UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E EVOLUÇÃO

RELATÓRIO LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

AULA 3: REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Discentes:
Grupo 4
Ana Caroline Reis de Camargo; RA: 770438
Caroline Santos de Oliveira; RA: 790987
Gabriela Siviero Erra; RA: 800807
Giovana Martins Campos Simioni; RA: 801049
Isabella Vitória Alonso; RA: 794824
Letícia Piazentin Dantas; RA: 791005
Natália Ribeiro Crispim; RA: 790706

Docentes:
Profa. Dra. Andrea S. da C. Fuentes
Prof. Dr. Iran Malavazi

São Carlos
2023
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................................3
2. OBJETIVOS..........................................................................................................................4
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................4
3.1 Materiais........................................................................................................................ 4
3.2 Métodos.......................................................................................................................... 5
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES.........................................................................................6
5. CONCLUSÃO....................................................................................................................... 7
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................8

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1. INTRODUÇÃO
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), é uma técnica revolucionária na área da
biologia molecular, desenvolvida por Kary Mullis na década de 1980. Essa técnica,
relativamente simples, permite a amplificação exponencial de sequências específicas de DNA
ou de RNA previamente convertido em cDNA, tornando possível a análise de grande
quantidade de fragmentos genéticos.
Comparada aos métodos convencionais de clonagem e amplificação de DNA, que
muitas vezes podem levar dias para serem concluídos, a PCR se destaca por sua velocidade,
fornecendo resultados a partir de algumas horas. Esta técnica é altamente sensível, realiza a
detecção e amplificação de sequências específicas em quantidades mínimas de material
genético.
Para iniciar uma reação de PCR, é necessário reunir alguns componentes essenciais
além da amostra de DNA molde que se pretende amplificar. É necessário uma solução tampão
e cloreto de magnésio (MgCl2), para manter o pH e a concentração de sais da reação. Além
disso, se utiliza uma enzima que realiza a síntese de uma nova fita complementar de DNA,
chamada Taq DNA polimerase, para este processo são essenciais os nucleotídeos (dNTPs),
que são as unidades utilizadas pela DNA polimerase no processo de síntese. Por fim, os
iniciadores (primers), desempenham um papel fundamental, umas vez que são pequenos
fragmentos de DNA de fita simples, projetados de forma complementar e específica a região
do fragmento alvo de DNA que se deseja amplificar na reação de PCR (OLIVEIRA, 2007).
O DNA é sintetizado pela Taq DNA polimerase apenas quando os primers são
fornecidos, pois marcam o início da síntese. Em uma reação de PCR, os primers são
projetados especificamente para se ligarem à região de interesse do DNA que se deseja
amplificar. Geralmente, dois primers de cerca de 20 nucleotídeos de comprimento são usados,
projetados para serem complementares às sequências nas extremidades da região de interesse
no DNA molde. Esses primers se ligam ao DNA por pareamento de bases complementares, e
a Taq DNA polimerase estende esses primers, iniciando a síntese de uma nova fita
complementar de DNA. Isso resulta na amplificação da região de interesse que está localizada
entre os primers, permitindo a replicação seletiva de segmentos específicos do DNA (BEJ,
2004).
A técnica de PCR é composta por três etapas (desnaturação, anelamento e extensão),
etapas que constituem um único ciclo de amplificação. O número de ciclos é controlado por

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um termociclador que automatiza o processo. Cada ciclo dobra a quantidade de DNA alvo, e
após vários ciclos a quantidade de DNA amplificado aumenta exponencialmente.
Um ciclo de amplificação da PCR inicia-se com a etapa de desnaturação, na qual a
amostra de DNA é aquecida a 94-95 °c; altas temperaturas causam a separação das duplas
fitas de DNA, as tornando de fita simples. Após a primeira etapa, se inicia o anelamento, a
temperatura é reduzida para 50-65 °c, permitindo a ligação dos primers as fitas simples de
DNA para marcar a região alvo. Na última etapa, chamada de extensão, ocorre a síntese de
uma nova fita de cDNA, a fim de permitir este processo a temperatura é elevada a 72 °C para
ativar a DNA polimerase, que é responsável por adicionar as bases complementares formando
a nova fita de DNA, e finalizando um ciclo de amplificação com a duplicação da fita de DNA
(OLIVEIRA, 2007).

