Amplificação in Vitro de Dna

Princípios da PCR convencional

Para entendermos como funciona a amplificação de DNA in vitro, devemos primeiro
relembrar algumas informações sobre o DNA e o RNA: suas funções, composições,
similaridades e diferenças. Tanto o DNA quanto o RNA são formados
por nucleotídeos, que são como os tijolos dos ácidos nucleicos e, consequentemente,
do material genético. A partir da junção de tais tijolos, formamos as estruturas de DNA
e RNA.
Em primeiro lugar, os nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose. Essa ribose é
uma das formas mais simples dos carboidratos – a forma mais conhecida de um
açúcar simples é a glicose. É na ribose que reside a principal diferença entre DNA e
RNA: o RNA possui uma molécula de oxigênio ligada ao segundo carbono da ribose
que o DNA não possui – por isso, o DNA é chamado de desoxirribonucleico.
O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA, existem quatro tipos
diferentes de bases nitrogenadas:

Para o RNA, as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em vez de T,

existe uma Uracila (U). Essas bases são as responsáveis pela informação genética.

Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono da

(desoxir)ribose, que são capazes de interagir com a hidroxila (álcool orgânico)
presente no terceiro carbono da (desoxir)ribose, fazendo a ligação entre um
nucleotídeo com o próximo. Essa ligação é conhecida como fosfodiéster, sendo
considerada o “cimento” dos nossos “tijolos”: a partir dela, longas sequências de DNA
ou RNA são formadas. É importante manter em mente que o grupamento fosfato
confere carga negativa à molécula de DNA.
A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato de outro
nucleotídeo no carbono 5 deixam as bases nitrogenadas livres para interação com
outras bases nitrogenadas, normalmente, do tipo oposto. As principais bases
nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em dois grupos químicos, de acordo com o
número de anéis aromáticos que possuem:

As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja, Pirimidinas pareiam
com Purinas, de acordo com as cargas livres de cada base. Desse modo, A interage
com T, pois ambas têm duas cargas livres para interação, e C interage com G através
de três cargas. Essas interações são chamadas de pontes de hidrogênio e são
consideradas fracas por serem facilmente quebradas por agentes físicos, como a
temperatura, e químicos, como o pH.

Reação em cadeia pela polimerase: amplificando DNA in vitro

Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens
necessários para duplicar o DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas.

A primeira característica do DNA que é importante na sua replicação in vitro é

a complementariedade entre fitas antiparalelas: as bases nitrogenadas de uma fita
interagem especificamente com as bases correspondentes da outra fita (A-T, C-G) por
meio de interações frágeis que podem ser desfeitas pelo calor. Ao aquecermos a
solução acima de 90 oC, podemos desfazer essas interações e abrir a fita dupla em
duas fitas simples. Isso deixa as bases nitrogenadas expostas para interagirem e, ao
abaixarmos a temperatura, conseguimos fazer com que a fita dupla se refaça e a
informação seja mantida. Vamos ver como esse processo funciona passo a passo
mais à frente.

A segunda característica importante para a replicação do DNA in vitro é a síntese

enzimática pela polimerase. Essa enzima lê cada base nitrogenada da fita simples
como se fosse um molde, e adiciona a base nitrogenada complementar na fita que
está sendo sintetizada através da ligação fosfodiéster. In vivo, a polimerase inicia a
duplicação do DNA sozinha, pois ela não consegue abrir a fita dupla em fitas simples,
identificar o local certo de início de replicação ou adicionar os primeiros nucleotídeos.
A célula utiliza enzimas para abrir a fita dupla, as helicases, e adição dos primeiros
nucleotídeos é feita por outra enzima, chamada primase.

Na amplificação do DNA in vitro, chamada de reação em cadeia da

polimerase (PCR), a abertura do DNA em fitas simples é feita através de calor. Para
isso, utilizamos uma enzima termorresistente chamada de Taq polimerase. Além
disso, usamos pequenas sequências de nucleotídeos em fitas simples e
complementares à sequência-alvo do DNA a ser amplificado. Essas sequências
sintéticas são chamadas de iniciadores ou oligonucleotídeos (oligo = poucos), algo
em torno de 20 nucleotídeos, que, em inglês, são chamados
de primers. Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos por reação: um
chamado senso, que se liga ao DNA molde fita simples no sentido 3’→5’; e um
antissenso, que se liga à fita no sentido 5’→3’.

