
D3S1358 11
14-15 13-14
14-16 11-14 14
D13S317
D5S818 11-12
11-12 11-1212 1212-13
D16S539
D7S820 12
8-13 11-1211 1211-12
D18S51
D8S1179 12-13
11 16-17
13-14 13-16
11-14
D19S433
D13S317 13
11-12 13-15
11-12 13-15 12
D21S11
D16S539 28-32.2
11 30-31.2
11-12 30-32.212
FGA
D18S51 21-24
12-13 20-24
16-17 20-24
13-16
PDD19S433 9-13
13 12-13
13-15 9-13
13-15
PED21S11
11-X
11-16
11-12
11-13 11-13
12-X
28-32.2 30-31.2 30-32.2
TH01
FGA 6-9.3
21-24 6-9.3
20-24 6-9.3
20-24
TPO
PD 8-10
9-13 8-9
12-13 8-99-13
VWA 18 16-19 16-18
PE 11-16 11-13 11-13
TH01 6-9.3 6-9.3 6-9.3
TPO 8-10 8-9 8-9
VWA 18 16-19 16-18
mutação
C

Genótipo real: 9-11

Só se visualiza o alelo 11
 Nº e tipo de familiares acessíveis

Relações familiares complexas podem ser investigadas de várias

formas, recorrendo também a outros “instrumentos”…
Cromossoma Y
Cromossoma X
mtDNA
Genética Forense
episódio do CSI
+ H2O

~ 2 seg.
 - tipos de amostra/tipo de crime
- tipos de substrato
- agressões ambientais

Cada caso é um caso

Desafio:
- obtenção de resultados fiáveis e informativos
Problemas mais comuns…
- tipo de amostra
Ex: - Cabelos sem raiz, ossos – mtDNA
- Agressões sexuais – sémen – extracção diferencial

- contaminação
- quantidade de amostra

- qualidade da amostra (degradação do DNA)

- manchas – misturas de perfis genéticos

(questões de interpretação)
No último Congresso da ISFG (Açores, Setembro 2005) foi criada
uma Comissão para os assuntos bioestatísticos e interpretação
de misturas em manchas.
DNA degradado (“partido”)

15 anos à temp. ambiente

6 anos a -20 oC
Mini STRs
primer
convencional primer
(kit comercial) miniSTR

Região repetitiva
do STR primer primer
miniSTR convencional
(kit comercial)
 2006

…it was recommended that existing multiplexes are re-engineered to enable small
amplicon detection, and that three new mini-STR loci with alleles <130 bp (D10S1248,
D14S1434 and D22S1045) are adopted as universal.
 2006 (in press)

Because significant time and investment is required to develop new multiplexes of

13+STR loci, manufacturers indicated that it would be preferable to adopt a staged
approach.
2005

A sua natureza bialélica torna-os atractivos por ser

possível a obtenção de amplicões mais pequenos.

No entanto…
2006 (in press)

“The Foren-SNP multiplex kit performed poorest out of the four assays tested in
this study.”

Desvantagens:
Apesar de haver técnicas/protocolos/tecnologias capazes de analisar centenas de SNPs
numa só análise, estas requerem maiores volumes de extracto de DNA, bem como de
produto de PCR.

Além disso, são técnicas que também requerem vários passos de manuseamento…

Interpretação de misturas é muito dificultada

Consequentemente

Parece que os STRs continuam a ser os preferidos e ainda devem ficar

por uns largos anos dado que, para além do elevado grau de
variabilidade, facilidade de análise e inclusão em formatos multiplex,
também beneficiam do facto de já fazerem parte das Bases de Dados
existentes.

Isto não implica que SNPs sejam esquecidos, dado que são um
instrumento muito útil em casos de amostras muito degradadas (ex:
desastres maciços), quando não é possível a obtenção de resultados
com STRs.

Review (Março 2006)

Butler, J.M. (2006) Genetics and genomics of core STR loci used in human identity testing. J.
Forensic Sci. 51(2): 253-265

Short Tandem Repeat DNA Internet DataBase - http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/

John Butler
 FIM

Obrigada pela vossa atenção!