Técnica de Laboratório de Biologia II – Resumos 6

PCR – Polymerase Chain Reaction

Visão geral: Técnica Rotineira de amplificação de um
fragmento de DNA de forma específica d o qual temos
de conhecer as extremidades.

Inicia-se com um passo de desnaturação seguido de

polimerização repetida do fragmento, fazendo uso de
polimerases de DNA, como por exemplo, a Taq
Polymerase que foi descoberta e isolada de um
organismo termófilo (Thermus aquaticus) e foi desde
então otimizada para o processo de PCR. A polimerase,
como todas, precisa de extremidades OH 3’ para iniciar
polimerização por isso são necessários oligonucleótidos
de iniciação – primers – para cada uma das cadeias para
os quais é necessário conhecer a sequência.

São utilizadas polimerases de termófilos devido à

necessidade de manutenção de atividade da enzima
durante os passos de desnaturação que ocorrem a temperaturas ~90ºC.

Uma mistura de PCR contém então: A reação é realizada num

aparelho contituido por uma placa de elevada condutividade,
normalmente de ouro, facto que encarece a técnica.

Antes existir esta tecnologia que r ealiza uma reação de ~30

ciclos num tempo médio de 1h30, realizava-se em banhos
termostatelizados, alternando o tubo entre os banhos de forma
manual e podia levar até 8h para 30 ciclos.

O passo de desnaturação inicial ocorre normalmente a

temperaturas entre 90 e 94ºC segue-se num período de
desnaturação cíclica que demora ~30’’. Depois ocorre um
período de annealing de primers, ocorrendo a uma T variável,
em norma, cerca de 5ºC inferior à T de melting dos primers.

Depois do passo de annealing, segue o tempo de

extensão/polimerização a T de 72ºC (T ótima da Taq) por um
tempo dependente da eficiência da enzima utilizada (o
fornecedor dá informação da velocidade da enzima (ex:
1kb/min) e adaptamos a duração deste passo consoante a
dimensão do nosso fragmento a ampliar (ex: com Taq que
sintetiza 1kb/min, faço um tempo de extensão de 90’’ se tiver
um fragmento de 1.5kb), é de realçar que se o fragmento for
superior a 3/5kb uma Taq normal não consegue ampliar, assim
precisamos de enzimas com maior capacidade de extensão: long
range polymerases.
O substrato da Taq são os dNTPs (os 4 tipos) que são adicionados em excesso à mistura reacional.

Passo Duração T
Desnaturação inicial 5’-10’ 94ºC
Desnaturação 30’’ 94ºC
Annealing de primers 30’’ T annealing
Extensão Duração variável 72ºC
Extensão final 5’-10’ 72ºC

Exemplo de um procedimento de PCR:

Quando começamos o 2º ciclo temos os produtos do

primeiro, isto é, duas moléculas em cadeia dupla cada
uma com uma extensão antes do primers, são por isso
designadas de cadeias longas. E assim se repetem os
passos ciclos originado 4 moléculas em cadeia dupla,
todas de cadeias longas. E assim, é apenas no 3º ciclo
que temos como produto a molécula que nos interessa
amplificar de forma exponencial – molécula com ambas
as extremidades definidas por primers. O número de
cópias da molécula é 2n, em que n é o numero de
ciclos.

O facto de as moléculas serem amplificadas de forma

exponencial levanta o risco de amplificação de uma
contaminação que em casos de diagnóstico pode levar
a falsos resultados. Assim, em clinicas de diagnostico as
reações de PCR são realizadas em câmaras de fluxo
laminar (clean room) com pipetas próprias que contém
pontas com filtros.

Parâmetros importantes para PCR:

Escolha de primers

Usamos um par de primers, o primers designado foward/up/sense associa-se à cadeia down e inicia
a extensão da cadeia foward: sequência igual à região 5’ da cadeia 5’­3’; já o primer
reverse/down/anti-sense associa-se à cadeia up, amplificando a cadeia down: sequência
complementar invertida da região 3’ da cadeia 5’-3’.

Os primers são sempre apresentados com nome, seguido da sequencia na orientação convencional,
seguida da T de melting:

pFw – NNNNNNNNNNNNN – Tm=XºC;

pRv – NNNNNNNNNNNNN – Tm=XºC

Há que ter em conta a orientação convergente dos primers, se os primers não forem bem
desenhados por erro na orientação não haverá extensão. Outros erros são: pode acontecer também
que haja amplificação de um fragmento errado (erro que só é detetado mais tarde) ou amplificação
de vários fragmentos (logo detetável em eletroforese), isso não é o que queremos, queremos
livrar-nos das hibridações inespecíficas.

Outros fatores importantes:

• Tamanho da sequência

Não pode ser muito grande, pois baixa a eficiência da reação por menor taxa de hibridação, nem
muito curtos, pois leva a menor especificidade e à possibilidade de ampliação de outros fragmentos.

Assim, fazemos cálculo probabilístico por forma a determinar o tamanho mínimo para o qual a
probabilidade de existência no nosso fragmento/ no genoma do organismo seja menor que 1 (no
entanto, em termos práticos a probabilidade é 1 porque o primer é uma sequencia que sabemos
existir no fragmento).

Nota usar o exemplo de 8 nucleótidos não daria 49000

primers possíveis pois era preciso que ocorre-se o outro
primer a uma distância que permitisse extensão, ainda assim a
probabilidade de hibridação inespecífica é elevada. Assim
temos de ajustar entre eficiência e especificidade, encontrando um equilíbrio para obter as
melhores condições possíveis.

