Aula TBM5 2022-2023

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UNIVERSIDADE DOS AÇORES

Faculdade de Ciências e Tecnologia
Departamento de Biologia
Ano Letivo de 2022-23 See More
Técnicas de Biologia Molecular
Amélia Fonseca (Professora Auxiliar - DB - FCT)

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A técnica de PCR foi inventada e desenvolvida por Kary Mullis (que
vendeu a patente Perkin-Elmer Cetus) – Prêmio Nobel de Química, em
1993.
ÿPCR é um método que permite um aumento rápido na concentração de um determinado DNA
fragmento in vitro.
ÿA maior invenção da Biologia do século XX.
ÿO procedimento é simples, e em poucas horas é possível sintetizar uma grande quantidade
de um determinado fragmento de DNA (106 vezes ou mais).
ÿA técnica de PCR apresenta uma grande diversidade de aplicações.

ÿO impacto da invenção da PCR foi tão grande que rapidamente se tornou uma das
técnicas amplamente utilizadas em Biologia Molecular, Medicina e Biotecnologia (não existem
alternativas):
ÿAmplificação seletiva de uma sequência específica de DNA alvo (dentro de todo o DNA
molécula)
ÿEficiente
ÿMais barato
ÿPrecisa apenas de uma pequena quantidade de amostra
ÿProduz várias cópias de fragmentos de DNA específicos

ÿA técnica de PCR é baseada no processo de replicação do DNA que ocorre in vivo, mas
que in vitro consiste em uma reação de polimerização do DNA que pode ser dividida em três etapas:
Desnaturação, Hibridização (Annealing) e Extensão (Alongamento).
ÿO equipamento utilizado na técnica de PCR é o Termociclador, e as três etapas de
A PCR ocorre no mesmo tubo, mas em temperaturas diferentes.
ÿA aplicação da técnica de PCR requer conhecimento de uma pequena parte do
seqüência de nucleotídeos do fragmento de DNA a ser amplificado.

ÿPrimers = são desenhados de acordo com a especificidade do segmento a ser copiado (em
geral, o iniciador consiste de 12 a 35 nucleotídeos).
ÿSão complementares às sequências que flanqueiam o fragmento de DNA a ser amplificado,
que se hibridizam em suas extremidades 3' para permitir a ação da DNA polimerase durante a
síntese da fita complementar, usando cada uma das duas fitas simples que constituem
o DNA para ser um modelo.

ÿAmplificação de DNA por PCR requer um certo
número de ciclos, e cada ciclo consiste em 3
fases:
1º Desnaturação
2º Recozimento
3º Extensão
1 ciclo de PCR leva menos de 2 min.
O DNA do tubo está duplicado.

Etapas de cada ciclo:
1- Desnaturação (fita de DNA
separação)
2- Recozimento (hibridização do
primers)
3- Extensão (síntese de DNA)

ÿA replicação in vitro semiconservativa resulta em 2 fitas duplas idênticas à

fio original.
ÿEm cada novo ciclo, os filamentos de DNA recém-sintetizados atuam como moldes.
Nota: À medida que os ciclos de amplificação
prosseguir, as moléculas de DNA resultantes
incluirá fragmentos de DNA mais curtos do que
o original, correspondente à região
situado entre e incluindo o
primers.
ÿAs três etapas podem ser repetidas várias
vezes (25 a 30 ciclos ou mais), possivelmente
aumentando a concentração de DNA pré-existente
duas vezes em cada ciclo.
ÿTeoricamente, após 25 ciclos de
amplificação, a concentração final de DNA
na solução é da ordem de 2 25 vezes
(embora, na prática, esse aumento seja de aproximadamente 1
milhões de cópias).
Cópias exponenciais do DNA modelo
A quantidade final de DNA:
N = N0 .2n
Condições de PCR para cada ciclo de amplificação:
1- Desnaturação do DNA alvo
A separação das duas fitas de DNA de fita dupla ocorre por calor (geralmente, o tubo é
aquecido a 90-95oC, ~30'' a 1').
2- Hibridização de primers (annealing)
Os primers são ligados a cadeias simples de DNA por pontes de hidrogênio. Para essa hibridização,
a mistura de reação é resfriada (geralmente a temperaturas entre 30 e 65oC, ~30'' a 1').
A temperatura depende do %GC da sequência a ser amplificada.