Etapas da reação em cadeia da polimerase

A fita dupla de DNA se abre em duas fitas simples quando aquecida próximo a 100 oC,
e sabemos que a reação de síntese de novas fitas de DNA é feita por meio de uma
enzima termorresistente chamada Taq polimerase. Também descobrimos que a
enzima precisa de oligonucleotídeos iniciadores que se ligam por complementariedade
ao DNA-alvo desnaturado em uma fita simples. Agora, podemos entender como essa
última se desenvolve. Assim como em qualquer receita de bolo, uma PCR precisa de
seus ingredientes básicos – ou reagentes mínimos – para a síntese de DNA
acontecer. Desse modo, adicionamos esses ingredientes a um microtubo. Os
reagentes mínimos necessários para a amplificação são:
O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a diversos ciclos de
elevação e redução da temperatura do qual a PCR consiste.

A primeira etapa de qualquer PCR

consiste na abertura da fita dupla
de DNA em suas fitas simples pelo
aquecimento da reação a, pelo
menos, 95 oC, por um tempo Em seguida, começam os
prolongado – algo em torno de 5 a ciclos. Cada ciclo contém,
10 minutos. Esse tempo é pelo menos, 3
necessário para abrir por etapas: desnaturação,
completo as fitas de DNA que anelamento e extensão.
podem estar muito concentradas,
superenoveladas e ser muito
longas.

A desnaturação das fitas duplas de DNA em fitas simples, o anelamento dos

iniciadores à sequência-alvo por complementariedade e a extensão
pela Taq polimerase.

Desnaturação Anelamento

É a primeira etapa de cada ciclo em que
a temperatura é aquecida a 95 oC por
cerca de 1 minuto. O tempo de
desnaturação pode variar de acordo
com cada reação e genoma. Por
A segunda etapa de cada ciclo é o anelamento. A
temperatura será reduzida para cerca de 50 a 65 oC
por, aproximadamente, 30 segundos. Essa redução
da temperatura deve ser feita com exatidão para
que os iniciadores se liguem especificamente à fita
Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde,
a Taq polimerase reconhecerá esse local e fará a extensão da fita dupla. Como
a Taq polimerase é termorresistente, a elevação da temperatura a 95 oC não a destrói
– na realidade, ela funciona melhor em temperaturas mais elevadas. No caso da
maioria das polimerases disponíveis comercialmente, a melhor temperatura de
adição de nucleotídeos em uma PCR é, em torno, de 70 oC a 72 oC.

Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95 oC, para que as
fitas duplas recém-sintetizadas sejam separadas, e o ciclo desnaturação-anelamento-
extensão se repita de 30 a 40 vezes. No final, é recomendável ter um ciclo final de
extensão maior para garantir que a síntese de todas as fitas seja concluída. Após o
término, a reação deve ser mantida refrigerada para preservar o material amplificado.
A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e resfriam
rapidamente: os termocicladores. Esses aparelhos foram um grande avanço para as
ciências biológicas e permitiram a grande difusão da PCR em diversas áreas. Graças
a eles, uma PCR convencional média dura de 1 hora e meia a 2h.
A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os iniciadores
senso e antissenso, conhecida como amplicon – dobra. Dessa forma, se, no primeiro
ciclo, tínhamos apenas uma cópia de tal sequência (limite teórico da PCR), ao final do
primeiro ciclo, teremos 2 cópias; no final do terceiro ciclo, 4; depois, 8, e então 16, e
assim sucessivamente.
A cada ciclo, vemos um aumento exponencial do número de cópias da sequência-
alvo. Assim, no final de 30 ciclos, teremos algo na ordem de 1 bilhão de cópias da
mesma sequência! Um número tão grande de uma mesma sequência vai ser muito
mais facilmente identificado posteriormente.

Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:

