@polianaa_lucena
Genética
Genética molecular:
- Reação em cadeia de polimerase – PCR
Histórico:
- Kary Mullis (1983): criou a PCR
- 1986: comercialização da Taq polimerase
(reagente importante para a execução da
PCR)
- 1987: Kary transformou a PCR em um
processo automatizado – surgimento dos
aparelhos termocicladores (aparelhos para
fazer a PCR)
- 1992: 1° teste PCR para HIV (esse teste
desconsiderava a janela imunológica)
- 1993: Kary ganha o prêmio Nobel de química.
- 2003: PCR quantitativo – em tempo real, é
mais sensível e mais rápido que o
convencional.
• O que é a PCR?
É uma reação de amplificação do DNA
(aumento da quantidade de DNA presente
em uma determinada amostra).
Essa reação ocorre em diversos ciclos (30 a
40) com aquecimento e resfriamento da
amostra.
Se o DNA inicial gera um determinado sinal, o
DNA amplificado gerará muito mais sinais do
que o inicial.
• Materiais utilizados para fazer um PCR:
1 – Água: a reação deve ser feita em um
meio aquoso, pois é necessário simular o
interior da célula para imitar o processo de
replicação do DNA.
11 – Íon Magnésio (cofator): ele liga a enzima
DNA POLIMERASE. E faz com que essa
enzima funcione.
III – DNA polimerase (Taq polimerase):
responsável por sintetizar novas fitas de dna.
IV - DNA molde: é a amostra de DNA que
será replicada.
V - Desoxirribonucleotídeos trifosfato
(dNTP’s): nucleotídeos do DNA (uma base,
um açúcar e 3 fosfatos)
VI – PRIMERS: são os iniciadores do PCR. Eles
são uma sequência curta de 20 pares de
bases, se ligam no Dna em 2 pontos e
determina o local de início e final da
replicação. São eles quem determinam o
tamanho de fragmento de DNA que será
replicado.
VII – SOLUÇÃO TAMPÃO: é uma solução
onde o meio possui o pH constante e são
preparadas por meio da dissolução de solutos
em água.
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DNA POLIMERASE: é a enzima responsável
pela síntese de DNA, ela é chamada de TAQ
POLIMERASE. (Thermus aquaticus –
bactérica que suporta grandes variações de
temperatura). Essa enzima funciona a 72°C –
100°C sem perder sua capacidade de
funcionamento.
Obs. a grande variação de temperatura é
uma das coisas mais importante para o
funcionamento do PCR.
PCR ocorre:
- Aumento de cópias de DNA.
- Maior probabilidade de detecção do
material genético.
Características do PCR:
- Específico: ele causa a amplificação de uma
sequência específica de DNA.
- Sensível: é capaz de detectar apenas 1
sequência molde.
- Flexível: permite variações da técnica básica.
Fases do PCR
Essas etapas estão relacionadas com a
temperatura.
1° Desnaturação inicial (95°C – 5’)
2° Desnaturação (95°C – 15’’ a 1’)
3° Anelamento dos primes (50 a 65°C – 1’)
4° Extensão (72° C – 1’)
5° Extensão final (72°C – 10’)
6° Resfriamento (4 – 10°C)
Obs. quem faz essas mudanças de
temperatura é um termociclador.
Desnaturação
A molécula de DNA é separada em fitas por
causa do aumento da temperatura. Essa
separação das fitas auxilia o trabalho dos
outros componentes.
Anelamento
Ocorre uma queda de temperatura, ocorre
em uma temperatura certa para que os
primers se liguem a fita de DNA. Nessa
temperatura a Taq polimerase está inativada
por causa da temperatura.
Extensão
Ocorre um aumento da temperatura para
que a Taq polimerase possa agir e sintetizar
as novas fitas de DNA.
Obs. Ao fim desse processo, haverá o dobra
do que tinha inicialmente. Esse processo pode
se repetir por muitas vezes, em geral, eles
tendem a se repetir de 30-40 ciclos.
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Exponencialidade do PCR
A amplificação da molécula de Dna ocorre de
forma exponencial.
𝑵 = 𝑵𝒐 . 𝟐𝒏
N= N° de moléculas amplificadas
No= N° inicial de moléculas
n= N° de ciclos de amplificação
Obs. o produto da PCR é um amplicon, pois
sofre amplificação.
