Biologia Molecular –

3ª Área

Transcrição
Transcrição

“A transcrição consiste na síntese de RNA a partir de

um molde de DNA”.

 Primeira etapa da expressão gênica

 Envolve apenas 1 fita de DNA (DNA molde)

 É realizada por um complexo enzimático cuja

enzima chave é a RNA polimerase

 Etapas: (1) iniciação, (2) elongação, (3) término.

Visão geral

Promotor = local onde a

RNA POLIMERASE se
liga e provoca a
abertura da dupla fita
de DNA.
Após a adição dos
ribonucleotídeos, a fita
dupla de DNA se fecha.
A RNA POLIMERASE para
quando alcança a
sequência terminal.
Transcrição procariotos X eucariotos

Complexidade do processo é maior em

eucariotos:
-Compartimentalização
-Necessidade de processamento
(splicing)
RNA polimerases

 catalisam toda a transcrição do DNA

 Estabelecem ligação entre a extremidade 3' OH de
um nucleotídeo com a extremidade 5' fosfato do
nucleotídeo seguinte= formam novas ligações
fosfodiéster
 Elongação ocorre no sentido 5'→3‘
 Utilizam como molde uma das fitas de DNA
 não necessitam de primer (ao contrário da DNA pol)
 não possuem atividade exonuclease (não corrigem
erros no RNA nascente)
 Seqüência tem sido conservada ao longo da
evolução
Não esquecer que:
1. RNA é fita simples
2. Contém ribose em
vez de desoxirribose
(açucar)
3. Contém A, C, G e U
(U substitui a T do
DNA)
Processo de transcrição em
procariotos

INICIAÇÃO

ELONGAÇÃO

TERMINAÇÃO
RNA polimerase procariotos

 Holoenzima RNA polimerase de E. coli

possui 5 subunidades.
 Seu centro catalítico se encontra no
chamado cerne da enzima (2’)
 Iniciação
 A síntese de RNA começa em regiões
do DNA chamadas de promotoras -
seqüências específicas reconhecidas
pela RNA polimerase
 Em procariotos
Região Promotora I = Sequência TATAAT
–10
 Sequência situada 10 nucleotídeos à
esquerda da primeira base do sítio de
início da transcrição
Região Promotora II = Sequência - 35 =
Sequência TTGACA
 Sequência situada 35 nucleotídeos à
esquerda da primeira base do sítio de
início da transcrição
 Promotores que possuem sequências similares às de consenso
são promotores fortes, que causam um frequente início de
transcrição. Já promotores com várias substituições nessas
regiões são promotores fracos, que têm a velocidade de
iniciação da transcrição várias vezes diminuída.

 A taxa de transcrição gênica também pode ser afetada:

 pela ligação de proteínas ativadoras e repressoras a sítios
próximos aos pontos de iniciação;
 pela distância entre as sequências de consenso dos
promotores, sendo a separação ideal igual a 17 nucleotídeos
(em procariotos).
Fator  (sigma)

 Subunidade da RNA pol que reconhece o

promotor e faz com que a ligação desta ao
DNA molde seja extremamente forte
 Após a sintese dos primeiros nucleotídeos
(8-10 nt), este é deslocado permitindo a
movimentação da RNA polimerase
(elongação).
 Elongação

Inicia-se após a dissociação da subunidade .

Durante essa fase, o RNA recém-sintetizado pareia-se temporariamente

com a fita molde de DNA, formando um híbrido curto RNA-DNA.

A cada nucleotídeo adicionado, o híbrido RNA-DNA gira,

fazendo com que a ponta 3’-OH do RNA fique no centro
catalítico da RNA polimerase.

Uma vez iniciada, a transcrição segue numa velocidade de aproximadamente

50 nucleotídeos por segundo, estando a RNA polimerase ligada à fita molde de
DNA até encontrar o sinal de término da transcrição.
Elongação

Vel=
50 nucleotídeos/s
Terminação
Terminação  (rho)-independente

 Essa classe é caracterizada por sintetizar RNA contendo região

autocomplementar palindrômica rica em GC e em AT e por possuir uma
seqüência de adenilatos na fita molde do DNA que são transcritos em
uridilatos na extremidade do RNA.
 O pareamento intramolecular das seqüências complementares do RNA
recém-sintetizado forma uma estrutura em grampo. Esse acontecimento
desencadeia os seguintes eventos:

 Parada da RNA polimerase;

 Destruição parcial do híbrido RNA-DNA (proporcionando instabilidade
da região que permanece ligada);
 Dissociação do RNA nascente da enzima RNA polimerase;
 Restabelecimento da região dupla-fita do DNA;
 Liberação da RNA polimerase da fita molde do DNA.
Inibidores de transcrição bacteriana
Muitos antibióticos inibem processos biológicos específicos. Entre
eles, a rifampicina e a actinomicina inibem o processo de
transcrição.