Nota: Como os primers são adicionados em excesso, a probabilidade deles se associarem aos locais de destino é
maior do que o recozimento das fitas complementares. Quanto mais longo o primer, maior
o Ta e a especificidade.
3- Extensão dos primers (65-75oC, ~1 a 5')
A síntese da fita complementar de cada fita molde de DNA. para DNA
síntese, além das quatro bases de nucleotídeos (ATP, GTP, CTP, TTP) e primers, DNA
polimerase (a enzima que catalisa a reação) é necessária, que geralmente é Taq DNA
polimerase (72oC).
A enzima adiciona os nucleotídeos (A, G, C, T) ao primer, fazendo uma cópia complementar

do modelo. Quando a fita complementar é formada, um ciclo de PCR é concluído.
ÿComponentes necessários para a solução de reação de PCR (mistura de PCR):
ÿ tampão adequado para o processo
ÿ Mg2+ (cofator): concentrações maiores ou menores de MgCl2 variam a especificidade do
produtos de PCR
ÿ dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
ÿ Primers específicos
ÿ Enzima DNA polimerase (ex. Taq DNA polimerase – 72oC)
ÿ DNA (modelo)
ÿComponentes da reação de PCR:
ÿágua – a qualidade da água é muito importante e pode influenciar a reação; use sempre o Milli Q
água, preferencialmente esterilizada em autoclave (volume final 20-100ml).
ÿTampão de reação - o tampão de reação de PCR é fornecido junto com a enzima polimerase e
vem em concentração 10x. É importante consultar o folheto que acompanha o
tampão para saber sua composição por causa da concentração de Magnésio, essencial para
o funcionamento da polimerase.
ÿdNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) – podem ser fornecidos na forma de Mix ou vir
separadamente e então a mistura é preparada para uso (usada na concentração de 10mM).

ÿPrimers - vêm na forma de pellets liofilizados. Reidratado com água estéril ou TE em
a concentração desejada.
ÿMg2+ - é um cofator da DNA polimerase. A concentração desse cofator na reação
pode variar e deve ser otimizado para cada enzima e material biológico. Magnésio
vem na forma de MgCl2 é fornecido junto com a enzima e o tampão de reação e
geralmente vem na concentração de 50mM.
ÿEnzima ou DNA polimerase – A mais utilizada é a Taq DNA polimerase, é a mais
componente caro da reação e o mais sensível, a maioria das DNA polimerases são
fornecido com um buffer específico.

ÿDNA template – A reação de PCR sempre começa a partir de um DNA template, extraído e
quantificado em um gel de agarose, ou a partir de uma amostra de RNA convertida em cDNA (complementar
ADN). Deve estar livre de impurezas (proteínas, lipídios, reagentes de extração, etc.)
concentração mínima de 5mg/ml. As diluições de DNA devem ser feitas em água ou em TE.
As concentrações de DNA genômico necessárias para a reação de amplificação variam dependendo
sobre a espécie.
Para a maioria das reações, a concentração ideal é de ~25-50ng.

Características da DNA polimerase
ÿAs enzimas (DNA polimerases) responsáveis pela replicação do DNA devem ser termoestáveis
em altas temperaturas, a fim de manter sua atividade após cada etapa e ser reutilizado em
ciclos subsequentes.
ÿA DNA polimerase mais conhecida e mais usada é a Taq DNA polimerase
termoestável, isolado da bactéria termofílica Thermus aquaticus. esta enzima
permanece estável em altas temperaturas (até 117oC), a temperatura ideal para a atividade
sendo ~72oC.
Algumas DNA polimerases usadas em PCR
Enzima Origem Termotolerância
Klenow Escherichia coli Não
Sequenase Bacteriófago T7 Não
Taq Thermus aquaticus sim
BstE Bacillus stearothermophilus sim
Pfu Pyrococcus furiosus sim
Tth Thermus thermophilus sim
UlTma Teratoga marítima sim

termociclador automático
Como a técnica de PCR envolve vários ciclos de amplificação, foram desenvolvidos equipamentos que
permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários sistemas de aquecimento e arrefecimento
ciclos.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
ÿO sucesso da técnica de PCR é estritamente dependente das concentrações relativas de
cada componente da solução de reação (dNTPs, primers, cátions metálicos divalentes, tampão,
enzima), bem como o programa de cada ciclo e o termociclador.
ÿPara cada objetivo é necessário um rigoroso trabalho de otimização das diferentes condições
até obter bons resultados – Protocolo PCR.

Fatores críticos da reação de PCR
ÿSeleção do primer ,
ÿConcentração de MgCl2 ,
ÿTemperatura de recozimento .
Precauções Parâmetros do ciclo térmico
ÿPureza e quantidade de DNA alvo na amostra (template),
ÿSeleção de primers ,
ÿPureza de outros reagentes usados e concentrações na mistura,
ÿParâmetros do ciclo térmico (otimização das temperaturas, tempos diferentes de cada estágio
de um ciclo, número de ciclos).

Tipos mais comuns de PCR (além do PCR convencional):
ÿRT-PCR (Reação em Cadeia da Polimerase Transcriptase Reversa)
ÿMultiplex PCR (amplificação de 2 ou mais fragmentos de DNA diferentes com primers específicos)
ÿNested PCR (dois PCRs simples para aumentar a sensibilidade de detecção)
ÿPCR competitivo
ÿPCR em tempo real (monitoramento PCR quantitativo em tempo real)
ÿRapidHIT ID System (permite a obtenção de perfis forenses de DNA em 90 min)

aplicações da técnica de PCR
ÿEsta técnica pode ser aplicada em qualquer situação que requeira a amplificação de um
Fragmento de ADN com vista à sua detecção, clonagem, caracterização ou sequenciação.
ÿPode ser usado para gerar quantidades apreciáveis de DNA mutante para construir mutantes em
genes específicos.
ÿEm conjunto com outras técnicas, permite identificar e estabelecer
relações filogenéticas entre indivíduos de suas amostras de DNA.