Eletroforese em gel de agarose: separando e revelando o resultado
Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um microtubo com
nosso DNA amplificado em um tampão de reação que é transparente como a água.
Naturalmente, não podemos observar a olho nu o resultado da reação: é necessário
revelá-la. Para isso, precisamos manter em mente que, após uma PCR bem-
sucedida, temos uma sequência de DNA em um tamanho exato graças ao anelamento
específico dos oligonucleotídeos à sequência-alvo. Portanto, precisamos separar as
sequências por tamanho para verificarmos se o tamanho corresponde ao do nosso
produto. Também vamos precisar de algo que revele a localização do DNA, ou um
agente revelador especial.
Você deve estar familiarizado com a gelatina que fazemos na cozinha, certo? A
agarose funciona de maneira semelhante: é um polissacarídeo que se dissolve em
líquido aquoso quando aquecido e, quando resfriado, se solidifica, ou polimeriza. Ao
polimerizar, a agarose forma uma malha com pequenos orifícios que permitirão a
passagem do DNA, de forma que moléculas menores de DNA passarão com maior
facilidade e mais rapidamente, enquanto moléculas maiores de DNA terão maior
dificuldade de passar e, por isso, demorarão mais tempo para viajarem pela malha.
Assim, podemos separar as moléculas de DNA de acordo com tamanho. Dependendo
do tamanho do nosso DNA amplificado, poderemos usar uma malha mais fechada ou
mais aberta simplesmente variando a concentração da agarose que usamos para
fazer o gel.
O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados de
poços, feitos com um pente com pequenos dentes largos. Para podermos visualizar a
passagem do tampão da PCR pelo gel de agarose, usamos corantes como o azul de
bromofenol, o qual é mais denso do que o tampão de corrida e faz com que o DNA se
assente no fundo do poço, o que é necessário para que a separação funcione
adequadamente.
Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado nos
poços do gel com o corante azul, podemos começar a eletroforese. Para a
eletroforese, precisaremos ainda de uma cuba, ou recipiente que contenha entradas
para corrente elétrica, uma fonte elétrica e um tampão ionizável. A eletroforese parte
do princípio de que um tampão, quando submetido a uma corrente elétrica, tem suas
moléculas ionizadas migrando em direção a um dos polos: as moléculas negativas
migram para o polo oposto, o cátodo, e as moléculas positivas migram para o polo
negativo, o ânodo.
No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo que o DNA
migre para o polo positivo (cátodo) quando em solução submetida à corrente elétrica.
Como o DNA está no fundo do gel de agarose graças ao corante mais pesado que o
tampão eletroforético, ele passa por dentro da agarose e, assim, será separado de
acordo com seu tamanho pela trama do gel. Por sua vez, o corante azul, também de
carga negativa e de tamanho muito inferior à complexa molécula de DNA, migrará pelo
gel mais rapidamente, servindo apenas como marcador da velocidade de migração, e
não da posição do DNA.

Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador de

tamanho molecular do DNA que consiste em sequências de DNA de tamanhos
conhecidos, como se fosse uma escada cujos degraus representam os tamanhos. Ele
é um parâmetro para estimarmos o tamanho das sequências de DNA que
amplificamos – coloquialmente, chamamos essas sequências em gel de agarose
de bandas.
Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto amplificado no
gel de agarose. Esse reagente, chamado de fluoróforo, é uma molécula capaz de
fluorescer quando excitada no comprimento de onda correto. Em gel de agarose,
usamos fluoróforo que intercale especificamente com o DNA. A molécula mais
comumente utilizada é o brometo de etídio, que é capaz de se intercalar com
qualquer fita dupla de DNA. Sua capacidade de se ligar ao DNA o torna
potencialmente tóxico, carcinogênico e teratogênico, e precisamos manter nossa
segurança e as boas práticas laboratoriais para evitar de nos contaminarmos com ele.

Aplicações da PCR

A PCR e as suas variantes em ciências forenses

A primeira, é a aplicação forense. Você já deve ter entrado em contato com a
identificação de um criminoso a partir do seu DNA deixado na cena do crime, seja por
ter assistido a alguma série policial seja por ter lido alguma reportagem da vida real.
Isso só é possível porque cada ser humano possui um genoma completamente único,
exceto de gêmeos idênticos.
Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode olhar
para confirmar a origem do DNA. Chamadas de marcadores moleculares, elas são
conhecidas pela alta frequência de polimorfismos genéticos – regiões com grande
variação na sequência de DNA entre indivíduos sem causar nenhum tipo de
interferência funcional, pois são mais frequentes em regiões não codificantes.
As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil genético
pode ser visualizado por separação das bandas em gel de agarose e coloração por
brometo de etídio.
Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser usado para,
assim, aumentarmos o sinal durante a revelação. Nesse caso, o perito pode optar pelo
uso de uma nested-PCR, lembrando que os primers externos e interno precisam de
regiões não repetidas para se anelarem. Um cientista forense, além de fazer a
extração do DNA e sua amplificação por PCR, fará a identificação de indivíduos
através do seu perfil genético.