2. OBJETIVOS
A partir desse experimento objetiva-se entender, de forma prática, os conceitos
fundamentais de funcionamento da PCR, bem como os componentes necessários para que ela
ocorra e as etapas envolvidas no processo. Além de aprender sobre o preparo da amostra que
será amplificada, utilizando as concentrações corretas dos reagentes.
Ademais, o esperado é a obtenção de uma PCR de qualidade, ou seja, que tenha
amplificado a amostra de forma exponencial durante todos os ciclos. Possibilitando a análise
do resultado após passar pelo processo de eletroforese.

3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
- pipetas (2 μL, 10 μL, 100 μL e 1000 μL)
- tubos de 0,2 mL
- tubos de 1,5 mL
- Iniciadores de cadeia direto (anela na extremidade 5’ do molde) (10 pmol/μl)
- Iniciadores de cadeia inverso (anela na extremidade 3' do molde) (10 pmol/μl)
- DNA-molde (Plasmídeo contendo o cDNA que codifica o gene Orizacistatina)
- dNTPs (desoxirribonucleotídeos): dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (1,25 mM)
- Tampão da Taq DNA-polimerase (10X)
- Cloreto de Magnésio (50 mM)
- Taq DNA-polimerase (1 U/μl)
- água milli-Q autoclavada
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 - termociclador
- centrífuga
- incubadora
- kit para purificação de fragmentos de DNA do produto de PCR: coluna de purificação,
Clean Up Solution, Wash Solution, Buffer Solution
- cuba para eletroforese
- erlenmeyer
- agarose
- TAE 1X
- brometo de etídio
- microondas
- tampão de amostra (loading)
- ladder

