REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE - PCR

Amplificação de DNA:

Este processo visa reproduzir um determinado trecho de DNA a ser

estudado. Os elementos envolvidos nesta reação são basicamente os mesmos

componentes do processo de replicação que ocorre no interior das células:

- DNA que contém o trecho a ser amplificado

- Nucleotídeos (A,T,C e G)

- Enzima DNA polimerase

- Dois iniciadores (pequena seqüência de DNA complementar ao DNA

alvo)

A reação ocorre em aparelho chamado termociclador que, através de

sucessivas mudanças de temperatura, direciona as três etapas da reação:

1. Desnaturação: é o processo no qual ocorre a separação da dupla fita de

DNA por meio da elevação da temperatura para ~94 oC,

2. Anelamento: uma vez separadas as fitas de DNA, a temperatura da

reação é reduzida para ~60oC e os iniciadores encaixam-se, um em cada

fita, nas respectivas seqüências complementares vicinais à região alvo da

amplificação,

3. Extensão: eleva-se a temperatura para ~72 oC para que a enzima DNA

polimerase posicione-se junto aos iniciadores que se anelaram

anteriormente e comece a duplicação da fita, recrutando no meio os

nucleotídeos que contenham as bases nitrogenadas complementares à

fita molde.

Após o término deste ciclo, todo o processo é repetido a partir da

desnaturação até a extensão por várias vezes (35 vezes em média) até que se

obtenha uma quantidade razoável do DNA a ser amplificado.

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Amplificação de DNA para seqüenciamento:

Vimos que o processo anterior tinha como objetivo a amplificação de um

determinado trecho de DNA. Agora o objetivo é produzir cópias de diferentes

tamanhos, desde o menor possível pela adição de apenas uma base nitrogenada até

os tamanhos mais longos com cerca de 1000 bases, de um pequeno trecho de DNA.

Isto é possível pós, além das bases nitrogenadas normais que estão no meio

reacional, existem outras bases especiais que, ao se incorporarem à fita que está

sendo sintetizada, impedem a entrada de novas bases porque são desprovidas de

uma hidroxila (OH) essencial à reação de alongamento da cadeia de DNA. Esse tipo

de base nitrogenada atua como um terminador da reação de PCR. Outra

característica muito importante, no caso do seqüenciamento moderno, é que esses

terminadores carregam em sua estrutura um corante fluorescente que pode ser

detectado por um feixe luminoso (laser) no momento em que este DNA estiver

sendo seqüenciado.

Além disso, outra diferença deste processo em relação ao anterior é que usa-

se apenas um iniciador da reação, ou seja, a amplificação ocorre a partir apenas de

uma extremidade.

Produção de cDNA

O cDNA é um DNA produzido a partir de RNA mensageiro (mRNA) que

servirá como molde. Através da enzima transcriptase reversa é gerada uma fita de

DNA, procedimento conhecido como RT-PCR. Este método é útil pois sabe-se que

todo DNA gerado corresponde, quase totalmente, à seqüência do gene, sem conter

os introns que poderiam estar presentes no gene.

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Estudo dirigido da animação de PCR:

1) O que é desnaturação e qual a importância da elevação da temperatura?

2) Na animação aparecem fragmentos de DNA azuis e vermelhos. Estes fragmentos

são chamados “primers”. Qual a sua função?

3) Para que usar dois primers?

4) O que é Taq Polimerase?

5) Quais elementos devem estar no tubo de reação de PCR?

6) Para que serve a PCR?

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