Reação de Polimerização em

Cadeia - PCR

1-Introdução
2-Automatização da PCR
3-Sistema de reação
4-Iniciadores – primers
 A PCR é um sistema para a
replicação do DNA in vitro, que
permite que uma seqüência
“alvo” de DNA seja amplificada
em milhares de cópias em
apenas algumas horas.
 Introdução

 1985 – Primeira Publicação - Science

 Cetus Corporation – R. Saiki; F. Faloona; G. Horn; K.

Mullis; H. Erlichand; N. Arhneim.
 Descreveu a PCR: Fragmento específico de DNA
multiplicado milhares de vezes – amplificação
 1993 – Prêmio Nobel em Química
Kary Mullis
 Ciclos da PCR - Gráfico
Etapa 1: 1˚ Ciclo 2˚ Ciclo
DESNATURAÇÃO
94-96˚C por 30’

Etapa 3:
Etapa 2: POLIMERIZAÇÃO
ANELAMENTO 72˚C por 1min
50- 65˚C por 1min

Número de ciclos numa reação: 30 a 35

 Taq DNA Polimerase
 Bactéria termoestável Thermus aquaticus
Automatização da PCR
Ciclos com oscilações entre altas e baixas temperaturas,
controladas por computador

Termociclador
 Componentes da PCR

Mg 2+ Taq Polimerase

Tampão
10x

dCTP
H20 Milli-Q
dGTP
dNTP
dATP Iniciadores:
Forward/Reverse
dTTP
4-Iniciadores - primers

• Tamanho – entre 10 a 30 bases

• Composição de bases - ~50% de
G/C
• Seqüências – não devem ter
complementaridades intra ou inter
molecular
• Cálculo da Tm
4-Iniciadores - primers

Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos

iniciadores

• Do inglês: melting temperature

• Temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio
entre a formação e a dissociação dos híbridos
gerados pelo estabelecimento de pontes de
hidrogênio
• Para o cálculo:
• Tm= 2(A+T) + 4(G+C)
Medicina forense;

identificação de patógenos (diagnóstico molecular);

Genótipos (identificação de vírus, p. ex.)