Técnicas de investigação genética - Aula 4

Interpretações de variantes genéticas

As interpretações das variantes genéticas têm que serem bem feitas. EXEMPLO: Ocorre com uma certa frequência
de um medico ter uma paciente com câncer de mama, e após fazer exames, perceber que a paciente tem uma variante
genética (Mutação) de anemia falciforme, com isso, erroneamente, ele fecha o diagnóstico considerando a mutação de
anemia falciforme como fator causal do câncer e até usa essa informação como aconselhamento genético à família.
Por isso as variantes tem que verificadas e bem interpretadas para não diagnostica e aconselhar erroneamente a
família.
Existem 3 classificações para variantes: Variantes benignas, patogênica e voux.
VARIANTE PATOGÊNICA: Já está firmemente associada com o quadro oncológico.
VARIANTE DE VOUX: São variantes sem significado conhecido. São variantes novas, que tem a ver com o
câncer, porém ainda não entraram no banco de dados. Quando entrarem nos bancos de dados, elas serão classificadas
como variante benigna ou variante patogênica.
VARIANTES DO TIPO VOUX DEVEM SER CONSIDERADAS?: Sim. EXEMPLO: Paciente com osteogênese
imperfeita. Painel genético é feito e dentro do gene da osteogênese imperfeita é encontrado uma variante voux. Essa
variante voux é jogada para analise e é percebido que ela tem perda de função de proteína. Nesse caso ela deve ser
considerada.

Fluxograma para teste genético

Exames genéticos precisam ser feitos em células que tem núcleo. Ou seja, em exame com sangue periférico, as
hemácias não servem, as células utilizadas serão os leucócitos.
Não pode fazer teste genético ás cegas, tem que ter pelo menos uma suspeita para pedir o exame.
1. Coleta de material biológico, seja sangue, saliva etc.
2. Extração do DNA ou RNA.
3. Amplificação por PCR. Será feito milhões de cópias desse DNA. Esse monte de cópia é feito para que se
tenha uma segurança e certeza do resultado. Essas cópias do DNA por PCR são chamadas de amplicons.
4. Análise dos amplicons. Essa analise vai ser feita usando o exame necessário paro o tipo de doença que
estamos procurando.
5. Interpretação e diagnóstico.
COMO SABER QUANDO É PARA FAZER EXTRAÇÃO DO DNA OU DO RNA: Quando quisermos saber a
respeito de hereditariedade, deve ser escolhido DNA. Quando quisermos ver a expressão gênica, nesse caso será
escolhido a extração do RNA.

Sobre o exoma
Esse exame cobre mutações pontuais e mutações com pequenas deleções, porém ele não pega mutações grandes,
por isso ele não pode ser usado para tentar saber todas as mutações genéticas. O médico deve ter uma suspeita e em
cima dela pedir um exame específico.

Fluxograma do teste genética em detalhe

Etapas da extração do DNA para analise
É a primeira fase para fazer um teste genético.
É dividido em 3 etapas.
PRIMEIRA ETAPA

 Essa é a etapa que ocorre o isolamento do DNA de maneira pura e integra sem quebras.
 Caso tenha uma quebra da molécula de DNA ou ele esteja impuro e isso seja visto apenas nas etapas
seguintes, tudo será jogado fora e voltará à primeira etapa novamente.
 Nessa etapa temos a Destruição de membrana citoplasmática e envelope nuclear. Isso deve ocorrer para que
tenhamos acesso ao núcleo celular. Esse processo é feito por uma enzima chamada proteinase K, ela quebra a
membrana citoplasmática e envelope nuclear.
 Além da proteinase K, temos o vórtex, ele é um agitador mecânico que vai gerar uma destruição mecânica.
 Junto com a proteinase K, vai ser administrado uma solução de lise feita de sal, ela não é usada para romper a
membrana citoplasmática, mas, sim, para evitar que as moléculas de DNA que caem na água se dissociem e
quebrem, ou seja, ele estabiliza as moléculas de DNA que caem na água.
SEGUNDA ETAPA