ÿPermite o estudo do DNA de organismos que não existem mais, como fósseis
amostras (múmias, plantas e animais já extintos).
ÿPermite a detecção de agentes infecciosos nos tecidos de tecidos potencialmente infectados
pacientes (já falecidos).
ÿPermite o diagnóstico e detecção de doenças genéticas.
ÿMuito utilizado em análises forenses para identificação individual (cabelos, gotas de sangue ou
saliva, células da pele ou impressões digitais).

Bibliografia:
ÿ Bartlett JMS & Stirling D., 2003. PCR Protocols, 2ª Ed, Humana Press, New Jersey.
ÿ Lima N. & Mota M. (Eds), 2003. Biotecnologia: fundamentos e aplicações. Lidel – Edições
Técnicas, Lda, Lisboa.
ÿWhite BA (Ed), 1993. PCR Protocols: Current Methods and Application. Imprensa Humana,
Nova Jersey.
ÿWinfrey MR, Rott MA & Wortman AT, 1997. Desvendando o DNA: biologia molecular para
o laboratório. Prentice Hall, Inc., Nova Jersey.
ÿhttps://www.youtube.com/watch?v=h2peadwu1zk
ÿhttps://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4

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A técnica de PCR foi inventada e desenvolvida por Kary Mullis (que

vendeu a patente Perkin-Elmer Cetus) – Prêmio Nobel de Química, em

ÿPCR é um método que permite um aumento rápido na concentração de um determinado DNA

ÿA maior invenção da Biologia do século XX.

ÿO procedimento é simples, e em poucas horas é possível sintetizar uma grande quantidade

de um determinado fragmento de DNA (106 vezes ou mais).

ÿA técnica de PCR apresenta uma grande diversidade de aplicações.

técnicas amplamente utilizadas em Biologia Molecular, Medicina e Biotecnologia (não existem

ÿPrecisa apenas de uma pequena quantidade de amostra

ÿProduz várias cópias de fragmentos de DNA específicos

Desnaturação, Hibridização (Annealing) e Extensão (Alongamento).

ÿO equipamento utilizado na técnica de PCR é o Termociclador, e as três etapas de

A PCR ocorre no mesmo tubo, mas em temperaturas diferentes.

ÿA aplicação da técnica de PCR requer conhecimento de uma pequena parte do

seqüência de nucleotídeos do fragmento de DNA a ser amplificado.

geral, o iniciador consiste de 12 a 35 nucleotídeos).

ÿSão complementares às sequências que flanqueiam o fragmento de DNA a ser amplificado,

o DNA para ser um modelo.

ÿAmplificação de DNA por PCR requer um certo

número de ciclos, e cada ciclo consiste em 3

1 ciclo de PCR leva menos de 2 min.

O DNA do tubo está duplicado.

Etapas de cada ciclo:

1- Desnaturação (fita de DNA

3- Extensão (síntese de DNA)

ÿA replicação in vitro semiconservativa resulta em 2 fitas duplas idênticas à

Nota: À medida que os ciclos de amplificação

prosseguir, as moléculas de DNA resultantes

incluirá fragmentos de DNA mais curtos do que

o original, correspondente à região

situado entre e incluindo o

ÿAs três etapas podem ser repetidas várias

vezes (25 a 30 ciclos ou mais), possivelmente

aumentando a concentração de DNA pré-existente

duas vezes em cada ciclo.

ÿTeoricamente, após 25 ciclos de

amplificação, a concentração final de DNA

na solução é da ordem de 2 25 vezes

(embora, na prática, esse aumento seja de aproximadamente 1

Cópias exponenciais do DNA modelo

A quantidade final de DNA:

Condições de PCR para cada ciclo de amplificação:

1- Desnaturação do DNA alvo

aquecido a 90-95oC, ~30'' a 1').

2- Hibridização de primers (annealing)

a mistura de reação é resfriada (geralmente a temperaturas entre 30 e 65oC, ~30'' a 1').

A temperatura depende do %GC da sequência a ser amplificada.

3- Extensão dos primers (65-75oC, ~1 a 5')

A síntese da fita complementar de cada fita molde de DNA. para DNA

A enzima adiciona os nucleotídeos (A, G, C, T) ao primer, fazendo uma cópia complementar

ÿComponentes necessários para a solução de reação de PCR (mistura de PCR):

ÿ tampão adequado para o processo

ÿ Mg2+ (cofator): concentrações maiores ou menores de MgCl2 variam a especificidade do

ÿ dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)

ÿ Enzima DNA polimerase (ex. Taq DNA polimerase – 72oC)

ÿComponentes da reação de PCR:

água, preferencialmente esterilizada em autoclave (volume final 20-100ml).

vem em concentração 10x. É importante consultar o folheto que acompanha o