Prof. Dr.

Júlio César Borges

Eduardo Nazaré
Felipe Gonçalves
Renato Capelo
 Introdução
 Método de Sanger
 Pirosequenciamento
 Ion Torrent
 Aplicações
 Desde a descoberta da dupla fita de DNA
surgiram diversas ciências, entre elas a
genética e a biologia molecular.
 Os estudos surgiram com o objetivo de
conhecer o funcionamento de uma célula ou
organismo, além de conhecer possíveis
doenças e tentar encontrar a cura.
 Para que isso fosse possível foram
descobertos várias técnicas, entre elas o
sequenciamento do genético, afim de
descobrir a sequência das bases nitrogenadas
do DNA.
 O primeiro método de sequenciamento de
DNA surgiu em meados dos anos 70 e ficou
conhecido como método químico ou Maxam
– Gilbert, método no qual foi amplamente
aplicável na época.
 Alguns anos depois, em 1977, Frederick
Sanger propõe um método diferente e mais
eficiente chamado de método enzimático ou
de Sanger. Esse método logo se tornou
altamente replicável e é utilizado até os dias
de hoje.
 Frederick Sanger nasceu em 1918 e faleceu
em 2013 aos 95 anos em Cambridge, onde
era pesquisador no laboratório de biologia
molecular da Universidade de Cambridge.
 Ganhador de 2 prêmios Nobel.
 1977: Sanger desenvolve seu método de
sequenciamento de DNA.
 A partir daí sequencias com até 96% de
similaridade puderam ser diferenciadas.
 O DNA é formado por duas fitas antiparalelas de nucleotídeos complementares
formando uma dupla hélice.
 Sanger descobriu que se conseguisse
interromper a replicação de um mesmo
DNA em pontos diferentes ele poderia
juntar essas fitas menores e formar a
sequência completa do DNA.
O método consiste em adicionar
didesoxiribonucleotídeos (ddNTP’s), que
são nucleotídeos modificados que não
possuem o grupo OH livre no carbono 3’
da pentose.
 Existem quatro tipos de ddNTP’s, um para
cada base nitrogenada (A,T,G,C).
 Quando os ddNTP’s tentam se ligar com a
fita de DNA, com a ausência do OH, o
próximo nucleotídeo não têm onde se
ligar e a replicação para.
 Assim é possível obter fitas do mesmo
DNA com número de resíduos diferentes.
 A reação é realizada em 4 tubos de ensaio.
 Cada tudo contêm:
 DNA;
 DNA polimerase;
 Primer;
 Nucleotídeos;
 E um tipo de ddNTP diferente.
 Após isso ocorre a replicação em todos os tubos.
 Dentro de cada tubo a replicação
acontece e termina em lugares diferentes.
 No final do processo temos fragmentos
da fita de DNA de diferentes tamanhos.
 O conteúdo desses tubos é aplicado em
gel de poliacrilamida e separado por
tamanho (eletroforese).
 Os fragmentos menores ficaram mais em
baixo e os maiores mais em cima.
 Para obter a sequência do DNA, a leitura
é feita de baixo para cima, resultando em
fragmentos que se sobrepõem, e formam
a fita completa de DNA.
 Proposto por Mostafa Ronaghi (1996);

 Instituto Real Tecnológico da Suécia;

 Pesquisador na Universidade de Stanford;

 Vice-presidente da Illumina Company;

 Primeira alternativa ao método de Sanger para sequenciamento do DNA.

 Detecção através da Luz;
 Liberação de Pirofosfato na adição de um nucleotídeo;
 Ação de 4 diferentes enzimas:
 DNA polimerase;
 ATP sulfurilase;
 Luciferase;
 Apirase;
 Substratos utilizados:
 Adenosina 5’ fosfossulfato (APS);
 Luciferina;
 Resultados obtidos rapidamente.
 Passo 1
 Extração do DNA.

 Passo 2
 Adição do Desoxirribonucleotídeo Trifosfato (dNTP);
 DNA polimerase catalisa a incorporação do dNTP na fita;
 Complementar à fita molde;
 Liberação de pirofosfato (PPi);
 Quantidade equivalente à de nucleotídeos incorporados.
 Passo 3
 ATP sulfurilase converte PPi para ATP;
 Presença de adenosina 5’fosfossulfato (APS);
 Conversão de luciferina em oxiluciferina (pela luciferase);
 Luz visível;
 Proporcional à quantidade de ATP;
 Detcção é feita por um chip ;
 Gera um pico na saída de dados do software;
 Cada pico (sinal de luz) é proporcional ao número de nucleotídeos.
 Passo 4

 Apirase degrada nucleotídeos não incorporados e ATP;

 Após degradar, mais nucleotídeos são adicionados.

 Passo 5

 Adição de dNTP é realizada sequencialmente;

 Cadeia complementar de DNA é construída;

 Sequência nucleotídica é determinada a partir dos picos.

• Identificação de bactérias;

• Tipagem fúngica e viral;

• Detectar mutações;

• Análises de metilação do DNA;

• Sequências múltiplas;

• Verificações de clones;

• Sequenciamento do genoma humano.

 Vantagens:
 Processo automatizado
 Tempo de análise curta;
 Resposta instantânea do sequenciamento;
 Alto rendimento;
 Preparo rápido da amostra;

 Desvantagens:
 Custo elevado;
 Grande conhecimento de bioinformática;
 Taxa de erro considerada alta (0,0098)
 Sequenciamento de DNA da nova
geração;
 Pesquisadores de Connecticut, USA;
 Pretendem democratizar o
sequenciamento
 Desejam chegar em US$ 1000;
 Necessidade de remoção do
sinalisador
 Parecido com o pirosequenciamento;

 Utiliza microchip para deterctar a

incorporação do dNTP;

 Chip mede a diferença de pH;

 Evolução acompanha informática;

 DNA é fragmentado;
 Adição de marcadores;
 Cada fragmento liga-se a um “bead”;
 “Beads” são posicionados em poços;
 Ocorre replicação do fragmento;
 Cobre o “bead”;
 Poços individuais;
 Banho de dNTP;
 Caso dNTP ligue-se, libera H+;
 Variação do pH detectada pelo chip;
 Análises rápidas ~2h; Elevada sensibilidade;
 Ideal para DNA pequeno a médio; Baixo custo;
 Localiza prontamente sítios específicos no DNA;
 Altamente recomendado para avaliação de fragmentos específicos;
 Biologia molecular
 Sequenciamento é utilizado no estudo de
genes e quais proteínas codificam;
 Assim, o que levam trocas nos genes?

 Biologia evolutiva
 O sequenciamento do DNA é útil para
entender como diferentes organismos estão
relacionados;
 Medicina
 Pacientes podem saber se apresentam
doenças genéticas;
 Ciência forense
 Identificação;
 Teste de paternidade;
 Obrigado.