 Essa é uma etapa de filtração, aqui vai acontecer a filtragem e lavagem para que vá embora os restos celulares
e sobre apenas a molécula de DNA.
 Nessa fase é usado um tubo que tem uma membrana de sílica, tal membrana se liga muito bem ao DNA, dessa
forma os restos celulares passarão e o DNA será obtido.
TERCEIRA ETAPA

 É jogado uma substancia na membrana de sílica que vai fazer com que o DNA desgarre do fundo do tubo.
 Aqui tem o isolamento da molécula de DNA.

Exame PCR tradicional

Após a extração do DNA é feito o exame de PCR.
Quando você, futuro médico, for pedir um exame genético, não PEÇA PCR, pois é a mesma coisa que pedir nada.
PCR é apenas uma das etapas do processo de teste genético.
Após a extração do DNA, vamos amplifica-lo em milhões de copias. Essa quantidade absurda é feita porque após a
extração do DNA, temos poucas moléculas dele, dessa forma não é possível dar um laudo com segurança. Essa falta
de segurança ocorre porque dessas poucas moléculas de DNA que temos depois do processo de extração, muitas
podem ficar improprias para analise, por isso é feito o PCR para multiplica-las.
É um exame que permite a amplificação do DNA de células de qualquer tecido, porém essas células tem que serem
nucleadas.
A partir de apenas 1 molécula de DNA, é possível por PCR amplifica-la em milhões de cópias.
DESVANTAGEM DO PCR: É altamente contaminante. Como no PCR temos a amplificação de algumas
moléculas em milhões de cópias, se houver a contaminação de 1 molécula, teremos a contaminação de milhões de
futuras cópias.
No PCR, colocamos dentro da maquina tudo que precisamos para que ocorra um processo de replicação do DNA
igual ao que ocorre dentro das nossas células. Observamos, então, que a PCR é uma replicação in vitro.
Apesar de fazer replicação igual as nossas células, o PCR não utiliza todas as enzimas que nós temos, ele vai
substituir varias enzimas por temperatura. É usado ciclos de temperatura de 57 graus até 99 graus, no intervalo entre
essas temperaturas é feito o controle da replicação.
ABAIXO VEREMOS OS PASSOS DA EXAME PCR, TODAS AS ETAPAS SÃO FEITAS DENTRO DO
TERMOCICLADOR.
DESNATURAÇÃO
  A DNA-HELICASE, enzima que faz quebra de ponte de hidrogênio, não é usada no PCR.
 Na PCR, a quebra das pontes de hidrogênio é feita pela elevação da temperatura de 95 graus para 99 graus,
dessa forma ocorre a desnaturação da ponte de hidrogênio por temperatura.
 Após a quebra das pontes de hidrogênio, a fita de DNA estará aberta.
 No processo normal de replicação, usaríamos SSB e DNA-TOPOISOMERASE para impedir que a fita de
DNA se feche, porém no PCR a própria temperatura impede isso.
HIBRIDAÇÃO

 Após a fita estar aberta, nas nossas células usaríamos a RNA-PRIMASE para formar o primer, porém no PCR
não temos a RNA-PRIMASE.
 Como não temos RNA-PRIMASE para produzir o primer, teremos que comprar o primer pronto. Esse par de
primer já é fabricado com timina invés de uracila.
 Após a produção do PRIMER, é necessário que seja diminuída a temperatura correta para que ele funcione
adequadamente. Cada primer tem sua temperatura específica.
 A temperatura adequada do PRIMER é chamada de temperatura de MELTING.
 Após ser inserido, o primer vai procurar uma região complementar e com temperatura específica para ele.
EXTENSÃO