3.2 Métodos
Inicialmente, foram montadas duas reações para o procedimento de PCR. A primeira,
identificada como “1”, foi montada em um tubo de 0,2 mL com 1,0 μL de DNA molde (10
ng/μl), 2,0 μL de cada Iniciador, F 5' e R 3’, ambos a (10 pmol/μl), 5,0 μL de Tampão da Taq
DNA-polimerase (10X), 8,0 μL de dNTP's (1,25 mM), 0,5 μL de Taq DNA-polimerase (5
U/μl), 1,5 μL de cloreto de magnésio (50 mM) e 30 μL de água milli-Q. Cada reagente foi
pipetado com a pipeta que melhor se adequou ao seu volume. Para a segunda reação,
identificada com “2”, o mesmo processo foi realizado, entretanto, não utilizou-se o DNA
molde, e adicionou-se 1 μL de água esterilizada para substituí-lo, de modo a ter-se uma reação
de controle negativo.
Em seguida, as reações foram colocadas em um termociclador para a realização da
PCR, seguindo o seguinte ciclo: 94°c por 4 minutos (desnaturação), 35 ciclos a 94°c por 1
minuto (desnaturação), 47°c por 50 segundos (anelamento), 72°c por 1 minuto (extensão) e
uma elongação final a 72° c por 10 minutos.
Dadas as etapas para realização da PCR, seu produto foi então purificado, a fim de se
obter somente os fragmentos de DNA amplificados. Desta forma, o produto de PCR foi
transferido para um tubo de 1,5 mL, em que adicionou-se também 150 μL de Clean up
solution, vertendo o tudo duas vezes. Com isto, montou-se uma coluna de purificação sobre
um novo tubo de 1,5 mL, e transferiu-se o conteúdo da solução feita na etapa anterior para o
centro desta coluna. Após 4 minutos de espera com o tubo à temperatura ambiente, este foi
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centrifugado a 5000 g por 2 minutos. O “flowthrough”, ou seja, conteúdo que passou pela
coluna, foi descartado, e a coluna foi novamente montada sobre o tubo de 1,5 mL.
Assim, segue-se para as etapas de lavagem, em que são adicionados 500 μL de Wash
Solution sobre a coluna e o tubo é centrifugado a 8000 g por 2 minutos; o flowthrough é
descartado e uma segunda lavagem é realizada, repetindo-se os passos exatamente como na
primeira. Após, uma nova centrifugação é realizada a 8000 g por mais 1 minuto, para a
retirada do excesso de solução.
Por fim, a coluna é transferida para um novo tubo de 1,5 mL, em que adiciona-se
também 50 μL de Buffer Solution ao centro da coluna. Realiza-se uma incubação a 50°C por
4 minutos, seguida de uma centrifugação a 10.000 g por 2 minutos. Após estes processos, o
DNA está finalmente purificado e já pode ser coletado ou armazenado.
Para conferir a integridade e pureza do DNA purificado, realizou-se ao final do
procedimento de eletroforese, com uma corrida da amostra em um gel de agarose. Para isto,
uma integrante do grupo ficou responsável por auxiliar na montagem do gel. Mediu-se 0,3 g
de agarose em um Erlenmeyer, e adicionou-se também 30 mL de TAE 1X. Esta mistura foi
levada ao microondas com intervalos de tempo curtos, entre 10 e 30 segundos, até que a
solução se dissolvesse e ficasse transparente. Após seu resfriamento, adicionou-se 1 μL de
brometo de etídeo, misturou-se, e verteu-se a solução na cuba de eletroforese, com o
posicionamento correto dos pentes para a formação dos poços de aplicação das amostras.
Após a polimerização do gel, preencheu-se a cuba com TAE 1X e os pentes foram
retirados. No primeiro poço do gel, adicionou-se o ladder, um marcador de peso molecular.
Cada grupo ficou responsável por aplicar sua amostra purificada no gel, uma vez que a
eletroforese de todos os grupos ocorreu simultaneamente no mesmo gel, sendo que o Grupo 4
aplicou sua amostra no segundo poço após o ladder. Para isto, esta amostra foi preparada com
12 μL do DNA purificado acrescido de 2 μL do tampão de amostra (6X), de modo que 14 μL
da mistura foram aplicados no gel com o auxílio de uma pipeta.
Ao final, a tampa da cuba foi fechada e os condutores elétricos foram conectados à
fonte da eletroforese na ordem correta. A voltagem utilizada foi de 100 volts, e a corrida
ocorreu por cerca de 30 minutos. O resultado foi observado em um transiluminador.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Como descrito anteriormente, foi utilizado gel de agarose para verificar a integridade e
a pureza do DNA purificado. No entanto, dado tempo limitado de aula, foi utilizada outra
amostra, previamente amplificada pela professora, ao invés da amostra que foi preparada no
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dia. Após a aplicação da amostra no gel, foi realizada a análise por eletroforese em gel, cujo
resultado pode ser observado abaixo:

Imagem 1. Resultado da PCR em eletroforese em gel de agarose. Fonte: autoria própria.

O mesmo gel foi utilizado por todos os grupos, sendo o segundo poço, como
destacado na imagem, o poço no qual o grupo aplicou a amostra. Foi utilizado um marcador
molecular para a quantificação de pares de bases, porém, por escassez de informações acerca
da amplitude de peso molecular do marcador utilizado, não foi possível estimar a quantidade
de pares de bases presentes na amostra purificada.
Ainda, é possível verificar que as amostras apresentam elevada pureza, com bandas
bem definidas, com ausência de demais bandas e sem efeito de arraste, demonstrando que não
houve contaminação externa.

5. CONCLUSÃO
O experimento realizado durante a aula possibilitou a obtenção de conhecimentos
práticos de extrema importância, como o preparo da amostra para o processo de PCR, a
concentração dos reagentes envolvidos e o tempo e temperatura recomendadas para cada
etapa. Além disso, ainda foi possível aprender sobre o preparo do gel de agarose, meio
utilizado para a atividade da eletroforese. Por fim, as amostras obtidas foram satisfatórias,
permitindo que houvesse uma análise referente à qualidade do processo de PCR
desenvolvido.

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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BEJ, A.K. Detection of microbial nucleics acids by polimerase chain reaction in aquatic samples.
Second Edition . In: Molecular Ecology Manual, 2004. p. 369-432.

OLIVEIRA, Márcia Cristina de Sena et al. Fundamentos teóricos-práticos e protocolos de extração

e de amplificação de DNA por meio de reação em cadeia da polimerase. São Carlos: Embrapa
Pecuária Sudeste, 2007. 43 p.