• Temperatura de melting – T de desnaturação

T à qual 50% de uma molécula está desnaturada, os passos de desnaturação são realizados a
temperaturas superiores à T melting, queremos o DNA completamente desnaturado. O primeiro é
um passo muito longo devido à necessidade de desnaturação de por exemplo DNA cromossómico
total, já os passos de ciclos servem para desnaturar as moléculas ampliadas no ciclo anterior.

Fórmula mais prática: Tm= 2x(A+T)+4x(G+C) ex: 4Gs 5Cs 7As 1T – Tm=2x(7+1)+4x(4+5)=52ºC

Há, no entanto, outros métodos mais complexos, mas mais fiáveis.

• Temperatura de annealing é dependente da T de melting dos primers

É a T à qual ocorre a hibridação do primer com o fragmento a amplificar, e é normalmente 4/5ºC

inferior à T de melting dos primers, caso contrário apenas 50% dos primers hibridavam, não pode
no entanto ser muito baixa pois levaria a hibridações inespecífica de primers.

Ta<<<Tm: produtos não específicos

Ta>>>Tm: possibilidade de não hibridação dos primers

Os primers não podem ter diferença de Tmelting de 2/3ºC, caso contrários os primers não vão
hibridar da mesma forma não havendo amplificação correta.

• Conteúdo em GC

Influencia a T de melting pois uma molécula com elevado conteúdo GC é mais difícil de desnaturar.

• GC clamps

Uma estrutura que favorece a extensão, baseada na “força”

com que a extremidade 3’OH do primer está ligada ao DNA.
Quanto maior a quantidade de GC na extremidade do primer (5
nucleótidos finais) melhor a estabilidade com que se liga ao
DNA logo melhor primer. Um primer com %GC >50% nos
últimos nucleótidos é um bom primer.

• Possíveis estruturas secundárias

São de evitar formação de loops/hairpin e primer dímer porque

diminuem a eficiência da reação porque obtemos estruturas
pequenas que não nos interessam.

Primer dímer há sempre, é muito difícil evitar este tipo de

estruturas sendo que obtemos sempre uma banda mais leve
em eletroforese (Nota: O PCR é um passo intermédio e deve
sempre realizar-se eletroforese antes de prosseguir com o
procedimento, para confirmar a amplificação)

Podemos livrar-nos deles por purificação de DNA em coluna de sílica, por terem reduzida dimensão
não se associam à coluna, sendo eluviados.

• Repetições do mesmo nucleótido: pode aumentar a probabilidade de formação de estruturas

secundárias

• Evitar estruturas secundárias na cadeia molde

Ex: hairpin com a cadeia molde – vai diminuir a eficiência da reação porque a polimerase não se
conseguirá ligar

• Evitar regiões de homologia frequente

Devemos sempre realizar um blast antes de escolher primers para que haja apenas uma zona
complementar aos nossos primers

Escolha da enzima

Apesar da Taq polimerase ser a mais utilizada devido à sua relação eficiência/preço há outras
enzimas com diferentes features:

● Proofreading – exemplos: Pfu/Pho/ gama fusion

São enzimas mais caras mas garantem a fidelidade do produto de PCR
● Long Range – usadas para amplificar fragmentos maiores
● Capacidade de resistência a temperatura: útil para fragmentos com elevado conteúdo GC
Há que ter em conta:

● Concentração da enzima: excesso de enzima pode reduzir o rendimento e levar à formação

de produtos inespecíficos
● Concentração do DNA: pode inibir a reação
● Tampão da enzima: é dependente da enzima, as necessidades das enzimas são muito
variáveis, mas normalmente contêm: KCl, Tris, Mg2+(cofator da enzima), PEG e NSO.
● Concentração de magnésio: é um cofator essencial à atividade da enzima em tempo viável,
atua por forma a estabilizar a carga negativa dos grupos fosfato facilitando a hibridação do
primer com a cadeia, estabilizando os fosfatos gamma e beta, facilitam ainda a entrada do
DNA no Groove catalítico da enzima.

PCR como passo intermédio:

Qualquer que sejam os objetivos seguido realiza-se sempre uma eletroforese em gel de agarose por
fim a confirmar os resultados da amplificação (eficiência e rendimento), em seguida, pode fazer-se
clonagem, sequenciação, entre outros processo.

● PCR como forma de diagnóstico de polimorfismo: é uma técnica alternativa a sequenciação

na qual usamos enzimas de restrição que corte apenas se houver o polimorfismo em causa,
podemos ainda deteção inserções ou deleções por comparação de fragmentos (no entanto,
usando acrilamida se quisermos distinção ao nível do nucleótido, a agarose não têm essa
sensibilidade)
● Clonagem a partir de PCR:
o Clonagem TA: usada por pessoas poucos experientes, não por biólogos moleculares

Usam-se vetores com cauda T

o Introdução de locais de reconhecimento de enzimas na extremidade 5’ do primer,

sendo ampliado no PCR.

Adiciona-se a sequencia de reconhecimento da enzima que pretendemos usar nos

passos seguintes antes do inicio do primer, temos, no entanto, de adicionar alguns
nucleótidos para que a endonucleases consiga atuar, devido ao seu volume precisa de
algum DNA antes senão não consegue aceder a esta sequência.
Fidelidade de PCR

Taq (não tem proofreading) – maior taxa de erro, no entanto, não precisamos de muita precisão
para sequenciação. Introduz erros em posições aleatórias.

Pfu/Pho/phusion – usadas para clonagem devido à sua capacidade de proofreading, não queremos
os erros.