 Após a inserção do primer, na replicação das nossas células teríamos a DNA-POLIMERASE III estendendo a
nova cadeia.
 Na PCR temos uma enzima sintética parecida com a DNA-POLIMERASE III que já vem no molde, é a
chamada TAQ-POLIMERASE.
 Normalmente a TAQ-POLIMERASE funciona de 69 à 72 graus Celsius. OBS: A Luciana não cobra
temperatura na prova.
 Essa TAQ.b-POLIMERASE é comprada de empresas e deve ficar refrigerada, pois quando sua temperatura é
aumentada, temos o inicio de sua atividade enzimática.
COMPONENTES QUE DEVEM ESTAR DENTRO DO TUBO ANTES DO TUBO SER COLOCADO
DENTRO DO TERMOCICLADOR

 TAQ-POLIMERASE
 PRIMER de natureza de DNA. Se faz necessário que seja um primer de DNA para que não precisemos da
DNA-POLIMERASE I, enzima essa que converte o primer de RNA em primer de DNA. O primer delimita a
região alvo do gene.
 Base nitrogenadas livres, pois são necessárias para que a TAQ-POLIMERASE consiga estender a nova fita.
Essas bases nitrogenadas livres são chamadas de dNTPs.
 Solução tampão. Essa solução contem principalmente íons de cloreto de magnésio, pois o combustível da taq-
polimerase é o cloreto de magnésio.
CUIDADO A SER TOMADO

 Sabemos que tanto o primer quanto a TAQ-POLIMERASE tem temperaturas específicas para funcionar. Qual
problema pode ocorrer?
 O primer não pode ser muito grande e nem ter muitas ligações G-C, pois isso faz com que seja necessária uma
temperatura de melting maior para que ele seja ativado. O problema ocorre se essa temperatura for igual ou
maior que a temperatura de ativação da TAQ-POLIMERASE, pois caso isso aconteça, teremos a ativação
tanto do primer quanto da TAQ-POLIMERASE ao mesmo tempo, e isso não pode ocorrer.
 Por isso, na hora de desenhar o primer para mandar para a empresa fabricar, se faz necessário que ele não
tenha tantos ligações G-C e não seja muito grande para que não aconteça de sua temperatura de melting seja
maior ou igual à temperatura de funcionamento da TAQ-POLIMERASE.
AMPLICON é o nome dado às copias do DNA feitas por PCR, após o fim do PCR temos milhões de amplicons.
FLUXO LAMINAR: É onde manipulamos as amostras de PCR. Não entra DNA dentro do fluxo laminar. Só vai ser
colocado dentro do tubo o par de primer, solução tampão, dNTPs e TAQ-POLIMERASE. Já a amostra do paciente não
vai entrar, isso ocorre para que não ocorra contaminação. A amostra do DNA será a ultima coisa que vamos colocar e
logo após sua colocação, vamos levar o tubo para a máquina de PCR.
COMO É FEITO PCR COM RNA: Segue os mesmos passos DNA, porém o que muda é que, após a extração do
RNA, vamos utilizar uma enzima chamada transcriptase que transformará o RNA em C-DNA, depois disso esse C-
DNA vai para o PCR.
PRIMER: O par de primer na PCR delimita a região alvo de estudo. Usamos um primer senso e outra primer anti-
senso, eles indicam onde começará a cópia e onde terminará. O primer tem que ser desenhado para o inicio da região
alvo e outro para o final da região alvo. Um primer muito pequeno é ruim, pois ele pode se grudar em qualquer lugar,
ele tem que ter pelo menos 20 pares de bases. EXEMPLO DE PRIMER PEQUENO: Primer GAAC, ele é ruim pois
existe um monte de região no nosso DNA que tem a mesma sequência, por isso se faz necessário que o primer tenha
pelo menos 20 pares de bases, dessa forma fica muito mais difícil dele colar na região que não é de estudo, porém
ainda pode ocorrer dele colar em regiões não alvo.
OBSERVAÇÃO: Feito o PCR, temos como resultado a amplificação do DNA. Após essa amplificação, temos várias
técnicas que podem ser usadas para analisa esses amplicons, a escolha de cada técnica vai depender do que você quer
observar, a suspeita do tipo de mutação que vai direcionar qual técnica vamos utilizar após o PCR.