 Rifampicina
 As rifamicinas (derivadas de Streptomyces) e a rifampicina
(produto semi-sintético) inibem o início da transcrição por impedir
a formação da primeira ligação fosfodiéster da cadeia de RNA.

 Actinomicina
 A actinomicina D (também derivada de Streptomyces) inibe a
transcrição por ligar-se fortemente e especificamente ao DNA
dúplex e, assim, impedir que ele seja molde para a transcrição.
Transcrição em eucariotos

Diferenças:
1) Tem 3 RNA polimerases

1) Necessidade de proteínas chamadas fatores de

transcrição para sinalizar a etapa de iniciação da
transcrição
 Posicionam a RNA pol corretamente sobre o promotor

2) O DNA precisa ser “desempacotado” previamente

à transcrição
 Regiões promotoras associadas aos genes
eucarióticos:
 Sequência TATAAAA (TATA box), localizada a

25 nucleotídeos acima do local de início da

transcrição (região – 25 ou de Goldberg-
Hogness);
 Sequência GGCCAATCT (CAT box), localizada a
80 nucleotídeos acima do local de início da
transcrição (região – 80).
 Adicionalmente, existem unidades de controle da
transcrição designadas estimuladores (enhancers)
e silenciadores (silencers) que podem,
respectivamente, aumentar ou diminuir a eficiência
da transcrição.
Iniciação pela RNA pol II requer:
Reconhecimento pelos fatores de transcrição (TFIIA, TFIIB) do
promotor contendo sequência TATA (localizada a 25
nucleotídeos do local de início da transcrição)
 Enhancer (estimuladores)
 Sequências de DNA que aumentam a
afinidade da maquinaria de transcrição
por um certo promotor.
 podem estar localizados acima (upstream,
à esquerda), abaixo (downstream, à
direita), ou dentro do gene a ser transcrito
e podem também estar distantes muitos
milhares de pares de base deste, em
qualquer uma das fitas.
 Alguns enhancers atuam apenas em
células específicas.
 Acredita-se que as proteínas que se
ligam a enhancers causam uma
curvatura no DNA e permitem um acesso
mais fácil das proteínas da maquinaria
de transcrição a um determinado
promotor.
 Biologia Molecular –
3ª Área

Processamento de RNAm
 O que é?
Conjunto de alterações que ocorrem
no RNA (transcrito primário) logo
após a transcrição.

Eucariotos: o transcrito
primário necessita de
Procariotos: algumas alterações para
Sofrem pouco ou adquirir maior estabilidade
nenhum e caracterizar a molécula
processamento. Em de RNA que irá para o
geral, são traduzidos citoplasma ser traduzida.
ainda durante a sua
produção.
 Etapas principais do
processamento em eucariotos:

 Adição do cap 5';

 Splicing;

 Adição da cauda de poliadenilato;

(cauda de poli-A na extremidade 3´)
 Adição do 5´- cap
Primeiro evento do processamento do
RNA.

 Não ocorre em tRNA’s e rRNA´s, só nos mRNA’s e

e hnRNA’s.

 Confere maior estabilidade: protege da ação de

fosfatases e nucleases.

 Função: proteínas reconhecem e se ligam ao 5´-

cap e os ribossomos se ligam a elas, favorecendo
a tradução.
1. Um dos 3 fosfatos é
removido.
2. É adicionada uma
guanina.
3. A guanina é metilada
(CH3).
4. O 2º e o 3º nt são
metilados .

Estrutura
do 5´cap
 Adição da cauda de poliadenilato
 Cauda de poliadenilato (~200 resíduos de
adenina) na extremidade 3’ = cauda de
poli-A.

 Funções:
•  eficiência da tradução;
• Proteger o mRNA da digestão por nucleases
presentes no meio,  estabilidade da molécula;
• Possivelmente, transporte do mRNA para o
citoplasma.
Visão geral
 Etapas
1. Proteínas se ligam a
sequência consenso
AAUAAA.
2. Ocorre o corte
(ponta cortada é
degradada).
3. A poliadenilato
polimerase (PAP)
adiciona adeninas.
4. Proteína PABII
aumenta velocidade
de adenilação
(~200ª´s).
 Splicing
 Retirada dos íntrons de um RNA precursor, de
forma a produzir um mRNA maduro funcional.