Técnicas para a comprovação do
funcionamento da PCR
- Quantificação: é possível observar a
quantidade de DNA que possui. É utilizado um
espectrofotômetro, um dispositivo capaz de
observar a quantidade de luz que foi absorvida.
Quanto maior a quantidade de luz absorvida,
maior será a amplificação do DNA.
- Eletroforese: é possível visualizar a
amplificação do DNA. Esse processo ocorre
em gel de agarose. O dna é aplicado em uma
abertura onde há gel de agarose. A
concentração do DNA determina o tamanho
dos poros que há no gel. Quanto maior os
poros, maior a possibilidade da passagem de
DNA. Também, é aplicado um campo elétrico
sobre o gel, a corrente elétrica permite que
haja migração. O DNA possui uma carga
negativa e ao aplicar a corrente, ele migra em
direção ao polo positivo. O DNA migra em
relação ao tamanho do fragmento (maior –
mais difícil de passar pelos poros do gel/
menor- mais fácil de passar pelos poros do
gel) e a corrente elétrica. No final da corrida,
o DNA precipita no gel e forma bandas, onde
é possível visualizar por meio do uso de
corantes.
✓ Efeito plateau: é quando ocorre o limite
máximo da amplificação do DNA. Logo,
aumenta o acúmulo de produtos quando
atinge um determinado número e os
produtos da solução, como enzimas,
diminuem a sua funcionalidade. Isso ocorre
devido a degradação de enzima, depleção
de dNTP’s, primers, inibição pelo produto,
competição por produtos não específicos,
reanelamento.
➢ Aplicações da PCR:
- Amplificação de fragmentos de DNA.
- Confirmação de clonagem e transformação.
- Estudos de variabilidade genética.
- Testes de paternidade.
Sequenciamento de Sanger:
Método de Sanger componentes:
- Amostra de DNA
- Enzima DNA polimerase (produção da nova
fita de DNA)
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- Primer (sequência específica de
nucleotídeos que serve como iniciador para a
produção de uma nova fita de DNA pela DNA
polimerase)
- Tampão
- Desoxirribonucleotídeos (dNTP’s) (possui
uma hidroxila OH ligado ao carbono 3’ da
desoxirribose)
- Didesoxirribonucleotídeos (ddNTPs) (possui
hidrogênio H ligado ao carbono 3’ da
desoxirribose) – são os terminadores de
cadeia.
Obs. o princípio da técnica está na diferença
na estrutura entre o dNTP e do ddNTP.
Os dNTP’s possuem uma OH e permitem que
um novo nucleotídeo se ligue na cadeia. Já os
ddNTP’s só possuem o H, isso faz com que
eles não permitam a adição de mais nenhum
nucleotídeo. Logo, a cadeia é finalizada com
umm ddNTP’s que é marcado com uma cor
particular, dependendo da base.
Etapas do sequenciamento de Sanger
AMPLIFICAÇÃO DO PCR (1°etapa)
1° Amostra de Dna é distribuída em 4 tubos,
um tubo para cada base nitrogenada.
2° Tubos são aquecidos para que ocorra a
desnaturação.
3° Os Primer se ligam em uma sequência de
nucleotídeo.
4° DNA polimerase começa a produzir a nova
fita de DNA inserindo nucleotídeos que estão
presentes na solução do tubo.
Obs. se um ddNTP for adicionado a fita, a
produção daquela fita para, isso faz com que
as moléculas de DNA tenham tamanhos
diferentes.
ELETROFORESE (2°etapa)
Esse processo separa as moléculas de acordo
com o tamanho.
Moléculas maiores – são mais pesadas e
correm menos no gel.
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Moléculas menores – são mais leves e

correm mais no gel.
Cada coluna representa um ddNTP diferente
e cada banda mostra o tamanho da molécula
de DNA e o ddNTP específico no fim da
molécula. Dessa forma, o resultado da
eletroforese informa a sequência das bases
de DNA da amostra.
A banda mais inferior – cadeia interrompida
por ddNTP, cadeia mais curta, ou seja, a
primeira base da sequência de DNA original.
A banda mais superior – cadeira mais longa,
representa a última base da sequência de
DNA
Obs. se lê da mais curta (5’) para a mais longa
(3’)
Aplicações do sequenciamento de Sanger
- Estudos de genes
- Verificação de alterações na sequência de
DNA.
- Diagnosticar desordem e anomalias em
pacientes.
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