Tecnica de eletroforese em gel

É uma das técnicas que existe para analisar os amplicons.
Nessa técnica temos um gel que é colocado dentro de uma cuba com água ou solução tampão.
Serve para analisar tamanhos diferentes de fragmentos de DNA, porém essa técnica só é usada quando a deleção ou
inserção for maior que 50 pares de base.
Se a suspeita da deleção ou inserção do paciente for menor que 50 pares de bases, não vamos utilizar essa técnica.
Isso acontece porque o gel não tem uma resolução tão boa.
TÉCNICA EM SI

 É feita a solidificação do gel e é deixado buraquinhos nele.

 Nesses buraquinhos são inseridas as amostras que saíram da PCR.
 Após ser colocada a amostra, colocamos uma fonte de energia que vai gerar um polo negativo e outro
positivo. A amostra tem que estar virada para o polo negativo, pois o DNA tem carga negativa, dessa forma
ele vai migrar em direção ao polo positivo.
 Quanto maior for o amplicon, menos ele vai descer no gel. Já quanto menor for o amplicon, mais ele vai
descer no gel.
 Ao longo da migração das amostras, o gel vai separar bandas com amplicons de pesos moleculares diferentes.
Ou seja, bandas com 900 pares vão para um local, bandas com 70 pares vão para outro e por assim em diante.
TEMOS DOIS TIPOS DE GEL: Gel de agarose, nele os buraquinhos estão na horizontal; Gel acrilamida, seus poros
são mais apertados, por isso usamos ela para fragmentos menores de até 300 pares de base, seus poros estão na
vertical. De 300 pares de base para cima vamos utilizar a agarose.
DESVANTAGEM DO GEL ACRILAMIDA: É neurotóxico. Por isso quando tivermos um amplicon com 300 pares
de base, vamos escolher a agarose, pois ela não é neurotóxica.
ESCALA ALÉLICA

 É como se fosse uma régua.

 Por essa régua conseguimos saber quantos nucleotídeos tem cada banda.
TIPOS DE CONTROLES NECESSÁRIOS

 Nos testes genéticos temos 3 tipos de controle.

 Controle positivo: amostra do paciente com mutação.
 Controle negativo com paciente saudável que não tem mutação.
 Controle negativo com apenas água invés de DNA.
 Se ocorrer alterações nesses controles, deverá ser repetido todo o exame.
  Se o controle negativo com água amplificar algo, significa que está contaminado, pois agua não era pra
amplificar nada.
 Se no controle negativo com paciente saudável tiver com mutação, deverá ser repetido tudo, pois é um
controle de um paciente sem mutações, logo tem algo muito errado.
 Se no controle positivo não for achado mutação, deverá ser repetido, pois significa que a técnica não é capaz
de detectar a mutação.
CONTINUAÇÃO DA TÉCNICA

 Assim que a amostra acaba de correr nos poros, vamos pegar o gel e coloca-lo em um corante que cora a fita
dupla de DNA.
 Após corar o gel, vamos colocar ele embaixo de um transiluminador. O transiluminador vai jogar raios UV
que vão fazer o corante colocado no DNA ficar fluorescente e, assim, conseguirmos ver suas bandas.
COMO INTERPRETAR O RESULTADO DO EXAME

 Antes de tudo temos que saber o que estamos procurando. Se o normal do gene que estamos analisando é ter
600 pares de bases, caso o amplicon apareça com 500 pares de base, significa que houve uma deleção de 100.
 Se o normal do gene é ter 600 pares de bases e o amplicon analisado aparece com 700 bases, significa que
houve uma inserção de 100 pares de base.
 Ou seja, conhecendo a quantidade saudável de pares de bases, vamos saber se ou uma deleção ou inserção.
 Se estivermos procurando uma alteração de 10 pares de bases, não conseguiremos ver ela, pois é uma
alteração muito pequena. O certo é fazer por outra técnica.