 Requer uma extrema precisão das enzimas

envolvidas no processo.
• A falta ou o acréscimo de um único nucleotídeo em um
éxon pode levar a uma alteração da fase de leitura e à
produção de uma proteína completamente diferente da
original.
 A análise das sequências de milhares de uniões
íntro-éxon de eucariotos permitiu a definição
de consensos apresentados dentro dessa região
de corte.
 Íntrons geralmente:

 começam com uma sequência GU e termina com AG;

 contém uma seqüência de consenso no ponto de corte 5’:
AGGUAAGU;
 contém uma sequencia consenso no ponto de corte 3’: um
trecho contendo 10 pirimidinas (C ou U), seguidas por uma base qualquer, um C e uma
seqüência final AG (veja abaixo);

 contém um importante ponto interno, chamado de ponto de

ramificação, situado entre 20 e 50 nucleotídeos antes do ponto
de corte 3’ e que não é muito conservado nos mamíferos;

o restante do íntron é extremamente variável e não tem

muita importância no processo de splicing.
Remoção dos íntrons
 Spliceossomo
Grandes arranjos formados por snRNPs
e precursores de mRNA.
snRNPs: complexo formado por snRNA’s (small nuclear
RNAs) associado à proteínas

 snRNPs U1
 snRNPs U2

A união de U1, U2 e RNA com o complexo U4-U5-U6

forma o spliceossomo completo.
 Splicing Alternativo
Mecanismo biológico existente nas células
eucariotas que permite a produção de
uma variedade grande de proteínas a
partir de um pequeno número de genes.

• Um único gene contém vários éxons que

podem ser ligados de diferentes maneiras.

• A partir do mesmo gene, diferentes proteínas

podem ser produzidas.
Na espécie humana, admite-se a existência de apenas
25.000 –30.000 genes; contudo, estima-se que o número
de proteínas diferentes produzidas é pelo menos 10 X
superior. Mais de 50% dos genes originam pre-mRNAs que
sofrem processamento alternativo.
O genoma do HIV
contém 9 genes:
gag, pol, vif, vpr,
vpu, env, nef, rev
e tat.

Seus produtos
proteicos são
derivados de um
único transcrito
primário, através
de splicing
alternativo.
SUGESTÃO DE
LEITURA
TRADUÇÃO
 O que é tradução?

Processo pelo qual o RNAm maduro é lido

ou compreendido pelo maquinário
ribossômico, pelo RNAt e pelo RNAr.

Desta forma, os aminoácidos das proteínas

que serão formadas são colocados na
ordem correta.
Moléculas Adaptadoras:

Transferem a informação contida no

genoma a uma sequência de aminoácidos

Braço aceptor = ligação ao aminoácido

Braço do anticódon = triplet anticódon

Pareamento
Interação com centro enzimático: com o mRNA
carreamento do aminoácido correto
1 tRNA para cada aminoácido.
 Como o mRNA é lido?

Código Genético
 Triplets (trinucleotídeos)  códons
Um códon  aminoácido
Universalidade do Código Genético

Parece ter surgido muito cedo e permanecido

conservado, exceção ao código genético da
mitocôndria.
Códon de iniciação: AUG (metionina)
Códons de terminação: UAA, UGA e UAG
 O código
genético é
degenerado

Mais de um
códon codifica
para o mesmo
aminoácido

Códons para Arginina:

CGU, CGC, CGA, CGG

Aa codificado por:
UUU: fenilalanina
AUC: isoleucina
CUG: leucina
ATIVAÇÃO aminoacil-tRNA sintetases

Aminoacil-tRNA = tRNA ligado aminoácido

Processo importante, no qual ocorre

RECONHECIMENTO

do Aa a ser ativado e do tRNA aceptor

Nomenclatura: isoleucina+ tRNA= ile-tRNA

Máquina catalítica complexa: formada por mais de 50 proteínas
diferentes e diversas moléculas de rRNAs. São montados no nucléolo.
Têm o papel de assegurar a correta fase de leitura e manter a
exatidão.

Em procariotos: é formado por duas subunidades: 30S + 50S = 70S

Em eucariotos: 40S + 60S= 80S
Sítios fazem interações com mRNA e tRNA
Tradução

Início
Elongaçã
Término
1. Iniciação
(bactérias)
 Iniciação
(eucariotos)
 Os fatores de iniciação eucariotos
eIF-1, eIF-1A e eIF-3 ligam-se à
sub-unidade ribossomal 40S
 o eIF-2 se associa ao metionil tRNA
iniciador.
 O mRNA É reconhecido e levado até
o ribossoma pelo grupo de fatores
eIF-4,
 O cap 5' é reconhecido pelo eIF-4E.
Outro fator, eIF-4G,liga-se tanto a
eIF-4E quanto a uma
proteína associada com a cauda
poli-A na extremidade 3' do mRNA (
a proteína PABP).
 Complexo percorre o mRNA em
busca do códon AUG de iniciação. Os
eIFs são então liberados e a sub-
unidade 60S subunit pode se ligar à
40 S para formar o complexo 80S
inicial da tradução eucariota.
2. Elongação
3. Término
 O alongamento da cadeia
continua até que um códon de
terminação seja apresentado na
cavidade A
 Não há tRNAs com anticodons
complementares aos códons de
terminação.
 Os códons de terminação são
reconhecidos por fatores de
terminação protéicos
 Nos eucariotos um único fator de
terminação reconhece todos os
códons de parada (nos
procariotos são dois fatores).
 Após a interação deles, a fita de
mRNA se solta do ribossomo e as
duas sub-unidades se separam.