A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças genéticas

Ao amplificarmos certas regiões do DNA, podemos identificar a presença ou ausência
de sequências que deveriam ou não existir em determinado contexto. Seu uso pode
auxiliar, ou até mesmo determinar, o diagnóstico de diversas doenças que variam
desde genéticas a infecciosas. As doenças genéticas podem ser muito complexas em
sua apresentação e possuir diferentes perfis – autossômico dominante ou recessivo,
ligado ao cromossomo X, multifatoriais e multigênicas. O uso da PCR no diagnóstico
dessas doenças pode ser feito de diversas maneiras, dependendo de qual é a doença
e de seu perfil genético.
O PCR multiplex pode ser utilizado para verificar qual alelo está sendo expresso,
dentre dois alelos distintos, em uma mesma reação e assim ajudar no reconhecimento
de pequenas mutações que levariam ao desenvolvimento de uma doença genética.
Mas temos outras aplicações, usando PCR convencional. Vamos usar a doença de
Huntington como exemplo. Nessa doença genética autossômica dominante, ocorre um
excesso de repetição de três nucleotídeos (CAG) do DNA que codifica uma proteína
chamada Huntingtina. Esse excesso leva a uma doença neurodegenerativa sem cura
que causa perdas motoras, cognitivas e psiquiátricas ainda na idade adulta, apesar de
poder aparecer em forma juvenil também. A PCR torna-se uma importante ferramenta
diagnóstica, pois, ao amplificar sequências próximas da região de repetição, pode nos
dizer seu tamanho e, assim, informar o risco e até o prognóstico da doença em si.
Em um gene saudável, é normal ter cerca de 20 repetições (CAG); em pessoas
portadoras de Huntington, o número de repetições aumenta para 35 ou mais. De modo
geral, quanto maior o número de repetições, maior o risco de aparecimento e de
progressão da doença. Essa gradação de fenótipo – no caso da doença de
Huntington, de sintomas – é algo conhecido em genética como penetrância.

A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças infecciosas

Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso,
podemos diagnosticar uma infecção, já que o material genético de tal agente não
deveria estar presente naquela amostra biológica. Sua simples presença pode indicar
o agente etiológico e, assim, descobrir a causa da doença. A PCR é especialmente útil
no diagnóstico de organismos fastidiosos, que não crescem bem em cultivo, como o
Mycobacterium tuberculosis, por possuir alta sensibilidade e especificidade. Em outros
casos, a presença do material genético de um determinado microrganismo não é
suficiente para seu diagnóstico como agente causador da doença, e testes
complementares a PCR podem ser necessários, assim como técnicas de PCR mais
elaboradas que darão maiores informações.
Temos, como exemplo, o diagnóstico molecular de COVID-19. O SARS-CoV2, assim
como os demais coronavírus, tem RNA fita simples como material genético. Dessa
forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um cDNA viral, e o utilizamos
em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR. Esse é considerado o melhor teste, ou
padrão-ouro, para a identificação de casos ativos de infecção pelo SARS-CoV2. Isso
porque, o material genético viral é identificado de forma relativamente rápida – entre
coleta, extração, RT e qPCR, o resultado pode sair em algumas horas. Além disso,
esse método é muito sensível e específico, conseguindo detectar nas amostras
pequenas concentrações do vírus (carga viral).
A RT-qPCR também é utilizada no diagnóstico e acompanhamento de outras
infecções virais. A efetividade do tratamento para HIV pode ser monitorada através de
RT-qPCR, sendo esperadas reduções drásticas na carga viral após introdução da
terapia. O mesmo princípio de quantificação de cDNA obtido por transcrição reversa
também é aplicado em tratamentos oncológicos, especialmente, em leucemias e
linfomas: o oncologista pode requerer uma RT-qPCR para acompanhamento de
determinado marcador gênico do câncer em questão. Nos dois casos, a redução
(ou não) das sequências alvo na RT-qPCR ao longo do tempo podem ser cruciais no
tratamento e evolução do paciente. A PCR convencional multiplex também pode
ser utilizada no diagnóstico diferencial entre dois patógenos que possam causar
os mesmos sintomas, mas que exigem abordagens clínicas diferentes.

A PCR e as suas variantes em pesquisa científica

Em diversas ocasiões, a PCR pode ser utilizada para manipulação genética de
organismos simples, como bactérias, leveduras e células em cultivo. Nesse contexto,
podemos usar a PCR para, por exemplo, clonarmos um gene. Fazemos isso ao
amplificarmos a sequência gênica que desejamos clonar usando oligonucleotídeos
longos que têm duas regiões distintas. A primeira região liga-se ao gene que
queremos manipular – deletar, adicionar ou mutar – no organismo alvo; a segunda é a
região que se liga ao DNA molde do vetor dentro do qual queremos colocar nosso
gene clonado.
O vetor é, em muitos casos, uma sequência independente do genoma do organismo
alvo, mas que é capaz de se replicar autonomamente quando inserido na célula. Um
exemplo de vetores muito usados são os plasmídeos, pequenos DNA circulares
autorreplicantes e transferíveis de uma célula a outra, comuns em bactérias.
Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para amplificarmos
o gene alvo que queremos clonar; na segunda etapa, usamos o produto amplificado,
juntamente com o vetor, para inserirmos o gene clonado no vetor. Outra forma de
clonagem inclui o uso de enzimas de restrição para cortar o DNA em pontos
específicos, após amplificação por PCR.