PCR em tempo real

É um exame mais rápido.
Nele só precisamos colocar o conteúdo do PCR dentro do tubo e colocar na máquina, após isso rapidamente ele nos
dará o resultado em forma de gráficos.
Nessa PCR não precisamos de utilizar a técnica do gel.
É um exame mais caro, porém vale muito mais a pena porque ele é mais rápido e mais confiável. Essa confiança se
dá, pois ele percebe deleções e inserções muito menores.

Análise de fragmento automatizada

É uma alternativa à eletroforese em gel.
É como se fosse um gel automatizado, nele podemos ver deleções e inserções muito menores que não veríamos na
eletroforese em gel.
É uma técnica mais cara de eletroforese em gel.
PASSO A PASSO DA TÉCNICA
1. Pipeta automatizada puxa a amostra para dentro de um caninho.
2. Dentro cano temos polímero parecidos com o gel de agarose e gel de acrilamida. Esse cano tem o nome de
capilar. Dentro do capilar temos um polo negativo e outro positivo.
3. Quando ligarmos a máquina, as amostras vão andar igual a técnica do gel.
4. A amostra não para pelo caminho, ela anda por todo o capilar até chegar ao fim.
5. Os fragmentos que vão subindo têm fluorescência, isso ocorre porque o primer comprado para essa técnica
vem com fluoróforo.
6. Em uma parte desse capilar, temos um laser que emite uma luz. Na hora que o DNA passar nesse laser, ele
será detectado, e o laser ativará a fluorescência que estava nele.
 7. Antes de iniciar a técnica, é colocado junto com a amostra a escala alélica. A escala alélica anda junto com o
DNA. Na hora que a escala alélica passar no laser junto com a amostra, vai ser registrado quantas bases tem
aquele amplicon.
8. No gráfico gerado vamos ter uma representação da escala alélica e da quantidade de bases do amplicon. Nós
não confundimos uma com a outra porque a fluorescência da escala alélica normalmente é vermelha e a
fluorescência da amostra geralmente é azul.

9. Cada pico que vemos no gráfico representa a quantidade de pares de base que tem aquele amplicon.
Essa técnica consegue pegar a deleção e inserção a partir de 2 pares de bases para cima. Ou seja, se suspeitarmos de
uma deleção ou inserção de 3 pares de bases, vamos direto para essa técnica.
Se estamos esperando um amplicon com 310 pares de base e aparece um amplicon com 307 pares, significa que
houve uma deleção de 3 pares de base.
Nessa técnica não é possível ver mutação pontual, que é, por exemplo, quando temos a troca de guanina por timina.
Isso ocorre porque só podemos ver deleção e inserção, mas não sequência.

Sequenciamento do tipo sanger

Aqui podemos ver mutações pontuais. Ou seja, se houver uma troca de guanina por timina, vamos conseguir ver.
Tambem é possível observar pequenas deleções e inserções.
Apesar de podermos ver deleções e inserções nessa técnica, ela é muito mais cara que analise de fragmentos
automatizada, por isso é indicado que para essas duas ocasiões seja feita a analise de fragmento automatizada. Porém,
caso se suspeite da deleção ou inserção de apenas 1 par de base nitrogenada, é indicado que seja feito o
sequenciamento do tipo sanger.
Cada pico no gráfico é uma base nitrogenada.
É muito mais caro porque cada base nitrogenada tem uma fluorescência específica.
É uma ferramenta muito antiga e trabalhosa, por isso não é muito utilizada hoje em dia. Seu uso está mais associado
quando se faz necessário tirar uma contra prova. Por isso não fazemos exoma com sanger.
Sequenciamento NGS
