Teste de Paternidade

Dr. Aulus Barbosa

 História do Teste de paternidade
 1920 – Tipo sanguíneo – 30% de eficácia
 1930 – teste sorológico – 40% de eficácia
 Rh, Kell, and Duffy
 1970 – HLA – 80% de eficácia
 Human Leukocyte Antigens
 3200 alelos diferentes

 1980 - Teste de RFLP – 99,99% de eficácia ou

mais
 1990 – Teste via PCR
 32 primers – 16 fragmentos
 Formas de coletar o material genético
para testes de paternidade
 Raspagem da mucosa bucal ou gengiva
 Coleta de sangue
 Amostra de cabelos
 Extração de DNA de sangue
 1 ml de sangue
 Adição de tampão SSC
 Centrifugação 12000 rpm por 1 min
 Adição de NaOAc e mistura em vortex
 Adicionar SDS 10% e proteinase K, misturar e incubar
1 hora a 55ºC
 Adicionar fenol e centrifugar 12.000 rpm
 Retirar o sobrenadante e adicionar etanol 100%,
incubar a -20ºC por 15 minutos.
 Centrifugar 2 minutos a 12.000 rpm
 Dissolver o DNA em água ou tampão TE
 Equipamentos básicos para a extração de DNA

Microcentrífuga Vortex

Micropipetas

Thermomixer Microtubos
Capela de fluxo
 Teste de paternidade por RFLP
 Restriction Fragment Lenght Polymorphism
 Descoberta das enzimas de restrição – 1968
 Polimorfismo
 Analisa modificações na seqüência de DNA no sitio
de restrição da enzima
 Procedimentos para análise de RFLP.
 Extração do DNA
 Digestão com enzimas de restrição
 104 a 107 fragmentos de digestão podem ser gerados por
uma única enzima.
 Eletroforese em gel de agarose
 Digestão com enzimas de restrição
 Digestão com enzimas de restrição

PONTAS CEGAS

PONTAS COESIVAS
 Eletroforese em gel de agarose
 Procedimentos para teste de paternidade por
RFLP
 Desnaturação do DNA no gel
 Transferência para membrana de nitrocelulose

 Fixação do DNA a membrana

 Hibridização com sondas

 Revelação em filmes ou phosphoimager

 Limitações dos Marcadores RFLP
 Processo caro e laborioso
 Utilização de sondas radioativas
 Não permite automação da técnica
 Marcadores de PCR primers específicos.
 Reação em cadeia da polimerase (Mulis e
Falona, 1987)
 Taq Polimerase
 DNA molde

 Primers

 dNTPs

 Termociclador
 Reação de PCR.
 Reação em cadeia da polimerase
 Análise de paternidade por Microsatélite
 Regiões repetidas em tandem
 1 a 6 nucleotídeos
 STR – Short tandem repeats
 Repetições perfeitas
 Repetições imperfeitas
 Repetições compostas
 Perfeitas
 Imperfeitas
 As regiões que flanqueiam os microsatélites são
conservadas entre diferentes indivíduos.
 Desenho de primers
 Utilização de várias reações diferentes com primers
diferentes
 Análise dos fragmentos em gel de poliacrilamida ou agarose
de alta resolução
Análise de paternidade usando PCR-STR no locus TH01.
 A variação no tamanho das bandas ocorre devido ao
número de unidades repetidas no microssatélite
 Características do teste PCR-STR
 Reprodutibilidade

 Simplicidade

 Pequena amostra de DNA

 Baixo custo

 Grande poder de resolução

 Altos níveis de polimorfismo

 Não usa reagentes radioativos

 Bibliografia
 Borém, A.; Caixeta, E. T. Marcadores Moleculares. Ed. Aluízio
Bórem e Eveline T. Caixeta, 2006, Viçosa-MG
 http://www.nature.com/scitable/topicpage/Paternity-Testing-
Blood-Types-and-DNA-374
 http://www.paternity-answers.com/history-paternity-test.html
 http://www.dnareference.com.br/hotsitecurso/aula/aula.htm
 http://www.progenetica.com.br/paternidade.htm